BR112021000060A2 - Derivados de 1,3,5-tris(6-metilpiridin-2-iloxi)benzeno e compostos relacionados como ligantes nlrx1 para tratar doenças inflamatórias - Google Patents

Derivados de 1,3,5-tris(6-metilpiridin-2-iloxi)benzeno e compostos relacionados como ligantes nlrx1 para tratar doenças inflamatórias Download PDF

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Abstract

derivados de 1,3,5-tris(6- metilpiridin-2-iloxi)benzeno e compostos relacionados como ligantes nlrx1 para tratar doenças inflamatórias. são fornecidos derivados de 1,3,5-tris(6-metilpiridin-2-iloxi)benzeno e compostos relacionados que têm como alvo o domínio de oligomerização de ligação a nucleotídeos, a via de repetição rica em leucina contendo x1 (nlrx1). os compostos podem ser usados para tratar várias condições, incluindo doenças gastrointestinais inflamatórias, imunomediadas e/ou inflamatórias crônicas; doenças imunomediadas sistêmicas; cânceres; e doenças infecciosas.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO PARA A PATENTE DE INVENÇÃO: “DERIVADOS DE 1,3,5-TRIS(6-METILPIRIDIN-2-ILOXI)BENZENO E COMPOSTOS RELACIONADOS COMO LIGANTES NLRX1 PARA TRATAR DOENÇAS INFLAMATÓRIAS”
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a ligantes de NLRX1 e suas utilizações, tais como no tratamento e prevenção de cânceres; nas doenças infecciosas de origem bacteriana, fúngica e viral; nas doenças gastrointestinais inflamatórias, imunomediadas ou crônicas, como nas doenças inflamatórias intestinais e nas doenças sistêmicas imunomediadas.
ANTECEDENTES
[002] Domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeo, repetição rica em leucina contendo X1 (NLRX1) (também chamado de "receptor semelhante a NOD X1" ou "membro da família NLR X1" ou "NOD9") é uma proteína da via de sinalização que é expressa em células imunes, trato gastrointestinal e pele, pulmão, músculo, tecido endócrino e tecidos reprodutivos [1]. A molécula NLRX1 tem três domínios distintos e localiza-se na mitocôndria [2]. Os resultados publicados indicam que a perda de NLRX1 piora a gravidade da doença e altera o metabolismo das células imunológicas
[3] em modelos de doença inflamatória intestinal [4-6]. A proteína NLRX1 também foi implicada em modelos de respostas virais [7-14], infecção bacteriana [15], infecção fúngica [16], câncer [17-21], esteatose hepática [22, 23], diabetes tipo 2 [24], lesão cerebral [25], isquemia do miocárdio [26], doença pulmonar obstrutiva crônica [27] e encefalomielite autoimune [28].
[003] Existem claras necessidades clínicas não atendidas para tratamentos seguros e eficazes para doenças nas quais o NLRX1 está implicado. Essas doenças incluem doenças autoimunes, doenças gastrointestinais crônicas e inflamatórias, como doenças inflamatórias intestinais, cânceres e doenças infecciosas. Devido à baixa eficácia e pouca segurança, os tratamentos autoimunes atuais requerem monitoramento frequente, mudança de paradigmas de tratamento e métodos de administração complexos. Assim, são necessários novos tratamentos que possam ser administrados por via oral para o manejo de longo prazo da doença. Em doenças infecciosas, as altas taxas de mutação em vários micróbios exigem o desenvolvimento de novos tratamentos não antimicrobianos que não afetem o uso de antibacterianos, antifúngicos e antivirais. Além disso, novas cepas e infecções epidêmicas criam um período de latência entre o surgimento de um patógeno e a disponibilidade de intervenções específicas para micróbios, criando uma necessidade de novas terapêuticas direcionadas ao hospedeiro. Dada a epidemia de doenças infecciosas e autoimunes como um todo, a via do NLRX1 tem o potencial de impactar significativamente milhões de pacientes.
[004] Os ácidos nucléicos virais [29] e os lipídios da dieta foram identificados como ligantes naturais de NLRX1 [5]. Há uma necessidade de desenvolver novos ligantes da via NLRX1 para permitir que os tratamentos sejam adaptados especificamente para doenças individuais e para maximizar potencialmente sua eficácia.
[005] A presente invenção fornece compostos que se ligam à proteína NLRX1 e, assim, induzem uma resposta benéfica em várias condições de doença, incluindo, mas não se limitando a doenças gastrointestinais inflamatórias, imunomediadas ou crônicas, como doenças inflamatórias intestinais; doenças imunomediadas sistêmicas; cânceres; e doenças infecciosas de origem bacteriana, fúngica e viral.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A invenção fornece compostos de fórmula Z tendo um anel A, um anel B, um anel C e um anel D, ou um sal dos mesmos, em que: Z é:
A D B C X em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em N e CR6; Y em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em NR6, O, S, C(R6)2 e CR7; A1, A2, A3, A4 e A5 em cada caso são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em N e C; R1, R2, R3, R4, R5 e R6, quando presentes, são em cada caso selecionados independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, hidroxi, acetila, halogênio e carboxila; uma porção química substituída ou não substituída selecionada a partir do grupo que consiste em amino, alquila, alcoxi, carboxialquila, acila, acilamino arila, arilalquila, heteroalquila, heteroalcoxi, heterocarboxialquila, heteroacila, heteroacilamino, heteroarila e heteroarilalquila; e qualquer combinação dos anteriores, com a condição de que qualquer um de R1, R2, R3, R4 e/ou R5 em um dado anel está ausente quando A1, A2, A3, A4 e/ou A5 no dado anel, respectivamente, é N; e R7 em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em =O, =S e =NR6.
[007] Os compostos de fórmula Z aqui fornecidos são ligantes de NLRX1.
[008] Os compostos exemplares da invenção são mostrados nas Figuras 1A-1T.
[009] A invenção também fornece métodos de tratamento de uma afecção em um animal com um composto como aqui descrito. Os métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz do composto ao animal. A condição pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma doença gastrointestinal inflamatória, imunomediada ou crônica; uma doença imunomediada sistêmica; câncer; e uma doença infecciosa. Em algumas versões, em que a afecção compreende doença inflamatória intestinal. Em algumas versões, a doença inflamatória intestinal compreende colite ulcerosa. Em algumas versões, a doença inflamatória intestinal compreende a doença de Crohn. Em algumas versões, a condição compreende a síndrome do intestino irritável. Em algumas versões, a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes tipo 1 e psoríase. Em algumas versões, a condição inclui diabetes tipo 1. Em algumas versões, a condição compreende câncer colorretal. Em algumas versões, a condição compreende uma infecção selecionada do grupo que consiste em uma infecção viral e uma infecção bacteriana. Em algumas versões, a condição inclui infecção por influenza. Em algumas versões, a condição inclui infecção por Clostridium difficile.
[0010] Os objetivos e vantagens da presente invenção ficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir da modalidade preferencial da invenção feita em combinação com os desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0011] Figuras 1A a 1T. Compostos exemplares da invenção: NX-5 (Figura 1A), NX-8 (Figura 1B), NX-9 (Figura 1C), NX-10 (Figura 1D), NX-13 (Figura 1E); NX-35 (Figura 1F); NX-37 (Figura 1G); NX-38 (Figura 1H); NX-41 (Figura 1I); NX-43 (Figura 1J); NX-44 (Figura 1K); NX-45 (Figura 1L); NX-46 (Figura 1M); NX-48 (Figura 1N); NX- 49 (Figura 1O); NX-50 (Figura 1P); NX-53 (Figura 1Q); NX-54 (Figura 1R); NX-55 (Figura 1S); e NX-56 (Figura 1T).
[0012] Figuras 2A a 2E. Predição computacional da ligação de compostos selecionados a NLRX1 em kcal/mol.
[0013] Figura 3. Validação experimental da ligação de NLRX1 por compostos selecionados com ressonância plasmônica de superfície (SPR). Os resultados apresentados são constantes de dissociação em estado estacionário (KD) calculadas a partir do ajuste do modelo de ligação 1:1 em micromolar.
[0014] Figuras 4A e 4B. Validação imunológica da atividade NX-13 em esplenócitos CD4+. As porcentagens de IFNγ+ (Figura 4A) e TNFα+ (Figura 4B) células T CD4+ foram medidas por citometria de fluxo após o tratamento in vitro de células com NX-13 em concentrações de 0,1, 1 e 10 micromolar. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0015] Figuras 5A a 5D. Validação imunológica da atividade de NX-45 e NX-50 em esplenócitos CD4+. As porcentagens de células T CD4+ que expressam IFNγ+ (Figuras 5A e 5C) e TNFα+ (Figura 5B e 5D) foram medidas por citometria de fluxo após tratamento in vitro de células com NX-45 (Figuras 5A e 5B) ou NX-50 (Figuras 5C e 5D) em concentrações de 10, 50 e 100 nanomolar (NX-45) ou 0,1, 1 e 10 micromolar (NX-50). A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0016] Figuras 6A a 6J. Validação imunológica da atividade de NX-37, NX-43, NX- 44 e NX-53, NX-54, NX-55 e NX-56 em esplenócitos CD4+. As porcentagens de células T CD4+ que expressam FNγ+ (Figuras 6A, 6C, 6E, 6G, 6H, 6I e 6J) e TNFα+ (Figuras 6B, 6D e 6F) foram medidas por citometria de fluxo após tratamento in vitro de células com NX-37 (Figuras 6A e 6B), NX-43 (Figuras 6C e 6D), NX-44 (Figuras 6E e 6F), NX-53 (Figura 6G), NX-54 (Figura 6H), NX-55 (Figura 6I) ou NX-56 (Figura 6J) em concentrações de 0,1, 1 e 10 micromolar. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0017] Figuras 7A a 7C. Validação in vivo da eficácia do NX-13 em um modelo DSS de colite. Pontuações de atividade da doença ao longo de 7 dias de desafio DSS (Figura 7A) e medidas de citometria de fluxo de populações de neutrófilos (Figura 7B) e Th1 (Figura 7C) dentro da lâmina própria do cólon no dia 7 de camundongos tratados com veículo ou NX-13 diariamente por gavagem oral. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0018] Figuras 8A a 8D. Expressão do gene colônico após o tratamento com NX-
13. Medição de Ifng (Figura 8A), Il10 (Figura 8B), Tnf (Figura 8C) e Il17 (Figura 8D) por PCR quantitativa em tempo real de RNA de cólon total de camundongos desafiados com DSS por 7 dias e tratados com veículo ou NX-13 diariamente por gavagem oral. Os dados são normalizados para beta-actina. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0019] Figura 9. Validação in vivo da eficácia do NX-13 em um modelo MDR1a-/- de colite. Pontuações de atividade da doença semanalmente ao longo do período de tratamento de seis semanas em que MDR1a-/- foram tratados com veículo ou NX-13 diariamente por gavagem oral. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0020] Figuras 10A e 10B. Fotomicrografias representativas de seções colônicas coradas com H&E de camundongos MDR1a-/- após seis semanas de tratamento com veículo (Figura 10A) ou NX-13 (Figura 10B).
[0021] Figuras 11A a 11C. Citometria de fluxo da lâmina própria do cólon de camundongos MDR1a-/- após seis semanas de tratamento com veículo ou NX-13 para detectar populações celulares Th1 (Figura 11A), neutrófilos (Figura 11B) e Treg (Figura 11C). A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0022] Figuras 12A e 12B. Validação translacional ex vivo da eficácia do NX-13 em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com colite ulcerosa. Detecção por citometria de fluxo de células TNFα+ (Figura 12A) e IFNγ+ (Figura 12B) após tratamento ex vivo com 1, 10, 50 e 100 nM de NX-13, apresentado como porcentagem de células CD45+. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0023] Figuras 13A a 13D. Validação translacional ex vivo da eficácia do NX-13 em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com doença de Crohn. Detecção de citometria de fluxo de células TNFα+ (Figura 13A), IL4+ (Figura 13B), IL10+ (Figura 13C) e IFNγ+ (Figura 13D) após tratamento ex vivo com 1, 10, 50 e 100 nM de NX-13, apresentado como porcentagem de células CD45+. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0024] Figuras 14A e 14B. Eficácia de NX-43 em um modelo de tumor sólido injetado com CT26. Tamanho do tumor por diâmetro (Figura 14A) e massa (Figura 14B) após o tratamento com NX-43 (40 mg/kg) começando 9 dias após a injeção de células CT26. A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
[0025] Figuras 15A e 15B. Eficácia do NX-43 em um modelo APCmin/+ de câncer colorretal. Número de pólipos do cólon (Figura 15A) e peso do cólon (Figura 15B) após quatro semanas de tratamento com NX-43 (40 mg/kg, oral). A significância estatística (p <0,05) é marcada por asteriscos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES GERAIS
[0026] A menos que indicado de outra forma, as seguintes definições são usadas em todo o presente pedido:
[0027] Análise de Variância (ANOVA): Processo aritmético para particionar a variação geral nos conjuntos de dados em componentes específicos com base nas fontes de variação. Foi usado para determinar se as diferenças numéricas entre os grupos de tratamento são estatisticamente significativas.
[0028] Dieno conjugado: Uma molécula contendo duas ligações duplas separadas por uma ligação simples.
[0029] Enantiômero: Isômero óptico; classificação química de moléculas com base em sua capacidade de girar o plano de polarização no sentido horário (+) ou anti- horário (−).
[0030] Substancialmente puro: tendo uma pureza de pelo menos 90% em peso, de preferência pelo menos 95% em peso, tal como pelo menos 98%, 99% ou cerca de 100% em peso.
[0031] DII: doença inflamatória intestinal (DII) envolve inflamação crônica de todo ou parte do trato digestivo. A DII inclui principalmente a colite ulcerosa e a doença de Crohn. Ambos geralmente envolvem diarreia intensa, dor, fadiga e perda de peso. A DII pode ser debilitante e às vezes leva a complicações com risco de vida.
[0032] Colite ulcerativa (UC): UC é uma DII que causa inflamação de longa duração e feridas (úlceras) no revestimento interno do intestino grosso (cólon) e reto.
[0033] Doença de Crohn: a doença de Crohn é uma DII que causa inflamação do revestimento do trato digestivo. Na doença de Crohn, a inflamação geralmente se espalha profundamente nos tecidos afetados. A inflamação pode envolver diferentes áreas do trato digestivo - intestino grosso, intestino delgado ou ambos.
[0034] IL-10: a interleucina-10 (IL-10), também conhecida como fator inibidor da síntese de citocinas humanas (CSIF), é uma citocina antiinflamatória. Em humanos, a IL-10 é codificada pelo gene IL10.
[0035] FOXP3: FOXP3 (forkhead box P3), também conhecido como scurfin, é uma proteína envolvida nas respostas do sistema imunológico. Um membro da família de proteínas FOX, FOXP3 parece funcionar como um regulador mestre (fator de transcrição) no desenvolvimento e função de células T reguladoras.
[0036] TNF-alfa: O fator de necrose tumoral (TNF, cachexina ou caquectina e anteriormente conhecido como fator de necrose tumoral alfa ou TNFα) é uma citocina envolvida na inflamação sistêmica e é membro de um grupo de citocinas que estimulam a reação de fase aguda.
[0037] MCP1: Proteína-1 quimioatraente de monócitos. Um termo mais antigo para uma citocina CC que é crítica para o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas, encontrada em células endoteliais, macrófagos e células do músculo liso vascular de pacientes submetidos a procedimentos de revascularização do miocárdio. O termo oficialmente preferencial agora é o ligante 2 de quimiocina (motivo CC).
[0038] Interferon gama: o interferon gama é uma citocina pró-inflamatória dimerizada solúvel que é o único membro da classe de interferons tipo II.
[0039] Infiltração leucocitária: a infiltração leucocitária se refere ao processo de movimentação ou infiltração dos leucócitos no tecido lesado para iniciar o processo de reparo.
DEFINIÇÕES QUÍMICAS
[0040] O termo "alquila", por si só ou como parte de outro substituinte, significa, a menos que indicado de outra forma, uma cadeia totalmente saturada, linear,
ramificada ou radical de hidrocarboneto cíclico, ou uma combinação dos mesmos, e pode incluir radicais di e multivalentes, tendo o número de átomos de carbono designado (por exemplo, C-C10 significa de um a dez átomos de carbono, inclusive). Os exemplos de grupos alquila incluem, sem limitação, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, sec-butila, ciclo-hexila, (ciclo-hexil)etila, ciclopropilmetila e homólogos e isômeros dos mesmos, por exemplo, n-pentila, n- hexila, n-heptila, n-octila e semelhantes. O termo "alquila", a menos que indicado de outra forma, inclui cicloalquila.
[0041] O termo "alquenila" significa um grupo alquila conforme definido acima, exceto por conter uma ou mais ligações duplas. Os exemplos de grupos alquenila incluem vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienil), 2,4-pentadienila, 3- (1,4-pentadienil), etc., e homólogos e isômeros superiores.
[0042] O termo "alquinila" significa um grupo alquila ou alquenila, conforme definido acima, exceto por conter uma ou mais ligações triplas. Os exemplos de grupos alquinila incluem etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila e semelhantes, incluindo homólogos e isômeros superiores.
[0043] Os termos "alquileno", "alquenileno" e "alquinileno", isoladamente ou como parte de outro substituinte, significa um radical divalente derivado de um grupo alquila, alquenila ou alquinila, respectivamente, conforme exemplificado por — CH2CH2CH2CH2—.
[0044] Tipicamente, os grupos alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno e alquinileno terão de 1 a 24 átomos de carbono. Os grupos que têm 10 ou menos átomos de carbono são preferenciais na presente invenção. O termo "inferior" quando aplicado a qualquer um desses grupos, como em “alquila inferior" ou "alquileno inferior", designa um grupo que tem 10 ou menos átomos de carbono. Os exemplos de alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno e alquinileno incluem C1-C10, C1- C8, ou C1-C6 alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno e alquinileno.
[0045] O termo "acil" é um radical de fórmula geral —C(O)R, onde R é um grupo alquila.
[0046] O termo "alcoxi" é um grupo alquila singularmente ligado ao oxigênio: –O– R, em que R é um grupo alquila. Os exemplos incluem metoxi, etoxi, etc.
[0047] O termo "arila" é usado aqui para se referir a um grupo aromático, que pode ser um único anel aromático ou vários anéis aromáticos que são fundidos, ligados covalentemente ou ligados a um grupo comum, como uma porção química diazo, metileno ou etileno. O grupo de ligação comum também pode ser uma carbonila como na benzofenona. O anel aromático (ou anéis aromáticos) pode incluir, por exemplo, fenila, naftila, bifenila, difenilmetila e benzofenona, entre outros. O termo "arila" abrange "arilalquila" e "arila substituída". Para grupos fenila, o anel arila pode ser mono, di, tri, tetra ou penta-substituído. Os anéis maiores podem não ser substituídos ou portar um ou mais substituintes.
[0048] O termo "arilalquila" é usado neste documento para se referir a um grupo que compreende um grupo arila e um alquila.
[0049] O termo "carboxialquila" é aqui utilizado para se referir a um grupo que compreende um grupo alquila e um grupo carboxila (por exemplo, -C(O)O(C1 a C6) alquila).
[0050] O termo "halogênio" ou "halo" é usado aqui para se referir a átomos de flúor, bromo, cloro e iodo.
[0051] O termo "hetero" anexado ao nome de qualquer fração aqui descrito refere- se a um grupo no qual um átomo de não carbono substitui um átomo de carbono na porção química. Qualquer porção química aqui descrita pode ser fornecida na forma hetero. Heteroátomos exemplificativos incluem nitrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo, cloro, bromo e iodo, entre outros.
[0052] O termo "hidróxi" é usado aqui para se referir ao grupo —OH.
[0053] O termo "amino" é usado para designar NRR’, em que R e R’ são, independentemente, H, alquila, alquenila, alquinila, arila ou análogos substituídos dos mesmos. "Amino" abrange "alquilamino" e "dialquilamino", denotando aminas secundárias e terciárias. Cada grupo alquila no dialquilamino pode ser selecionado independentemente. Os grupos amino em que R e R′ são H são referidos como grupos
"amino não substituídos". Grupos amino em que R e R′ são uma fração diferente de H são referidos como grupos "amino substituídos".
[0054] O termo "acilamino" é usado neste documento para descrever o grupo RC(O)NR′-, em que R é um grupo acil e R′ é independentemente H, alquila, alquenila, alquinila, arila ou seus análogos substituídos.
[0055] "Substituído" se refere a um grupo químico como aqui descrito que inclui adicionalmente um ou mais substituintes, como alquila inferior, arila, acila, halogênio (por exemplo, alquil-halo como CF3), hidróxi, amino, alcóxi, alquilamino, acilamino, tioamido, acilóxi, arilóxi, ariloxialquila, mercapto, tia, aza, oxo, hidrocarbonetos cíclicos saturados e insaturados, heterociclos e similares. Estes grupos podem estar ligados a qualquer carbono ou substituinte das porções químicas alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno e alquinileno.
[0056] Para porções químicas ácidas, como ácidos carboxílicos, a denominação do próprio ácido abrange explicitamente o ácido, sua base conjugada e seus sais e ésteres.
[0057] Para porções químicas básicas, como grupos amino, a nomenclatura da própria base abrange explicitamente a base, seu ácido conjugado, bem como seus sais e versões quaternizadas.
[0058] Estruturas processadas sem estereoquímica indicada incluem todos os seus estereoisômeros, em qualquer razão (isto é, enantiômeros e diasteriômeros, suas misturas racêmicas ou qualquer mistura em qualquer excesso enantiomérico/diasteriomérico).
[0059] Um "sal" é qualquer sal de adição de ácido ou base. Os sais aqui descritos são preferencialmente sais farmaceuticamente adequados. Um "sal farmaceuticamente adequado" é qualquer sal de adição de ácido ou base cujos contra-íons não são tóxicos para um paciente (incluindo um paciente veterinário) em doses farmacêuticas dos sais, de modo que os efeitos farmacológicos benéficos inerentes à base livre ou livre os ácidos não são agravados por efeitos colaterais atribuíveis aos contra-íons. Uma série de sais farmaceuticamente adequados é bem conhecida na técnica. Para ingredientes ativos básicos, todos os sais de adição de ácido são úteis como fontes da forma de base livre, mesmo se o sal particular, por si só, for desejado apenas como um produto intermediário, por exemplo, quando o sal é formado apenas para fins de purificação ou identificação, ou quando é usado como intermediário na preparação de um sal farmaceuticamente adequado por procedimentos de troca iônica. Os sais farmaceuticamente adequados incluem, sem limitação, aqueles derivados de ácidos minerais e ácidos orgânicos, incluindo explicitamente hidrohaletos, por exemplo, cloridratos e bromidratos, sulfatos, fosfatos, nitratos, sulfamatos, acetatos, citratos, lactatos, tartaratos, malonatos, oxalatos, salicilatos, propionatos, succinatos, fumaratos, maleatos, bis-b-hidroxinaftoatos de metileno, gentisatos, isetionatos, di-p-toluoiltartratos, metanossulfonatos, etanossulfonatos, benzenossulfonatos, p-toluenossulfonatos, ciclo-hexilsulfonatos, quinatos e semelhantes. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de bases de metais alcalinos ou alcalino-terrosos ou bases orgânicas convencionais, tais como trietilamina, piridina, piperidina, morfolina, N-metilmorfolina e semelhantes. Os termos "farmaceuticamente aceitável" e "farmaceuticamente adequado" são usados de forma intercambiável neste documento.
[0060] Qualquer referência a um "composto" neste documento ou a uma estrutura de composto definida neste documento abrange as formas salinas e não salinas, a menos que explicitamente indicada ao contrário.
COMPOSTOS
[0061] Os compostos da invenção incluem compostos de fórmula Z tendo um anel A, um anel B, um anel C e um anel D, ou um sal dos mesmos, em que: Z é:
A D B C X em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em N e CR6; Y em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em NR6, O, S, C(R6)2 e CR7; A1, A2, A3, A4 e A5 em cada caso são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em N e C; R1, R2, R3, R4, R5 e R6, quando presentes, são em cada caso selecionados independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, hidroxi, acetila, halogênio e carboxila; uma porção química substituída ou não substituída selecionada a partir do grupo que consiste em amino, alquila, alcoxi, carboxialquila, acila, acilamino arila, arilalquila, heteroalquila, heteroalcoxi, heterocarboxialquila, heteroacila, heteroacilamino, heteroarila e heteroarilalquila; e qualquer combinação dos anteriores, com a condição de que qualquer um de R1, R2, R3, R4 e/ou R5 em um dado anel está ausente quando A1, A2, A3, A4 e/ou A5 no dado anel, respectivamente, é N; e R7 em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em =O, =S e =NR6.
[0062] Em algumas versões, pelo menos um X no anel D é CR6. Em algumas versões, pelo menos dois dos Xs no anel D são CR6. Em algumas versões, cada X no anel D é CR6.
[0063] Em algumas versões, pelo menos um X no anel D é N. Em algumas versões, pelo menos dois dos Xs no anel D são N. Em algumas versões, cada X no anel D é N.
[0064] Em algumas versões, pelo menos um X no anel D é CR6 e pelo menos um X no anel D é N. Em algumas versões, dois dos Xs no anel D são CR6 e um X no anel D é N. Em algumas versões, um X no anel D é CR6 e dois dos Xs no anel D são N.
[0065] Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A é NR6. Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A e o Y que conecta o anel D e o anel B são NR6. Em algumas versões, cada Y é NR6.
[0066] Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A é O. Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A e o Y que conecta o anel D e o anel B são O. Em algumas versões, cada Y é O.
[0067] Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A é S. Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A e o Y que conecta o anel D e o anel B são cada um S. Em algumas versões, cada Y é S.
[0068] Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A é C(R6)2. Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A e o Y que conecta o anel D e o anel B são, cada um, C(R6)2. Em algumas versões, cada Y é C(R6)2.
[0069] Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A é CR7. Em algumas versões, o Y que conecta o anel D e o anel A e o Y que conecta o anel D e o anel B são cada um CR7. Em algumas versões, cada Y é CR7.
[0070] Em algumas versões, pelo menos um de A1, A2, A3, A4, e A5 no anel A é C. Em algumas versões, pelo menos um de A1, A2, A3, A4, e A5 no anel A é N. Em algumas versões, pelo menos um de A1, A2, A3, A4, e A5 no anel A é C, e pelo menos um de A1, A2, A3, A4, e A5 no anel A é N.
[0071] Em algumas versões, A1 no anel A é N. Em algumas versões, A2 no anel A é N. Em algumas versões, A3 no anel A é N. Em algumas versões, A4 no anel A é N. Em algumas versões, A5 no anel A é N. Em algumas versões, A1 e A5 no anel A são N.
[0072] Em algumas versões, A1 no anel A é N, e A2, A3, A4 e A5 no anel A são C.
Em algumas versões, A2 no anel A é N e A1, A3, A4 e A5 no anel A são C. Em algumas versões, A3 no anel A é N, e A1, A2, A4 e A5 no anel A são C. Em algumas versões, A4 no anel A é N, e A1, A2, A3 e A5 no anel A são C. Em algumas versões, A5 no anel A é N e A1, A2, A3 e A4 no anel A são C. Em algumas versões, A1 e A5 no anel A são N e A2, A3 e A4 no anel A são C.
[0073] Em algumas versões, A1 em cada um dos anéis A e B é N. Em algumas versões, A2 em cada um dos anéis A e B é N. Em algumas versões, A3 em cada um dos anéis A e B anel é N. Em algumas versões, A4 em cada um do anel A e o anel B é N. Em algumas versões, A5 em cada um dos anéis A e o anel B é N. Em algumas versões, A1 e A5 em cada um o anel A e o anel B são N.
[0074] Em algumas versões, A1 em cada um dos anéis A e B é N, e A2, A3, A4 e A5 em cada um dos anéis A e B são C. Em algumas versões, A2 em cada um dos anéis A e o anel B é N, e A1, A3, A4 e A5 em cada um dos anéis A e B são C. Em algumas versões, A3 em cada um dos anel A e o anel B são N, e A1, A2, A4 e A5 em cada um dos anéis A e B são C. Em algumas versões, A4 em cada um dos anéis A e B anel é N, e A1, A2, A3 e A5 em cada um dos anéis A e o anel B são C. Em algumas versões, A5 em cada um dos anéis A e B é N, e A1, A2, A3 e A4 em cada um dos anéis A e B são C. Em algumas versões, A1 e A5 em cada um dos anéis A e B são cada um N e A2, A3 e A4 em cada um dos anéis A e B são C.
[0075] Em algumas versões, cada A1 é N. Em algumas versões, cada A2 é N. Em algumas versões, cada A3 é N. Em algumas versões, cada A4 é N. Em algumas versões, cada A5 é N. Em algumas versões, cada A1 e A5 é N. Em algumas versões, cada A1 é N, e cada A2, A3, A4 e A5 é C. Em algumas versões, cada A2 é N, e cada A1, A3, A4 e A5 é C. Em algumas versões, cada A3 é N, e cada A1, A2, A4 e A5 é C. Em algumas versões, cada A4 é N e cada A1, A2, A3 e A5 é C. Em algumas versões, cada A5 é N, e cada A1, A2, A3 e A4 é C. Em algumas versões, cada A1 e A5 é N, e cada A2, A3 e A4 é C.
[0076] Em algumas versões, pelo menos um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A é hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B é hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C é hidrogênio.
[0077] Em algumas versões, pelo menos dois de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos dois de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos dois de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C são hidrogênio.
[0078] Em algumas versões, pelo menos três de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos três de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos três de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C são hidrogênio.
[0079] Em algumas versões, pelo menos quatro de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos quatro de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos quatro de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C são hidrogênio.
[0080] Em algumas versões, cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A, se presente, é hidrogênio. Em algumas versões, cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A e B, se presente, é hidrogênio. Em algumas versões, cada R1, R2, R3, R4 e R5, se presente, é hidrogênio.
[0081] Em algumas versões, pelo menos um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A não é hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B não é hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio.
[0082] Em algumas versões, pelo menos dois de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A não são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos dois de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B não são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos dois de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C não são hidrogênio.
[0083] Em algumas versões, pelo menos três de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A não são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos três de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B não são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos três de R1, R2,
R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C não são hidrogênio.
[0084] Em algumas versões, pelo menos quatro de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A não são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos quatro de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B não são hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos quatro de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C não são hidrogênio.
[0085] Em algumas versões, cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A, se presente, não é hidrogênio. Em algumas versões, cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A e no anel B, se presente, não é hidrogênio. Em algumas versões, cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C, se presente, não é hidrogênio.
[0086] Em algumas versões, R1 no anel A não é hidrogênio. Em algumas versões, R1 no anel A não é hidrogênio e R2, R3, R4 e R5 no anel A, se presentes, são hidrogênio.
[0087] Em algumas versões, R1 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio. Em algumas versões, R1 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio, e R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A e B, se presentes, são hidrogênio.
[0088] Em algumas versões, cada R1 não é hidrogênio. Em algumas versões, cada R1 não é hidrogênio e cada R2, R3, R4 e R5, se presente, é hidrogênio.
[0089] Em algumas versões, R4 no anel A não é hidrogênio. Em algumas versões, R4 no anel A não é hidrogênio e R1, R2, R3 e R5 no anel A, se presentes, são hidrogênio.
[0090] Em algumas versões, R4 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio. Em algumas versões, R4 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio, e R1, R2, R3 e R5 em cada um dos anéis A e B, se presentes, são hidrogênio.
[0091] Em algumas versões, cada R4 não é hidrogênio. Em algumas versões, cada R4 não é hidrogênio e cada R1, R2, R3 e R5, se presente, é hidrogênio.
[0092] Em algumas versões, pelo menos um de R1 ou R4 no anel A não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos um de R1 ou R4 no anel A não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[0093] Em algumas versões, pelo menos um de R1 ou R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos um de R1 ou R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A e B que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[0094] Em algumas versões, pelo menos um de R1 ou R4 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e O anel B não é hidrogênio. Em algumas versões, pelo menos um de R1 ou R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A e B que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[0095] Em algumas versões, um de R1 ou R4 no anel A não é hidrogênio, e um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio. Em algumas versões, um de R1 ou R4 no anel A não é hidrogênio, um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 no anel A que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[0096] Em algumas versões, um de R1 ou R4 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio, e um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio. Em algumas versões, de R1 ou R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A e o anel B que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[0097] Em algumas versões, um de R1 ou R4 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio, e um de R3 e R4 em cada um dos anéis A, do anel B e o anel C não é hidrogênio. Em algumas versões, um de R1 ou R4 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio, um de R3 e R4 em cada um dos anéis A, do anel B e do anel C não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[0098] Em algumas versões, R1 no anel A não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio. Em algumas versões, R1 no anel A não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio, e cada um de R2, R3, R4 e R5 no anel A que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[0099] Em algumas versões, R1 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio. Em algumas versões, R1 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, e cada um de R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A e o anel B que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[00100] Em algumas versões, R1 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio. Em algumas versões, R1 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A, B e C é não é hidrogênio, e cada um de R2, R3, R4 e R5 em cada um dos anéis A, B e C que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[00101] Em algumas versões, R4 no anel A não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio. Em algumas versões, R4 no anel A não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 no anel A não é hidrogênio e cada um de R1, R2, R3 e R5 no anel A que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[00102] Em algumas versões, R4 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e B não é hidrogênio. Em algumas versões, R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A e o anel B não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3 e R5 em cada um dos anéis A e o anel B que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[00103] Em algumas versões, R4 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio, e pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio. Em algumas versões, R4 em cada um dos anéis A, B e C não é hidrogênio, pelo menos um de R3 e R4 em cada um dos anéis A, B e C é não é hidrogênio, e cada um de R1, R2, R3 e R5 em cada um dos anéis A, B e C que não é hidrogênio, se presente, é hidrogênio.
[00104] Em algumas versões, qualquer um ou mais de R1, R2, R3, R4, R5 e R6, quando presente, é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, hidroxi, halogênio, amino não substituído, amino substituído, alquila não substituído, alquila substituído e qualquer combinação dos anteriores. Em algumas versões, qualquer um ou mais de R1, R2, R3, R4, R5 e R6, quando presente, é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, hidroxi, halogênio, amino substituído ou não substituído, e alquila substituído ou não substituído. Em algumas versões, qualquer um ou mais de R1, R2, R3, R4, R5 e R6, quando presente, é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, hidroxi, halogênio, amino não substituído e não substituído alquila.
[00105] Em versões em que qualquer grupo R (por exemplo, R1, R2, R3, R4, R5 e/ou R6) é designado como "não hidrogênio", o grupo R é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxilo, acetila, halogênio e carboxila; uma porção química substituída ou não substituída selecionada a partir do grupo que consiste em amino, alquila, alcoxi, carboxialquila, acil, acilamino arila, arilalquila, heteroalquila, heteroalcoxi, heterocarboxialquila, heteroacil, heteroacilamino, heteroarila e heteroarilalquila; e qualquer combinação dos anteriores. Em algumas versões, cada grupo R designado como "não hidrogênio" é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxi, halogênio, amino não substituído, amino substituído, alquila não substituído, alquila substituído e qualquer combinação dos anteriores. Em algumas versões, cada grupo R designado como "não hidrogênio" é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxi, halogênio, amino substituído ou não substituído e alquila substituído ou não substituído. Em algumas versões, cada grupo R designado como "não hidrogênio" é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxi, halogênio, amino não substituído e alquila não substituído.
[00106] Em algumas versões, um A1 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; A2 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; A3 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; A4 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; e A5 em cada um dos anéis A, B e C são iguais.
[00107] Em algumas versões, R1 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; R2 em cada um dos anéis A, B e C são iguais; R3 em cada um dos anéis A, B e C são iguais; R4 em cada um dos anéis A, B e C são iguais; e R5 em cada um dos anéis A, B e C são iguais.
[00108] Em algumas versões, o Y entre o anel D e cada um dos anéis A, B e C é o mesmo.
[00109] Em algumas versões, os compostos são simétricos. Isto significa que A1 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; A2 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; A3 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; A4 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; A5 em cada um dos anéis A, B e C são iguais; R1 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; R2 em cada um dos anéis A, B e C são iguais; R3 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; R4 em cada um dos anéis A, B e C é o mesmo; R5 em cada um dos anéis A, B e C são iguais; e cada Y é o mesmo.
[00110] Em algumas versões, os compostos são assimétricos. Isso significa que pelo menos um de A1, A2, A3, A4, A5, R1, R2, R3, R4 e R5 em pelo menos um do anel A, o anel B, e o anel C, é diferente do correspondente A1, A2, A3, A4, A5, R1, R2, R3, R4 e R5, respectivamente, em pelo menos um outro dos anéis A, anel B e anel C; e/ou pelo menos um Y é diferente de pelo menos um outro Y. Em algumas versões, pelo menos um de A1, A2, A3, A4 e A5 em pelo menos um do anel A, o B anel, e o anel C, é diferente dos correspondentes A1, A2, A3, A4 e A5, respectivamente, em pelo menos um outro dos anéis A, B e C. Em algumas versões, pelo menos um de R1, R2, R3, R4 e R5 em pelo menos um dos anéis A, B e C, é diferente do correspondente R1, R2, R3, R4 e R5, respectivamente, em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, A1 em, pelo menos, um dos anéis A, B e C, é diferente do A1 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, A2 em, pelo menos, um dos anéis A, B e C, é diferente do que a A2 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, A3 em pelo menos um dos anéis A, B e C é diferente do A3 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, A4 em pelo menos um dos anéis A, B e C é diferente do A4 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, A5 em pelo menos um dos anéis A, B e C é diferente do A5 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, R1 em pelo menos um do anel A, anel B e anel C é diferente de R1 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, R2 em, pelo menos, um dos anéis A, B e C, é diferente do que o R2 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, R3 em pelo menos um dos anéis A, B e C, é diferente do que o R3 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, R4, em pelo menos um dos anéis A, B e C, é diferente do que o R4 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, R5 em pelo menos um dentre o anel A, o anel B e o anel C é diferente do R5 em pelo menos um outro anel A, anel B e anel C. Em algumas versões, o Y entre o anel D e o anel A é diferente do Y entre o anel D e pelo menos um dos anéis B e C. Em algumas versões, o Y entre o anel D e o anel B é diferente do Y entre o anel D e pelo menos um dos anéis A e C. Em algumas versões, o Y entre o anel D e o anel C é diferente do Y entre o anel D e pelo menos um dos anéis A e B.
[00111] As diferenças entre os Xs não ditam se um composto é simétrico ou assimétrico, conforme definido neste documento. Assim, um composto com uma diferença em um ou mais Xs pode ser simétrico ou assimétrico, dependendo da identidade de cada um de A1, A2, A3, A4, A5, R1, R2, R3, R4, R5 e os Ys conforme descrito acima.
[00112] O termo "mesmo" no contexto de designar compostos simétricos da maneira descrita acima se refere a porções químicas que consistem em átomos idênticos em configurações estruturais idênticas. O termo "diferente" no contexto de designar compostos assimétricos da maneira descrita acima se refere a porções químicas que consistem em átomos não idênticos ou átomos idênticos em configurações estruturais não idênticas. As definições acima dos termos "mesmo" e "diferente" são qualificadas com a condição de que qualquer formação diferencial potencial de ácidos, bases, íons ou sais entre os anéis não são considerados nas definições. Assim, as porções químicas -CO2H, -CO2- e -CO2Na são consideradas "iguais" neste documento. Porções químicas como -CH3¸ -CH2CH3 e -CH2CH2CH3 são consideradas "diferentes" aqui.
[00113] Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; e A1, A2, A3, A4 e A5 no anel A são C. Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; o Y entre o anel D e o anel B é O; e A1, A2, A3, A4 e A5 em cada um dos anéis A e B são C. Em algumas versões, cada X é CR6; cada Y é O; e cada A1, A2, A3, A4 e A5 é C. Os compostos de fórmula Z contendo estas características são ligantes de NLRX1.
[00114] Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; o Y entre o anel D e o anel B é O; A1, A2, A3 e A4 em cada um dos anéis A e B são C; e A5 em cada um dos anéis A e B é N. Em algumas versões, cada X é CR6; cada Y é O; cada A1, A2, A3 e A4 é C; e cada A5 é N. Os compostos de fórmula Z contendo estas características são ligantes de NLRX1.
[00115] Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; A1, A2, A3 e A5 no anel A são C; e A4 no anel A é N. Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; o Y entre o anel D e o anel B é O; A1, A2, A3 e A5 em cada um dos anéis A e B são C; e A4 em cada um dos anéis A e B é N. Em algumas versões, cada X é CR6; cada Y é O; cada A1, A2, A3 e A5 é C; e cada A4 é N. Os compostos de fórmula Z contendo estas características são ligantes de NLRX1.
[00116] Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; A1, A2, A4 e A5 no anel A são C; e A3 em que o anel A é N. Em algumas versões, cada X CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; o Y entre o anel D e o anel B é O; A1, A2, A4 e A5 em cada um dos anéis A e B são C; e A3 em cada um o anel A e o anel B é N. Em algumas versões, cada X CR6; cada Y é O; cada A1, A2, A4 e A5 é C; e cada A3 é N.
Os compostos de fórmula Z contendo estas características são ligantes de NLRX1.
[00117] Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; A2, A3 e A4 no anel A são C; e A1 e A5 no anel A são N. Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é O; o Y entre o anel D e o anel B é O; A2, A3 e A4 em cada um dos anéis A e B são C; e A1 e A5 em cada um dos anéis A e B são N. Em algumas versões, cada X é CR6; cada Y é O; cada A2, A3 e A4 é C; e cada A1 e A5 é N. Os compostos de fórmula Z contendo estas características são ligantes de NLRX1.
[00118] Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é NR6; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é S; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas versões, cada X é CR6; a Y entre o anel D e o anel A é C(R6)2; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas versões, cada X é CR6; o Y entre o anel D e o anel A é CR7; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Os compostos de fórmula Z contendo estas características são ligantes de NLRX1.
[00119] Em algumas versões, qualquer um, quaisquer dois ou todos os três dos Xs são N; o Y entre o anel D e o anel A é NR6; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas versões, qualquer um, quaisquer dois ou todos os três dos Xs são N; o Y entre o anel D e o anel A é S; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas versões, qualquer um, quaisquer dois ou todos os três dos Xs são N; a Y entre o anel D e o anel A é C(R6)2; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas versões, qualquer um, quaisquer dois ou todos os três dos Xs são N; o Y entre o anel D e o anel A é CR7; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Os compostos de fórmula Z contendo estas características são ligantes de NLRX1.
[00120] Em algumas versões, pelo menos um X é C; a Y entre o anel D e o Anel A é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S, C(R6)2, e CR7; pelo menos um de A1 e A3 no anel A é C; A2 em que o anel A é C; e A5 no anel A é N. Em algumas de tais versões, cada X é, opcionalmente, C; o Y entre o anel D e o anel A é opcionalmente O; A1, A2, A3 e A4 no anel A são opcionalmente C; pelo menos um de
R1, R2, R3 e R4 no anel A é opcionalmente não hidrogênio; e/ou pelo menos um de R1 e R4 no anel A opcionalmente n hidrogio.
[00121] Em algumas versões, cada X é C; o Y entre o anel D e o anel A é O; A1, A2, A3, e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N. Em algumas de tais versões, pelo menos um de R1 e R4 no anel A não é hidrogênio.
[00122] Em algumas versões, cada X é C; cada Y é O; A1, A2, A3 e A4 em cada um dos anéis A e B são C; e A5 em cada um dos anéis A e o anel B é N. Em algumas de tais versões, pelo menos um de R1 e R4 no anel A e pelo menos um de R1 e R4 no anel B são opcionalmente não hidrogênio.
[00123] Em algumas versões, pelo menos um X é C; a Y entre o anel D e o Anel A é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S, C(R6)2, e CR7; A2 e A3 no anel A são C; e A5 no anel A é N.
[00124] Em algumas versões, pelo menos um X é C; pelo menos um de A1 e A3 no anel A é C; A2 em que o anel A é C; A5 no anel A é N; e pelo menos um de R1, R2, R3 e R4 no anel A não é hidrogênio.
[00125] Em algumas versões, A5 no anel A é N, R1 no anel A não é hidrogênio.
[00126] Qualquer versão dos compostos aqui descritos pode ser combinada com qualquer outra versão dos compostos aqui descritos, a menos que a combinação seja claramente inconsistente.
ADMINISTRAÇÃO
[00127] No decurso dos métodos da presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de compostos da invenção pode ser administrada a um animal, incluindo mamíferos e seres humanos, de várias maneiras. Embora na modalidade preferencial, os compostos da invenção são administrados por via oral ou parenteral, outras formas de administração, como através de compostos médicos ou aerossóis, também são contempladas.
[00128] Para administração oral, a quantidade eficaz de compostos pode ser administrada, por exemplo, nos estados sólido, semissólido, líquido ou gasoso. Os exemplos específicos incluem agentes de comprimido, cápsula, pó, grânulo, solução,
suspensão, xarope e elixir. No entanto, os compostos não estão limitados a essas formas.
[00129] Para formular os compostos da invenção em comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões, o composto é preferencialmente misturado com um aglutinante, um agente desintegrante e/ou um lubrificante. Se necessário, a composição resultante pode ser misturada com um diluente, um tampão, um agente infiltrante, um conservante e/ou um aroma, usando métodos conhecidos. Os exemplos do ligante incluem celulose cristalina, derivados de celulose, amido de milho, ciclodextrinas e gelatina. Os exemplos do agente desintegrante incluem amido de milho, amido de batata e carboximetilcelulose de sódio. Os exemplos do lubrificante incluem talco e estearato de magnésio. Além disso, também podem ser utilizados aditivos, que foram convencionalmente usados, como lactose e manitol.
[00130] Para administração parentérica, os compostos da presente invenção podem ser administrados por via retal ou por injeção. Para administração retal, um supositório pode ser usado. O supositório pode ser preparado misturando-se os compostos da presente invenção com um excipiente farmaceuticamente adequado que derrete à temperatura corporal, mas permanece sólido à temperatura ambiente. Os exemplos incluem, entre outros, manteiga de cacau, cera de carbono e polietileno glicol. A composição resultante pode ser moldada em qualquer forma desejável usando métodos conhecidos no campo.
[00131] Para administração por injeção, os compostos da presente invenção podem ser injetados por via hipodérmica, intracutânea, intravenosa e intramuscular. Os medicamentos para essa injeção podem ser preparados através da dissolução, suspensão ou emulsificação dos compostos da invenção em um solvente aquoso ou não aquoso, como óleo vegetal, glicerídeo de ácido de resina sintética, éster de ácido graxo superior ou propileno glicol por um método conhecido. Se desejável, também podem ser adicionados aditivos, como um agente solubilizante, um agente osmorregulador, um emulsificante, um estabilizador ou um conservante, que tenham sido utilizados convencionalmente. Embora não seja necessário, é preferencial que a composição seja estéril ou esterilizada.
[00132] Para formular os compostos da invenção em suspensões, xaropes ou elixires, um solvente farmaceuticamente adequado pode ser usado. Incluído entre os mesmos está o exemplo não limitante de água.
[00133] Os compostos da invenção também podem ser usados em combinação com um composto adicional que tem outra atividade farmaceuticamente adequada para preparar um medicamento. Um fármaco, contendo um composto da invenção como um composto independente ou como parte de uma composição, pode ser usado no tratamento de indivíduos em necessidade do mesmo.
[00134] Os compostos da invenção também podem ser administrados na forma de um aerossol ou inalante preparado carregando-se os compostos na forma de um pó líquido ou fino, juntamente com um agente de pulverização gasoso ou líquido e, se necessário, um agente auxiliar conhecido como um agente auxiliar, em um recipiente não pressurizado, como um recipiente de aerossol ou um nebulizador. Um gás pressurizado de, por exemplo, diclorofluorometano, propano ou nitrogênio pode ser usado como agente de pulverização.
[00135] Os compostos da invenção podem ser administrados a um animal, incluindo mamíferos e seres humanos, necessitando dos mesmos como uma composição farmacêutica, como comprimidos, cápsulas, soluções ou emulsões. A administração de outras formas dos compostos descritos nesta invenção, incluindo, mas sem limitação, a ésteres, sais farmaceuticamente adequados, metabólitos dos mesmos, compostos estruturalmente relacionados dos mesmos, seus análogos e combinações dos mesmos, em uma dose única ou em uma dose múltipla, também é contemplada pela presente invenção.
[00136] Os compostos da invenção também podem ser administrados a um animal que deles necessite como aditivo nutricional, quer como alimento ou suplemento nutracêutico.
[00137] Os termos "prevenção", "tratamento", "proteção" ou "melhoria" e termos semelhantes usados aqui, incluem profilaxia e tratamento completo ou parcial. Os termos também podem incluir reduzir sintomas, melhorar sintomas, reduzir a gravidade dos sintomas, reduzir a incidência da doença, indução da remissão, manutenção da remissão ou qualquer outra alteração na condição do paciente, o que melhora o resultado terapêutico.
[00138] Os compostos descritos nesta invenção são preferencialmente usados e/ou administrados na forma de uma composição. As composições adequadas são, de preferência, uma composição farmacêutica, um alimento ou um suplemento alimentar. Estas composições proporcionam uma forma conveniente para entregar os compostos. As composições da invenção podem compreender um antioxidante em uma quantidade eficaz para aumentar a estabilidade dos compostos em relação à oxidação ou solubilidade.
[00139] A quantidade de composto que é administrada no método da invenção ou que é para administração no uso da invenção é qualquer quantidade adequada. É preferencialmente de 1 ng/kg de peso corporal a 20 g/kg de peso corporal, mais preferencialmente na faixa de 1 µg/kg de peso corporal a 1 g/kg de peso corporal, tal como 1 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal de composto por dia. As composições adequadas podem ser formuladas em conformidade. Os especialistas na técnica de dosagem de agentes biologicamente ativos terão capacidade para desenvolver regimes de dosagem específicos para vários indivíduos com base em parâmetros conhecidos e bem compreendidos.
[00140] Uma composição preferencial de acordo com a invenção é uma composição farmacêutica, como na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, caplets, multiparticulados (incluindo grânulos, cabeças, pellets e partículas microencapsuladas), pós, elixires, xaropes, suspensões e soluções. As composições farmacêuticas compreenderão tipicamente um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas são preferencialmente adaptadas para administração parentérica ou oral. As composições administráveis por via oral podem estar na forma sólida ou líquida e podem assumir a forma de comprimidos, pós, suspensões e xaropes, entre outras coisas. Opcionalmente, as composições compreendem um ou mais agentes aromatizantes e/ou corantes. Em geral, as composições terapêuticas e nutricionais podem compreender qualquer substância que não interfira significativamente na ação dos compostos sobre o sujeito.
[00141] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso em tais composições são bem conhecidos na técnica da farmácia. As composições da invenção podem conter 0,01 a 99% em peso dos compostos da invenção. As composições da invenção são geralmente preparadas na forma de dosagem unitária. De preferência, a dosagem unitária dos compostos descritos na presente invenção é de 0,1 mg a 2000 mg, mais preferencialmente de 50 mg a 1000 mg. Os excipientes usados na preparação destas composições são os excipientes conhecidos na técnica.
[00142] Outros exemplos de formas de produtos para a composição são suplementos alimentares, como na forma de um gel macio ou de uma cápsula rígida que compreende um material de encapsulamento selecionado a partir do grupo que consiste em gelatina, amido, amido modificado, derivados de amido, como glicose, sacarose, lactose e frutose. O material de encapsulamento pode conter opcionalmente agentes de reticulação ou polimerização, estabilizadores, antioxidantes, agentes absorventes de luz para proteger cargas sensíveis à luz, conservantes e similares. Preferencialmente, a dosagem unitária dos compostos descritos na presente invenção é de 0,1 mg a 2.000 mg, mais preferencialmente de 50 mg a 1000 mg.
[00143] Em geral, o termo carreador pode ser usado ao longo deste pedido para representar uma composição com a qual os compostos descritos podem ser misturados, seja um carreador farmacêutico, alimento, suplemento nutricional ou auxiliar dietético. Os materiais descritos acima podem ser considerados carreadores para os fins da invenção. Em certas modalidades da invenção, o carreador tem pouca ou nenhuma atividade biológica nos compostos da invenção.
[00144] Dose: Os métodos da presente invenção podem compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de composto a um animal que necessita do mesmo. A quantidade eficaz de composto depende da forma do composto administrado, da duração da administração, da via de administração (por exemplo, oral ou parenteral), da idade do animal e da condição do animal, incluindo mamíferos e seres humanos.
[00145] Por exemplo, uma quantidade de um composto eficaz para tratar ou prevenir colite ulcerosa, doença de Crohn, inflamação gastrointestinal, infecção por Clostridium difficile, câncer colorretal ou qualquer outra condição aqui descrita em um animal pode variar de 1 ng/kg/dia a 20 g/kg/dia. Uma quantidade eficaz preferencial de composto é de 50 µg/kg/dia a 5 g/kg/dia, com uma dose mais preferencial sendo de 1 a 100 mg/kg/dia. A quantidade eficaz de composto é mais eficaz no tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias intestinais em geral, colite ulcerativa, doença de Crohn, inflamação gastrointestinal, infecção por Clostridium difficile ou câncer colorretal de um animal quando administrado a um animal por períodos que variam de cerca de 1 a 1000 dias, com um período preferencial de 7 a 300 dias, e um período mais preferencial de 30 a 90 dias, em que mais eficaz é definido como uma identificação da indução de respostas benéficas. A quantidade eficaz de composto pode ser continuada para além destes períodos para manutenção de respostas benéficas em doenças crônicas.
[00146] Uma quantidade de composto mais eficaz na prevenção da ativação excessiva do sistema imunológico pode variar de 1 ng/kg/dia a 20 g/kg/dia, com uma dose preferida de 1 a 100 mg/kg/dia.
[00147] Quando a quantidade eficaz do composto da presente invenção é administrada em uma composição terapêutica, médica ou veterinária, a dose preferencial está na faixa de cerca de 0,01 a 2,0% em peso/peso de comida ou produto nutracêutico.
[00148] Em certas outras modalidades, a presente invenção fornece o uso de compostos de ligação a NLRX1 e também compostos estruturalmente relacionados, tais como um composto selecionado do grupo que consiste no composto, seus ésteres, seus sais farmaceuticamente adequados, seus metabólitos, seus compostos estruturalmente relacionados, ou combinações dos mesmos no tratamento e prevenção de DII e inflamação do trato gastrointestinal (GI).
[00149] Além disso, em geral, a presente invenção se refere à inibição ou ativação da inflamação no trato GI, em que os componentes relevantes incluem o esôfago, estômago, intestino delgado, ceco, intestino grosso e reto. O efeito resulta da exposição do composto a vários tipos de células no corpo que induzem um efeito biológico. As células podem incluir às dos tecidos do trato GI, células imunes (isto é, macrófagos, monócitos, linfócitos) ou células epiteliais. Em certas modalidades, a invenção fornece o tratamento de sujeitos com um composto da invenção, por exemplo, como um suplemento dietético, para reduzir ou prevenir a inflamação relacionada à doença inflamatória intestinal, doença de Crohn ou colite ulcerativa. A presente invenção também contempla a administração dos compostos da invenção ao trato GI a fim de suprimir a expressão de adesão celular e moléculas quimioatraentes no intestino.
[00150] Quando praticados, os métodos da invenção podem ser por meio da administração dos compostos a um sujeito por qualquer via de administração aceitável, com o uso de qualquer forma aceitável, conforme descrito acima, e permitindo que o corpo do sujeito distribua os compostos para a célula alvo através de processos naturais. Conforme descrito acima, a administração pode ser igualmente por injeção direta em um local (por exemplo, órgão, tecido) contendo uma célula alvo (isto é, uma célula a ser tratada).
[00151] Além disso, a administração pode seguir qualquer número de regimes. Assim, a mesma pode compreender uma dose única ou dosagem do composto experimental, ou múltiplas doses ou dosagens por um período de tempo. Por conseguinte, o tratamento pode compreender a repetição da etapa de administração uma ou mais vezes até que um resultado desejável seja alcançado. Em certas modalidades, o tratamento pode continuar por longos períodos de tempo, como semanas, meses ou anos. Os regimes de dosagem podem, preferencialmente, implicar a administração do composto entre 6 vezes ao dia a uma vez por semana, com um regime mais preferencial entre três vezes ao dia a uma vez ao dia. Aqueles versados na técnica são totalmente capazes de desenvolver facilmente regimes de dosagem adequados para indivíduos com base em parâmetros conhecidos na técnica. As quantidades de dosagem para os compostos da invenção podem ser usadas nos métodos dessas modalidades da invenção. Para o tratamento de DII, inflamação do trato GI ou supressão da expressão de moléculas de adesão celular no intestino, é preferencial que os compostos sejam administrados em quantidades de cerca de 100 ng/dia a 10 g/dia.
[00152] A quantidade a ser administrada variará dependendo do sujeito, estágio da doença ou distúrbio, idade do sujeito, estado geral de saúde do sujeito e vários outros parâmetros conhecidos e rotineiramente levados em consideração pelos indivíduos versados na técnica médica. Como uma questão geral, uma quantidade suficiente de composto será administrada a fim de fazer uma mudança detectável na quantidade de inflamação no trato GI, que com DII está frequentemente relacionada à quantidade de dor que um indivíduo está sentindo. Com os pacientes que atualmente não apresentam sintomas de DII, a mudança que se pode procurar pode envolver parâmetros de células imunológicas, como TNFα ou níveis de proteína C reativa no sangue, a porcentagem de células T reguladoras no sangue ou concentração de calprotectina nas fezes. Quantidades adequadas são divulgadas aqui, e quantidades adequadas adicionais podem ser identificadas por aqueles versados na técnica sem experimentação indevida ou excessiva, com base nas quantidades aqui divulgadas.
[00153] A invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de um indivíduo que sofre de DII, ou indivíduos saudáveis, talvez com uma predisposição genética para a Doença de Crohn ou colite ulcerativa, de desenvolver DII. Os método também podem envolver o tratamento de pessoas com uma forma remissiva de DII. De acordo com a invenção, o termo "um sujeito que sofre de DII" é usado para significar um sujeito (por exemplo, animal, humano) com uma doença ou distúrbio que mostra um ou mais sinais clínicos típicos da DII. Em geral, o método de tratamento ou prevenção de acordo com este aspecto da invenção compreende a administração ao sujeito de uma quantidade de composto ou terapia celular que é eficaz no tratamento ou prevenção de um ou mais sintomas ou manifestações clínicas da DII ou na prevenção do desenvolvimento de tal sintoma (ou sintomas) ou manifestação (ou manifestações).
[00154] Assim, de acordo com os métodos da invenção, a invenção pode fornecer métodos de tratando DII, inflamação associada à infecção entérica e inflamação associada a doenças autoimunes. Os métodos de tratamento podem ser métodos profiláticos. Em certas modalidades, o método é um método de tratamento de DII, inflamação associada a infecção entérica e inflamação associada a doenças autoimunes. Em outras modalidades, o método é um método para prevenir a DII. Nas modalidades, o método é um método para impedir que uma forma remissiva de DII se torne ativa. Em ainda outras modalidades, o método é um método para melhorar o estado de saúde de um sujeito que sofre de DII, inflamação associada a infecção entérica e inflamação associada a doenças autoimunes. Os organismos que causam infecções gastroentéricas incluem, mas sem limitação: Escherichia coli, Shigella, Salmonella, pathogenic Vibrios, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Yersina enterocolitica, Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica e Giardia lamblia. Consequentemente, em certas modalidades, a invenção fornece um método para proteger a saúde, órgãos e/ou tecidos de um sujeito que sofre de DII, inflamação associada à infecção entérica e inflamação associada a doenças autoimunes ou em risco de desenvolver DII, inflamação associada à infecção entérica e inflamação associada a doenças autoimunes.
[00155] Em uma modalidade da invenção, o método de tratamento da DII compreende o tratamento da DII sem causar efeitos colaterais discerníveis, como ganho de peso significativo, supressão imunológica sistêmica, aparência cushingóide, osteopenia/osteoporose ou pancreatite comum nos tratamentos de DII atualmente disponíveis (isto é, corticosteroides, inibidores do fator de necrose tumoral alfa). Ou seja, constatou-se que o método de tratamento de acordo com a presente invenção, que fornece o efeito do tratamento, pelo menos em parte, afetando-se a expressão e/ou ativação do NLRX1 em algumas células, fornece o efeito benéfico sem causar um ganho significativo de peso, por exemplo, por retenção de líquidos, no sujeito a ser tratado, em comparação com outros sujeitos semelhantes que não receberam o tratamento.
[00156] Como tal, os métodos da presente invenção podem fornecer métodos para reduzir a inflamação. Os métodos podem reduzir a inflamação sistemicamente (isto é, em todo o corpo do indivíduo) ou localmente (por exemplo, no sítio da administração ou no sítio das células inflamatórias, incluindo, mas sem limitação, células T e macrófagos). No tratamento ou prevenção da inflamação de acordo com os métodos da presente invenção, um efeito que pode ser observado é a diminuição do número de monócitos ou macrófagos no sangue e linfócitos que se infiltram no intestino. Outro efeito pode ser o aumento nas populações de células imunes reguladoras, como as células T reguladoras CD4+CD25+FoxP3+, ou um aumento nas propriedades regulatórias de linfócitos ou macrófagos (por exemplo, aumento de IL-10 ou diminuição de TNF-α e IL-6). Outro efeito pode ser a presença reduzida de genes inflamatórios e/ou moléculas de adesão. Desse modo, os métodos também podem ser considerados métodos para afetar ou alterar a resposta imune de um indivíduo ao qual a terapia é administrada. O sujeito pode ter doença inflamatória intestinal ou outra afecção na qual a imunomodulação das células T ou a regulação decrescente das moléculas de adesão celular é um resultado desejável.
[00157] A invenção fornece métodos de tratamento de uma doença gastrointestinal inflamatória, imunomediada ou crônica com os compostos aqui descritos. Os exemplos não limitantes de doenças gastrointestinais inflamatórias, imunomediadas ou crônicas incluem doença inflamatória intestinal (DII), doença gastrointestinal eosinofílica, doença celíaca, enterocolite necrosante, colangite esclerosante primária, gastrite erosiva crônica, síndrome do intestino irritável, amiloidose do intestino delgado, colite isquêmica, colite por radiação, diverticulite, colite linfocítica, colite colagenosa, entre outras.
[00158] A invenção fornece métodos de tratamento de doenças imunomediadas sistêmicas com os compostos aqui descritos. Os exemplos não limitativos de doenças imunomediadas sistêmicas incluem artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes tipo 1 e psoríase.
[00159] Os compostos adequados para reduzir a inflamação e as respostas imunes efetoras, o tratamento de doenças gastrointestinais inflamatórias, imunomediadas ou crônicas, ou o tratamento de doenças sistêmicas imunomediadas, incluem agonistas de NLRX1. Os agonistas de NLRX1 incluem compostos simétricos de fórmula Z e seus sais. Os agonistas de NLRX1 também incluem compostos assimétricos de fórmula Z e seus sais, em que a assimetria resulta de um e apenas um de: (1) uma mudança de C para N ou de N para C em um ou mais constituintes (ou seja, um ou mais de A1, A2, A3, A4, or A5) em um do anel A, o anel B ou o anel C em relação aos constituintes correspondentes (ou seja, um ou mais de A1, A2, A3, A4, or A5, respectivamente) em outro anel A, o anel B ou o anel C; ou (2) uma mudança de uma determinada porção química para um homólogo adjacente em um ou mais substituintes (ou seja, um ou mais de R1, R2, R3, R4, or R5) em um do anel A, o Anel B, ou o anel C em relação a um substituinte correspondente (ou seja, um ou mais de R1, R2, R3, R4, or R5, respectivamente) em outro do anel A, o anel B, ou o anel C. Para os fins aqui descritos, qualquer porção química definida para R1, R2, R3, R4 e/ou R5, incluindo hidrogênio, é considerada como constituindo um substituto do anel no qual está presente. Tal como aqui utilizado, "homólogos adjacentes" referem-se a duas porções que diferem apenas pela presença ou ausência de um único grupo metileno (-CH2-). Assim, os exemplos não limitativos de homólogos adjacentes incluem: hidrogênio (-H) e metil (-CH3); metil (-CH3) e etil (-CH2CH3); -OH e -CH2OH; -COOH e -COOCH3; e -COOCH3 e - CH2COOCH3. Para ser explícito, os grupos R definidos como hidrogênio e os grupos R definidos como metil são considerados aqui como homólogos adjacentes. Em contraste, os exemplos de frações que não são homólogas adjacentes incluem: hidrogênio (-H) e qualquer um de etil (-CH2CH3), -OH, -CH2OH, -COOH, -COOCH3 e -CH2COOCH3; metil (-CH3) e propil (-CH2CH2CH3); e -COOH e -CH2COOCH3.
[00160] Os agonistas também são adequados para o tratamento de infecções gastrointestinais de bactérias patogênicas, por exemplo, pelos agonistas que promovem o crescimento de cepas comensais de bactérias e, assim, controlam as cepas patogênicas por meio de inibição competitiva.
[00161] Como tal, os métodos da presente invenção podem fornecer métodos para reduzir a inflamação. Os métodos podem aumentar a inflamação sistemicamente (isto é, em todo o corpo do indivíduo) ou localmente (por exemplo, no local da administração ou no local das células inflamatórias, incluindo, mas sem limitação, células T e macrófagos). No tratamento ou prevenção da inflamação de acordo com os métodos da presente invenção, um efeito que pode ser observado é o aumento nas populações de células imunes, tais como células CD4+Tbet+ T auxiliares 1 ou neutrófilos, ou um aumento na produção de citocinas inflamatórias, como TNF-α ou IFN-γ. Desse modo, os métodos também podem ser considerados métodos para afetar ou alterar a resposta imune de um indivíduo ao qual a terapia é administrada. O sujeito pode ter uma infecção ou câncer em que a ativação do sistema imunológico é benéfica no tratamento da doença.
[00162] A invenção também fornece métodos de tratamento de uma doença infecciosa com os compostos aqui descritos. Os exemplos não limitativos de tais doenças infecciosas incluem infecções virais, infecções bacterianas e infecções por fungos.
[00163] Os exemplos não limitativos de infecções virais incluem infecções de vírus da família adenoviridae, como adenovírus; vírus da família herpesviridae, tais como herpes simplex, tipo 1, herpes simplex, tipo 2, vírus varicela-zoster, vírus epstein-barr, citomegalovírus humano, herpesvírus humano e tipo 8; vírus da família papilomaviridae, como o papilomavírus humano; vírus da família polyomaviridae, como vírus BK e vírus JC; vírus da família poxviridae, como varíola; vírus da família hepadnaviridae, como vírus da hepatite B; vírus da família parvoviridae, como bocavírus humano e parvovírus B19; vírus da família astroviridae, como astrovírus humano; vírus da família caliciviridae, como vírus norwalk; vírus da família picornaviridae, tais como coxsackievírus, vírus da hepatite A, poliovírus e rinovírus; vírus da família coronaviridae, como vírus da síndrome respiratória aguda; vírus da família flaviviridae, como vírus da hepatite C, vírus da febre amarela, vírus da dengue e vírus do Nilo Ocidental, vírus da família togaviridae, como vírus da rubéola; vírus da família hepeviridae, como vírus da hepatite E; vírus da família retroviridae, como vírus da imunodeficiência humana (HIV); vírus da família ortomyxoviridae, como vírus influenza; vírus da família arenaviridae, como vírus guanarito, vírus junin, vírus lassa, vírus machupo e vírus sabiá; vírus da família bunyaviridae, como vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo; vírus da família filoviridae, como o vírus ebola e o vírus Marburg; vírus da família paramyxoviridae, tais como vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da parainfluenza, vírus sincicial respiratório, metapneumovírus humano, vírus hendra e vírus nipah; vírus da família rhabdoviridae, como o vírus da raiva; vírus não atribuídos, como vírus da hepatite D; e vírus da família reoviridae, como rotavírus, orbivírus, coltivírus e vírus banna, entre outros.
[00164] Os exemplos não limitantes de infecções bacterianas incluem infecções com as bactérias descritas acima, além de Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis Campylobacter jejuni Chlamydia pneumoniae, Chlamydia tracoma psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legobacter pylori, Helicobacter pylori Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saider, Staphylococcus epidermid phyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis e outras espécies dos gêneros dos organismos mencionados acima.
[00165] Os exemplos não limitativos de infecções fúngicas incluem infecção por fungos do gênero Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, que causam aspergilose; fungos do gênero Blastomyces, como Blastomyces dermatitidis, que causam blastomicose; fungos do gênero Candida, como Candida albicans, que causam candidíase; fungos do gênero Coccidioides, que causam coccidioidomicose (febre do vale); fungos do gênero Cryptococcus, como Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, que causam criptococose; fungos dermatófitos, que causam micose; fungos que causam ceratite fúngica, como espécies de Fusarium, espécies de Aspergillus e espécies de Candida; fungos do gênero Histoplasma, como Histoplasma capsulatum, que causam histoplasmose; fungos da ordem Mucorales, que causam mucormicose; fungos do gênero Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae; fungos do gênero Pneumocystis, como Pneumocystis jirovecii, que causam pneumonia por pneumocystis; e fungos do gênero Sporothrix, como Sporothrix schenckii, que causam esporotricose.
[00166] A invenção também fornece métodos de tratamento de cânceres com os compostos aqui descritos. Os exemplos não limitativos de cânceres incluem câncer colorretal, câncer de garganta, câncer de tireoide, câncer gástrico, câncer pancreático, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, leucemia mieloide aguda, câncer hepatocelular, tumores estromais gastrointestinais, leucemia linfoblástica aguda, distúrbios mieloproliferativos crônicos, entre outros.
[00167] Os compostos adequados para aumentar a inflamação e as respostas imunes efetoras ou para o tratamento de uma doença infecciosa ou câncer incluem antagonistas de NLRX1. Os antagonistas de NLRX1 incluem compostos assimétricos de fórmula Z que não se enquadram na definição de agonistas fornecida acima. Os antagonistas exemplares de NLRX1 incluem compostos assimétricos de fórmula Z e seus sais, em que a assimetria resulta de: (1a) uma mudança de C para N ou de N para C em um ou mais constituintes (ou seja, um ou mais de A1, A2, A3, A4, or A5) em um do anel A, o anel B ou o anel C em relação aos constituintes correspondentes (ou seja, um ou mais de A1, A2, A3, A4 ou A5, respectivamente) em outro anel A, o anel B ou o anel C; e (1b) uma mudança de uma determinada porção química para um homólogo adjacente em um ou mais substituintes (ou seja, um ou mais de R1, R2, R3, R4 ou R5) em um do anel A, o Anel B, ou o anel C em relação a um substituinte correspondente (isto é, um ou mais de R1, R2, R3, R4 ou R5, respectivamente) em outro do anel A, o anel B, ou o anel C; ou (2) uma mudança de uma determinada porção química para uma porção química diferente de um homólogo adjacente em um ou mais substituintes (ou seja, um ou mais de R1, R2, R3, R4 ou R5) em um do anel A, o anel B ou o anel C em relação a um substituinte correspondente (ou seja, um ou mais de R1, R2, R3, R4 ou R5, respectivamente) em outro anel A, o Anel B ou o anel C.
[00168] Tendo em vista os métodos acima, deve ser evidente que a presente invenção fornece terapia de composto de ligação a NLRX1 para uso no contato de células, tal como no tratamento de células de um sujeito. A discussão acima concentra-se no uso dos compostos da presente invenção como parte de uma composição para uso no que geralmente pode ser considerado um ambiente farmacêutico ou médico.
[00169] Os compostos descritos nesta invenção para o tratamento de DII, inflamação do trato GI e outras condições descritas podem ser formulados como um produto farmacêutico, composição nutricional, composição alimentar funcional ou auxiliar dietético.
[00170] Como ligantes de NLRX1, os compostos descritos neste documento podem ser usados como controles positivos em ensaios que testam a ligação a NLRX1. Tais ensaios incluem ensaios de ressonância de plasmão de superfície, conforme descrito nos exemplos, ou outros métodos.
[00171] Os elementos e as etapas do método descritos aqui podem ser usados em qualquer combinação, seja explicitamente descrita ou não.
[00172] Todas as combinações de etapas do método, conforme usadas aqui, podem ser realizadas em qualquer ordem, a menos que especificado de outra forma ou claramente implícito em contrário pelo contexto em que a combinação referenciada é feita.
[00173] Conforme aqui usado, as formas singulares "um/uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra forma.
[00174] As faixas numéricas, conforme usadas no presente documento, devem incluir todos os números e subconjuntos de números contidos nessa faixa,
especificamente divulgados ou não. Além disso, essas faixas numéricas devem ser interpretadas como um suporte para uma reivindicação direcionada a qualquer número ou subconjunto de números nessa faixa. Por exemplo, uma divulgação de 1 a 10 deve ser interpretada como suportando uma faixa de 2 a 8, de 3 a 7, de 5 a 6, de 1 a 9, de 3,6 a 4,6, de 3,5 a 9,9, e assim por diante.
[00175] Todas as patentes, publicações de patentes e publicações revisadas por pares (isto é, "referências") citadas aqui são expressamente incorporadas por referência na mesma extensão como se cada referência individual fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada por referência. Em caso de conflito entre a presente divulgação e as referências incorporadas, a presente divulgação prevalecerá.
[00176] Entende-se que a invenção não está confinada à construção e disposição particulares das partes aqui ilustradas e descritas, mas abrange as formas modificadas das mesmas que entram no escopo das reivindicações.
EXEMPLOS
MODELAGEM MOLECULAR EXEMPLO 1. MODELAGEM MOLECULAR DE LIGANTES NLRX1
[00177] Usando ligantes de NLRX1 descritos anteriormente, incluindo RNA viral e lipídios da dieta (ácido púnico e ácido docosahexaenóico), determinamos a existência de dois sítios de ligação de alto potencial na proteína NLRX1 [5]. Esses ligantes foram encaixados na estrutura publicada para o terminal C de NLRX1 (pdb: 3UN9) para estabelecer importantes resíduos de ligação.
MÉTODOS
[00178] Triagem virtual. Para fornecer insights adicionais sobre os andaimes preliminares, bancos de dados de ligantes foram encaixados no NLRX1 usando AutoDock Vina em cada um dos dois locais usando grade de pesquisa cubóide de tamanho (58 x 40 x 40 angstrom) para fornecer afinidades de ligação previstas e conformações de ligantes. A afinidade de ligação foi normalizada para o peso molecular do ligante. Os ligantes superiores foram selecionados para um exame mais aprofundado da postura de ligação.
[00179] Geração de compostos. A partir dos resíduos identificados e das interações bioquímicas previstas, estruturas foram geradas para ligantes NLRX1 de alta afinidade. Estruturas foram geradas e quimicamente otimizadas usando WebMo. Os arquivos de estrutura foram gerados no formato .pdb e convertidos para o formato .pdbqt através do cálculo de cobranças pelo método de Gasteiger. As estruturas foram encaixadas usando AutoDock Vina para confirmar a afinidade de ligação.
[00180] Análise. Os compostos foram classificados preliminarmente pela afinidade de ligação mais baixa prevista normalizada para o peso molecular que representa a postura de ligação mais favorável por meio de uma minimização da energia intermolecular total, energia interna total e energia livre de torção. Os compostos foram então priorizados com base em distâncias favoráveis aos resíduos de ligação críticos em NLRX1.
RESULTADOS
[00181] A partir da triagem virtual e otimização de novas entidades químicas (NCEs), os compostos com simetria rotacional de 120° e derivados pseudosimétricos semelhantes de fórmula Z divulgados neste documento foram identificados como tendo uma forte afinidade de ligação para NLRX1. Veja as Figuras 1A a 1P. Esses NCEs eram compostos de compostos com um anel de benzeno ou azabenzeno central conectado a três estruturas de anel externo por um único átomo de ligação. As afinidades de ligação de membros da família selecionados são fornecidas nas Figuras 2A a 2D. As afinidades de ligação previstas na respectiva configuração de ligação de energia mais baixa variaram de -8,9 kcal/mol a -11,7 kcal/mol. Todos os compostos apresentados previram afinidades de ligação superiores às do ligante de baixa afinidade NLRX1, ácido púnico, que tem uma afinidade de ligação publicada de -6,2 kcal/mol. Foi observado que um composto de ligação de alta afinidade nesta classe de NCEs é 2,2'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(3-metilpiridina), denominado NX-43. Observou-se que um composto totalmente simétrico de ligação de alta afinidade é 1, 3, 5-tris (6-metilpiridin-2-iloxi) benzeno, denominado NX-13, a -10,6 kcal/mol. A substituição do ligante de oxigênio de NX-13 por um metileno (NX-38), carbonil (NX- 46) ou enxofre (NX-48) reduziu ligeiramente a ligação prevista, mas a ligação ainda estava acima do limite de ligante previsto. Com base nos resultados de ligação e nas propriedades físico-químicas previstas, os compostos foram selecionados desta classe para síntese e teste funcional.
QUÍMICA MEDICINAL Exemplo 2. NX-13
[00182] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de benzeno-1, 3, 5- triol e 2-bromo-6-metilpiridina em dimetilformamida e a mistura de reação foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para se obter 1, 3, 5-tris (6-metilpiridin-2- iloxi) benzeno. HRMN (400 MHz, DMSO-d6): 7,767-7,728 (t, J = 8,0 Hz, 3H), 7,042- 7,024 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 6,849-6,829 (d, J = 8,0 Hz, 3H), 6,667 (s, 3H), 2,352 (s, 9H). Exemplo 3. NX-37
[00183] A síntese de 2-(3,5-bis(6-metilpiridin-2-iloxi)fenoxi)-4,6-dimetilpirimidina (NX-37) foi um processo de cinco etapas conforme detalhado abaixo.
[00184] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 5-bromobenzeno- 1,3-diol e 6-fluoro-2-metilpiridina em dimetilformamida e a mistura de reação foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 6,6'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(2-metilpiridina).
[00185] Carbonato de césio foi adicionado a uma solução de 6,6'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis (2-metilpiridina) em etilenoglicol e a mistura de reação foi aquecida a 120 °C durante 16h. A mistura reacional foi diluída com água e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2-(3,5-bis(6-metilpiridin-2-iloxi)fenoxi)etanol.
[00186] Hidróxido de potássio foi adicionado a uma solução de 2-(3,5-bis(6-
metilpiridin-2-iloxi)fenoxi)etanol em dimetilsulfóxido e foi aquecido a 100 °C durante 3h. A mistura reacional foi diluída com água e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 3,5-bis(6-metilpiridin-2-iloxi)fenol.
[00187] Tricloreto fosfórico foi adicionado a 4,6-dimetilpirimidin-2-ol a 0 °C e foi aquecido a 110 °C durante 16h. O solvente foi evaporado da mistura reacional. A reação foi extinta com água gelada e extraída com acetato de etila. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2-cloro-4,6-dimetilpirimidina.
[00188] Carbonato de potássio foi adicionado a 3,5-bis(6-metilpiridin-2-iloxi)fenol e 2-cloro-4,6-dimetilpirimidina em dimetilformamida e a mistura de reação foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 3h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2-(3,5-bis(6-metilpiridin-2- iloxi)fenoxi)-4,6-dimetilpirimidina. HRMN (400 MHz, CDCl3-d6): 7,56 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 6,89 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 6,83 (d, J = 2,4 Hz, 2H), 6,78-6,77 (m, 2H), 6,72 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 2,46 (s, 6H), 2,40 (s, 6H). Exemplo 4. NX-43
[00189] A síntese de 2,2'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(3-metilpiridina) (NX-43) foi um processo de duas etapas conforme detalhado abaixo.
[00190] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 5-bromobenzeno- 1,3-diol e 2-fluoro-3-metilpiridina em dimetilformamida. A mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(3-metilpiridina).
[00191] Carbonato de césio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(3-metilpiridina), fenol, iodeto de cobre catalítico e dimetil glicina em DMF e a mistura de reação foi irradiada com micro-ondas a 150 °C por 3h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(3-metilpiridina). H RMN (400 MHz, CDCl3-d6): 8,02 (d, J = 3,6 Hz, 2H), 7,50 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,35-7,31 (m, 2H), 7,12-7,10 (m, 3H), 6,93-6,90 (m, 2H), 6,61-6,60 (m, 1H), 6,566-6,56 (t, J = 2,4 Hz, 2H), 2,29 (S, 6H). Exemplo 5. NX-44
[00192] A síntese de 6,6'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(5-metil-3-piridinol) (NX- 44) foi um processo de quatro etapas conforme detalhado abaixo.
[00193] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 5-bromobenzeno- 1,3-diol e 2-fluoro-3-metil-5-nitropiridina e agitado à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-bromo-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(3-metil-5-nitropiridina).
[00194] Carbonato de césio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(3-metil-5-nitropiridina), fenol, iodeto de cobre catalítico e dimetil glicina em DMF e a mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 150 °C durante 3 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(3-metil-5-nitropiridina).
[00195] PtO2 foi adicionado a uma solução agitada de 2,2’-(5-fenoxi-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(3-metil-5-nitropiridina) em metanol. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de hidrogênio durante 2 horas. A reação foi monitorada por LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de leito de celite e concentrou o filtrado sob pressão reduzida para obter 6,6'-(5-fenoxi-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(5-metilpiridin-3-amina).
[00196] Nitrito de sódio foi adicionado a uma solução agitada de 6,6'-(5-fenoxi-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(5-metilpiridin-3-amina) em ácido sulfúrico aquoso a 80 °C durante 1h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 6,6'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(5-metil-3-piridinol). Exemplo 6. NX-45
[00197] A síntese de 6,6’,6’’-(benzeno-1,3,5-tri-iltris(oxi))tris(5-metilpiridin-3-amina) (NX-45) foi um processo de duas etapas conforme detalhado abaixo.
[00198] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de benzeno-1, 3, 5- triol e 2-fluoro-3, 6-dimetil-5-nitropiridina em dimetil forma amida e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 1,3,5-tris(3-metil- 5-nitropiridin-2-iloxi)benzeno.
[00199] PtO2 foi adicionado a uma solução agitada de 1, 3, 5-tris (3-metil-5- nitropiridin-2-iloxi) benzeno em metanol. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de hidrogênio durante 2 horas. A reação foi monitorada por LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de leito de celite e concentrou o filtrado sob pressão reduzida para obter 6,6',6’’-(benzeno-1,3,5-tri-iltris(oxi))tris(5-metilpiridin- 3-amina). H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 7,390 (d, J = 2,4 Hz, 3H), 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 3H), 6,019 (s, 3H), 5,130 (br s, 6H), 2,051 (s, 9H). Exemplo 7. NX-50
[00200] A uma solução agitada de benzeno-1,3,5-triol em DMSO foi adicionado em porções a NaH durante um período de 2 horas. Depois disso, 2-bromo-3-metil piridina foi adicionada gota a gota e deixada a agitar durante a noite a 150 °C. O progresso da reação foi monitorado. Após a conversão do material de partida, a mistura de reação foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etila. A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 1, 3, 5-tris (3-metilpiridin-2-iloxi) benzeno. Exemplo 8. NX-53
[00201] A síntese de 2,2'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) (NX-53) foi um processo de duas etapas conforme detalhado abaixo.
[00202] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 5-bromobenzeno- 1,3-diol e 2-fluoro-6-metilpiridina em dimetilformamida. A mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina).
[00203] Carbonato de césio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina), fenol, iodeto de cobre catalítico e dimetil glicina em DMF e a mistura de reação foi irradiado com micro-ondas a 150 °C por 3h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-fenoxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina). Exemplo 9. NX-54
[00204] A síntese de 2,2'-(5-(piridin-2-iloxi)-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) (NX-54) foi um processo de quatro etapas conforme detalhado abaixo.
[00205] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 5-bromobenzeno- 1,3-diol e 2-fluoro-6-metilpiridina em dimetilformamida. A mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina).
[00206] Carbonato de césio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) e etilenoglicol e a mistura de reação foi irradiada com micro-ondas a 130 °C durante 6h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-etanoloxi-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina).
[00207] Hidróxido de potássio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-etanoloxi- 1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) em dimetilsulfóxido e a mistura de reação foi agitada a 120 °C. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(1,3-fen-5-ol)bis(oxi)bis(6- metilpiridina).
[00208] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(1,3-fen-5- ol)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) e 6-cloropiridina em dimetilformamida. A mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-(piridin-2-iloxi)-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina). Exemplo 10. NX-55
[00209] A síntese de 2,2'-(5-(6-metilfenoxi)-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) (NX-55) foi um processo de duas etapas conforme detalhado abaixo.
[00210] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 5-bromobenzeno- 1,3-diol e 2-fluoro-6-metilpiridina em dimetilformamida. A mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina).
[00211] Carbonato de césio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina), 6-metilfenol, iodeto de cobre catalítico e dimetil glicina em DMF e a mistura de reação foi irradiada com micro-ondas a 150 °C durante 3h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-(6-metilfenoxi)-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina). Exemplo 11. NX-56
[00212] A síntese de 2,2'-(5-(fen-6-ol)oxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) (NX-56) foi um processo de quatro etapas conforme detalhado abaixo.
[00213] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 5-bromobenzeno-
1,3-diol e 2-fluoro-6-metilpiridina em dimetilformamida. A mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina).
[00214] Carbonato de césio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-bromo-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) e etilenoglicol e a mistura de reação foi irradiada com micro-ondas a 130 °C durante 6h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-etanoloxi-1,3- fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina).
[00215] Hidróxido de potássio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(5-etanoloxi- 1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) em dimetilsulfóxido e a mistura de reação foi agitada a 120 °C. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(1,3-fen-5-ol)bis(oxi)bis(6- metilpiridina).
[00216] Carbonato de potássio foi adicionado a uma solução de 2,2'-(1,3-fen-5- ol)bis(oxi)bis(6-metilpiridina) e 6-cloropiridin-2-ol em dimetilformamida. A mistura reacional foi irradiada com micro-ondas a 200 °C durante 4 h. A mistura reacional foi diluída com água gelada e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica combinada foi seca com sulfato de sódio e evaporada sob pressão reduzida para obter 2,2'-(5-(fen-6-ol)oxi-1,3-fenileno)bis(oxi)bis(6-metilpiridina).
LIGAÇÃO DO RECEPTOR Exemplo 12. Ligação de ressonância de plasma de superfície a NLRX1
INTRODUÇÃO
[00217] A triagem virtual e a experimentação in silico são meios valiosos para identificar e priorizar estruturas de interesse ao projetar novos ligantes de pequenas moléculas para um alvo terapêutico. Para validar esses resultados, existem vários métodos in vitro para determinar a afinidade de uma pequena molécula para a proteína de interesse. Um método particular é a ressonância de plasmão de superfície, que é a capacidade de estimar a ligação em estado estacionário fluindo uma suspensão de ligante sobre a proteína purificada imobilizada. Este método foi usado para avaliar potenciais ligantes NLRX1.
MÉTODOS
[00218] Produção e purificação de NLRX1. NLRX1 humano (www.uniprot.org; UniProtKB - Q86UT6 (NLRX1_HUMAN)) foi clonado em E. coli, amplificado e transfectado em Pichia pastoris. P. pastoris foi semeado em meio seletivo de adenina. Colônias transfectadas estáveis foram selecionadas e cultivadas em caldo YPD a 30 °C por 24 horas, agitação de 240 RPM. A cultura inicial foi usada para inocular meio de base (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 1% de sorbitol, 2% de base de nitrogênio de levedura) contendo biotina e tamponado com fosfato de potássio. O meio de base inoculado foi incubado durante 48 horas a 30 °C, 240 RPM. P. pastoris foi então sedimentado por centrifugação e ressuspenso em meio de expressão (1% de sorbitol, 2% de base de nitrogênio de levedura) contendo biotina e tamponado com fosfato de potássio. A cultura foi induzida diariamente para produção de proteína através da adição de metanol e incubada por um total de 4 dias a 28 °C, 240 RPM. Após a incubação, as células foram sedimentadas por centrifugação e lisadas por sonicação. A proteína NLRX1 recombinante foi purificada por cromatografia líquida de proteína rápida (AktaPrime) usando cromatografia de afinidade de metal imobilizado. As frações da proteína foram eluídas em alíquotas de 1 ml e avaliadas quanto ao conteúdo de NLRX1. Uma proteína NLRX1 mutada foi gerada usando métodos semelhantes para interromper a ligação dentro do local de ligação previsto por meio da alteração de quatro resíduos em alanina (D677A, F680A, F681A e E684A).
[00219] Ressonância de plasmão de superfície. Um Biacore T200 foi usado para avaliar a ligação à proteína NLRX1. NLRX1-WT e NLRX1-Mutant foram usados como proteínas para imobilizar no chip sensor CM5. NLRX1-WT foi diluído em tampão de acetato de sódio 10 mM a pH 4,0 e imobilizado na célula de fluxo a um nível de ~3700
RU, usando química de acoplamento de amina padrão. NLRX1-Mutant foi diluído em tampão de acetato de sódio 10 mM a pH 4,0 e imobilizado na célula de fluxo a um nível de ~3100 RU, usando química de acoplamento de amina padrão. MOPS 20 mM, NaCl 150 mM, acetato de sódio 5 mM, EDTA 1 mM, 0,05% Tween-20, tampão de pH 8,0 (tampão de corrida) foi usado como o tampão de corrida de imobilização. Com base nos valores de resposta imobilizados, foram calculados os valores teóricos de Rmax. Os valores Rmax assumem um mecanismo de interação 1:1. A cinética noturna foi realizada para todos os analitos que se ligam às proteínas imobilizadas. Os experimentos cinéticos foram realizados na presença de tampão de corrida + 1% DMSO. A vazão de todas as soluções foi mantida em 50 μl/min. As concentrações do analito foram 0 µM, 2,5 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM e 40 µM.
RESULTADOS
[00220] A ressonância de plasmão de superfície validou a ligação prevista de NX- 13, NX-37 e NX-43 a NLRX1 (Figura 3). Em particular, NX-13, NX-37 e NX-43 foram identificados como pequenas moléculas que se ligam a NLRX1 com diferentes afinidades e propriedades físico-químicas. A perda de ligação à proteína NLRX1 mutada (Figura 3) validou que a ligação prevista é o principal local de ligação desses ligantes. NX-13 ligou-se à proteína NLRX1 com uma KD de 30,2 µM (Figura 3).
ESTUDOS EXPERIMENTAIS Exemplo 13. Triagem imunológica in vitro
INTRODUÇÃO
[00221] Central para a patogênese de muitas doenças autoimunes é a disfunção das células T CD4+ auxiliares [3]. Essas células são importantes na manutenção da saúde de um indivíduo, amplificando as respostas imunológicas e promovendo a homeostase. No entanto, no caso de doença autoimune e inflamatória, as células T CD4+ auxiliares podem se tornar hiperativas, ativadas na ausência de estímulos ou incapazes de resolver a inflamação. Nesses cenários, as terapêuticas que podem mitigar ou prevenir a inflamação são tratamentos valiosos para o manejo da doença. Nesse sentido, validamos o potencial terapêutico funcional dos ligantes antiinflamatórios NLRX1 nesse tipo de célula.
[00222] Em contraste com as doenças autoimunes, certas doenças infecciosas e câncer requerem um aumento nas respostas inflamatórias para controlar ou eliminar de forma eficiente a causa da doença [30]. Portanto, os agentes terapêuticos podem influenciar as respostas nas células T CD4+ auxiliares para aumentar as respostas imunológicas e conduzir a inflamação. Nesses casos, aumentos nos tipos de células efetoras, como células T auxiliares 1 e T auxiliares 17, podem beneficiar o indivíduo por meio do aumento da produção de IFNγ, TNFα, IL-17 e IL-6. Conforme evidenciado por resultados publicados de NLRX1 em modelos de câncer [17, 18, 21], a modulação da via NLRX1 pode gerar essas respostas.
MÉTODOS
[00223] Cultura de células. Os baços foram excisados de camundongos C57BL/6. Os baços foram esmagados entre as extremidades congeladas de lâminas de microscópio e filtrados para fornecer uma suspensão celular. Os glóbulos vermelhos foram lisados por lise hipotônica. As células restantes foram lavadas e filtradas. As células T CD4+ foram enriquecidas na suspensão usando seleção negativa baseada em classificação magnética. As células foram coletadas e plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com anti-CD3 e cultivadas na presença de NX-13, NX-37, NX-43, NX-44 ou NX-50 a 0, 0,1, 1 ou 10 micromolar; NX-53, NX-54, NX-55 ou NX-56 a 0, 0,1 ou 1 micromolar; ou NX-45 a 10, 50 ou 100 nanomolar por 48h. Durante as últimas 6h de cultura, as células foram estimuladas com forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) e ionomicina.
[00224] Análise imunológica. As células foram coletadas de placas de 96 poços e coradas com um coquetel de anticorpos para imunofenotipagem por citometria de fluxo. O sobrenadante da cultura foi coletado e testado quanto às concentrações de citocinas por arranjo de esferas citométricas. Os dados foram capturados em um BD FACS Celesta e analisados usando o FacsDiva.
RESULTADOS
[00225] O NX-13 reduziu as proporções de células T CD4+ produtoras de IFNγ e produtoras de TNFα em cultura de células de tipo selvagem (Figuras 4A e 4B). Na ausência de NLRX1, esses efeitos foram perdidos (Figuras 4A e 4B).
[00226] O NX-45 foi testado em 10, 50 e 100 nanomolar in vitro (Figuras 5A e 5B). Em células T CD4+, NX-45 reduz as células TNFα+ (Figura 5B) e IFNγ+ (Figura 5A). A redução significativa nas células TNFα+ ocorre em concentrações de 10 nM e superiores, enquanto a redução significativa nas células IFNγ+ ocorre em concentrações de 50 nM e superiores. O NX-50 também diminuiu as células IFNγ+ e TNFα+, embora em concentrações mais elevadas (Figuras 5C e 5D). O NX-55 forneceu apenas uma pequena diminuição nas células produtoras de IFNγ (Figura 6I) e NX-54 forneceu efeitos mínimos em altas concentrações (Figura 6H).
[00227] A partir de uma regulação negativa de citocinas inflamatórias, esses resultados indicam que NX-13, NX-45 e NX-50 são ativadores de NLRX1. Dada a perda de atividade em células deficientes em NLRX1, a família de moléculas atua através da via NLRX1. Combinado com resultados de ligação in silico e in vitro, as ações por meio da via NLRX1 são um resultado da ligação direta a NLRX1.
[00228] Os NX-37, NX-43, NX-44 são ambos eficazes para aumentar as respostas inflamatórias com assinaturas distintas (Figuras 6A-6F). Em ambos os casos, NX-37 (Figuras 6A e 6B), NX-43 (Figuras 6C e 6D), NX-44 (Figuras 6E e 6F) aumentaram a proporção de TNFα (Figuras 6B, 6D, 6F) e células produtoras de IFNγ (Figura 6A, 6C, 6E), conforme medido por citometria de fluxo. Os NX-53 e NX-56 aumentaram fracamente as células produtoras de IFNγ (Figuras 6G e 6J). Observou-se que o NX- 43 tem um efeito maior do que o NX-37 nas células produtoras de TNFα e IFNγ, enquanto o NX-37 apresenta efeitos dependentes da dose dentro da faixa testada. Nenhuma das moléculas pequenas provocou uma mudança nas células produtoras de IL-10.
[00229] Com base nos resultados descritos e no conhecimento publicado sobre a via NLRX1, NX-37, NX-43 e NX-44 funcionam como inibidores específicos de NLRX1 por meio de ligação direta. O aumento observado nas respostas inflamatórias com o tratamento desses inibidores está de acordo com a observação de que uma deficiência em NLRX1 resulta em maior inflamação. Exemplo 14. Uso de NX-13 em um modelo agudo de DII
INTRODUÇÃO
[00230] A doença inflamatória intestinal é uma doença multifatorial com muitos processos patológicos iniciados por ações ou disfunção da barreira epitelial [31]. Um modelo animal proeminente e aceito da doença é induzido pela administração de sulfato de dextrano de sódio (DSS) na água potável de camundongos. A ingestão de DSS atua para romper e destruir a barreira epitelial no trato gastrointestinal distal, em particular no cólon. A ruptura da barreira epitelial permite a infiltração do microbioma na mucosa do cólon e o recrutamento e ativação subsequentes de células imunes. Este modelo permite a avaliação de novas terapêuticas em um sistema controlado de inflamação intestinal.
[00231] Anteriormente, o modelo DSS foi usado para determinar que camundongos deficientes em NLRX1 tinham piora da gravidade da doença em comparação com camundongos de tipo selvagem que expressam NLRX1 [3, 4]. Além disso, quando a expressão de NLRX1 em camundongos de tipo selvagem foi avaliada ao longo do curso de tempo de DSS, NLRX1 foi suprimido em períodos de alta inflamação, sugerindo que a ativação farmacológica da molécula poderia proteger contra essa expressão diminuída e induzir ações anti-inflamatórias benéficas.
MÉTODOS
[00232] Modelo DSS. Os camundongos receberam 8% (p/v) de DSS em água potável por sete dias para induzir a ruptura da camada epitelial. No início do projeto, os camundongos tinham 8 semanas de idade e começaram a dosagem 24 horas após serem colocados em DSS a 8%. Os camundongos foram pesados e avaliados diariamente quanto aos sintomas da doença (diarreia, sangramento retal, inflamação retal, comportamento geral).
[00233] Administração do tratamento. O NX-13 foi preparado dentro de uma solução de metilcelulose a 0,5% (12-15 cP). A dosagem utilizada foi de 20 mg/kg administrada uma vez ao dia. Os camundongos foram pesados semanalmente para atualizar a formulação de dosagem. A dosagem foi calculada com base nos pesos corporais médios para cada sexo. A dosagem oral foi fornecida por gavagem orogástrica de dosagem em volume de 0,2 ml.
[00234] Citometria de fluxo. Os cólons foram coletados em tampão RPMI/FBS contendo colagenase (300U/ml) e DNase (50U/ml) para digestão. Os tecidos foram digeridos durante 60 minutos sob agitação a 37 °C. As suspensões celulares resultantes foram filtradas através de filtros de 100 µm, centrifugadas (300 xg, 8 min) e lavadas em RPMI fresco. Após a filtração das suspensões de células únicas resultantes, as células imunes foram purificadas por gradiente de Percoll de Percoll contendo 40% de células sobreposto em solução de Percoll a 70%. Após centrifugação, a interfase foi coletada e lavada para obter frações celulares da lâmina própria do cólon enriquecidas. As células foram marcadas com misturas de anticorpos extracelulares (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK1.1, CD25, F4/80, CD11b, Gr1, CX3CR1, CD64) e anticorpos intracelulares (Tbet, RORγT, FOXP3, IFNγ, IL17, IL10) em uma coloração viva sequencial em placas de 96 poços. Os dados foram adquiridos com o uso de um citômetro de fluxo FACS Celesta com o software FACSDiva.
[00235] Expressão gênica. O RNA total do cólon e das células foi gerado com o uso do minikit Qiagen RNeasy. O cDNA foi gerado com o uso do kit de síntese de cDNA BioRad iScript. As curvas padrão foram geradas por diluição em série do produto purificado a partir de uma reação de PCR padrão com Taq DNA polimerase seguida por purificação com o uso do kit de purificação Qiagen MinElute PCR. Os níveis de expressão foram obtidos a partir de PCR quantitativo em tempo real com SybrGreen supermix em um termociclador BioRad CFX96 seguido de normalização para expressão de β-actina.
RESULTADOS
[00236] O tratamento oral com NX-13 diminui a atividade da doença em camundongos do tipo selvagem desafiados com DSS. A atividade da doença neste modelo de colite é uma pontuação resumida da perda de peso, presença e gravidade do sangramento retal, consistência fecal, sintomas de dor e comportamento geral de um camundongo. O NX-13 reduziu a atividade da doença ao longo do curso do desafio com uma redução máxima observada em 50% no dia 6 (Figura 7A).
[00237] Dentro do modelo DSS, a doença é iniciada no epitélio, mas modulada pela presença e abundância de células imunes na lâmina própria do cólon. Os principais condutores de inflamação e dano ao tecido neste modelo são células T auxiliares 1 e neutrófilos. O tratamento oral com NX-13 reduziu significativamente o número de células Th1 e neutrófilos na lâmina própria do cólon, conforme medido por citometria de fluxo. No dia 7 do desafio DSS, ambos os neutrófilos (Figura 7B) e células Th1 (Figura 7C) foram reduzidos em mais de 50%. No entanto, o NX-13 não reduziu o número de células T CD4+ regulatórias FOXP3+, que são um tipo de célula primária no cólon responsável pela homeostase do tecido.
[00238] O RNA foi isolado de todo o cólon do veículo e camundongos tratados com NX-13 no dia 7 do desafio com DSS. O RNA foi usado para medir a expressão gênica de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias (Figuras 8A-D). O tratamento com NX- 13 reduziu a expressão de Ifng (Figura 8A), Tnfa (Figura 8C) e Il17 (Figura 8D) em todo o cólon, enquanto aumenta a expressão de Il10 (Figura 8B). É importante ressaltar que IFNγ e TNFα são dois motores primários de inflamação em DII. A redução dessas citocinas no nível do cólon após o tratamento oral com NX-13 é um marcador chave de eficácia. Exemplo 15. Uso de NX-13 em um modelo crônico de DII
INTRODUÇÃO
[00239] A doença de Crohn e a colite ulcerosa são doenças crônicas com períodos esporádicos de crises inflamatórias não resolvidas, resultando em dano progressivo à mucosa intestinal [32, 33]. A perda de Mdr1a em camundongos prejudica a capacidade das células epiteliais de processar corretamente e efluir produtos residuais, levando à colite espontânea [34]. A colite nesses camundongos é crônica e penetra em todas as camadas do intestino. O modelo Mdr1a-/- é, portanto, um modelo ideal para testar a administração crônica de um medicamento para a indução e manutenção da redução da gravidade da doença [35] devido ao seu uso de animais imunocompetentes, a disfunção intrínseca dos mecanismos das células epiteliais, respostas inflamatórias proeminentes e a relevância translacional do gene MDR1 como um alelo de risco emergente na DII humana [36].
MÉTODOS
[00240] Modelo Mdr1a-/-. Os camundongos deficientes em MDR1a desenvolvem colite espontaneamente. MDR1a-/- começou a receber tratamento com NX-13 (oral, 20 mg/kg) com 4 semanas de idade e continuou o tratamento até 10 semanas de idade. Os camundongos foram pesados e pontuados diariamente.
[00241] Administração do tratamento. O NX-13 foi preparado dentro de uma solução de metilcelulose a 0,5% (12-15 cP). A dosagem utilizada foi de 20 mg/kg administrada uma vez ao dia. Os camundongos foram pesados semanalmente para atualizar a formulação de dosagem. A dosagem foi calculada com base nos pesos corporais médios para cada sexo. A dosagem oral foi fornecida por gavagem orogástrica de dosagem em volume de 0,2 ml.
[00242] Citometria de fluxo. Os cólons foram coletados em tampão RPMI/FBS contendo colagenase (300U/ml) e DNase (50U/ml) para digestão. Os tecidos foram digeridos durante 60 minutos sob agitação a 37 °C. As suspensões celulares resultantes foram filtradas através de filtros de 100 µm, centrifugadas (300 xg, 8 min) e lavadas em RPMI fresco. Após a filtração das suspensões de células únicas resultantes, as células imunes foram purificadas por gradiente de Percoll de Percoll contendo 40% de células sobreposto em solução de Percoll a 70%. Após centrifugação, a interfase foi coletada e lavada para obter frações celulares da lâmina própria do cólon enriquecidas. As células foram marcadas com misturas de anticorpos extracelulares (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK1.1, CD25, F4/80, CD11b, Gr1, CX3CR1, CD64) e anticorpos intracelulares (Tbet, RORγT, FOXP3, IFNγ, IL17, IL10) em uma coloração viva sequencial em placas de 96 poços. Os dados foram adquiridos com o uso de um citômetro de fluxo FACS Celesta com o software FACSDiva.
[00243] Histopatologia. Cortes de cólon coloridos com H&E foram preparados a partir de porções de dois pontos coletados em 10% de formalina tamponada e embebidos em parafina. As lâminas foram examinadas por um patologista veterinário certificado por meio de um microscópio Olympus e as imagens foram coletadas com o software Image-Pro. As amostras foram pontuadas (0 a 4) para infiltração leucocítica, erosão epitelial e espessamento da mucosa.
RESULTADOS
[00244] O tratamento oral com NX-13 diminui a atividade da doença em camundongos Mdr1a-/-. A atividade da doença neste modelo de colite é uma pontuação resumida da perda de peso, presença e gravidade do sangramento retal, consistência fecal, sintomas de dor e comportamento geral de um camundongo. O NX-13 reduziu a atividade da doença ao longo do curso do desafio com uma redução máxima observada de 70% na semana seis de tratamento (Figura 9).
[00245] Em camundongos MDR1a-/-, o NX-13 oral reduziu muito a patologia do cólon (Figuras 10A e 10B). Após seis semanas de tratamento, o NX-13 protegeu contra o desenvolvimento de agregados de leucócitos e espessamento da mucosa. Além disso, o NX-13 reduziu a infiltração leucocitária geral e a erosão epitelial.
[00246] O NX-13 oral altera significativamente as proporções de células imunes dentro da lâmina própria do cólon (Figuras 11A e 10B). Em particular, NX-13 reduz as proporções de Th1 (Figura 11A) e neutrófilos (Figura 11B), dois subconjuntos principais de células responsáveis pela inflamação na mucosa do cólon. Além disso, o número de macrófagos F4/80hi, bem como células T produtoras de IL-17 e IFNγ foram amplamente reduzidos com o tratamento com NX-13. Proporções de células T CD4+ regulatórias (Treg) (Figura 11C) também aumentaram no cólon. Esses achados indicam que o NX-13 é capaz de restaurar o equilíbrio entre as respostas inflamatórias e anti-inflamatórias no cólon de camundongos colíticos. Exemplo 16. Eficácia do NX-13 em células mononucleares do sangue periférico humano
INTRODUÇÃO
[00247] Os humanos afetados pela doença de Crohn e colite ulcerativa apresentam células imunes hiperativas com alta prevalência de subconjuntos inflamatórios localmente no trato gastrointestinal e sistemicamente no sangue. Portanto, as células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com DII frequentemente exibem muitas das respostas inflamatórias robustas observadas na mucosa GI devido ao ambiente ao qual estão expostas e às anormalidades genéticas que estão presentes em todas as células do indivíduo. A aplicação translacional de NX-13 foi testada em PBMCs de pacientes com colite ulcerativa e doença de Crohn para determinar o benefício anti-inflamatório do tratamento com NX-13 em células humanas.
MÉTODOS
[00248] Isolamento de PBMC. As amostras foram obtidas de doadores do sexo masculino e feminino classificados clinicamente como tendo doença moderada a grave. Idade e medicamentos atuais não foram usados como critérios de exclusão. O sangue total foi coletado em tubos de vácuo heparinizados. O sangue total foi diluído 1:3 volumes com solução salina tamponada com fosfato estéril. LeucoSep (Greiner) foram preparados pela adição de meio de separação de linfócitos seguido por 15 segundos de centrifugação à velocidade máxima. Sangue total diluído foi adicionado aos tubos LeucoSep. Após centrifugação (2.000 xg, 20 min), PBMCs foram coletados da interfase por pipeta de Pasteur. Os glóbulos vermelhos restantes foram lisados por lise hipotônica e a suspensão foi filtrada através de um filtro de células de 100 µM. PBMCs foram lavados e ressuspensos em meios de cultura de células estéreis, RPMI contendo 10% de soro fetal bovino, 2,5% de solução de Hepes, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de piruvato de sódio e 1% de aminoácidos essenciais (RPMI completo).
[00249] Cultura de células. As células alvo foram incubadas durante 24h em meio de cultura RPMI completo a 37 °C. As células foram incubadas na presença de NX- 13 variando em concentração de 1 nM a 100 nM. A solução estoque de NX-13 foi preparada a 100 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) e diluída até a concentração desejada em meio de cultura. As concentrações de DMSO foram ajustadas para serem iguais em todas as doses e tratamentos com veículo. Seis horas antes do ensaio, as células foram estimuladas com 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) e ionomicina para estimular a ativação celular. As células foram testadas para os dados desejados em 24 h.
[00250] Citometria de fluxo. Antes da coleta, as células foram incubadas BD GolgiStop (2 µl de GolgiStop para 3 ml de meio total) para permitir o acúmulo intracelular de citocinas. As células foram coradas ao vivo com extracelular (CD45, CD3, CD4, CD8, CD11b) e intracelular (FOXP3, IL-10, IL-4, IFNγ, TNFα) de maneira sequencial. Os dados foram adquiridos em um BD FACs Celesta e analisados usando FACSDiva. Células não viáveis e não singletes foram excluídas da análise. Os dados são apresentados como porcentagem de células CD45 + ou % viáveis, singletes.
RESULTADOS
[00251] Em amostras de colite ulcerosa, o NX-13 diminuiu a porcentagem de TNFα (Figura 12A) e IFNγ (Figura 12B) produtoras de células T CD4+, com reduções significativas observadas em ambas as populações em concentrações de 10 nM e superiores. Embora não tenham sido observadas reduções significativas a 1 nM em TNF, as tendências diminuídas foram consistentes com aquelas observadas em concentrações mais altas (Figura 12A). Em contraste, uma diminuição significativa em IFNγ foi observada mesmo a 1 nM (Figura 12B). Além disso, o NX-13 reduziu a quantidade de TNFα presente em cada célula conforme medido pela intensidade fluorescente média de uma maneira dependente da dose.
[00252] Semelhante aos testes de UC, NX-13 diminuiu potentemente as células T CD4+ produtoras de TNFα e IL-4 em concentrações tão baixas quanto 10 nM em PBMCs de pacientes com doença de Crohn (Figuras 13A e 13B). Além disso, o tratamento com NX-13 aumentou a porcentagem de células T IL10+ CD4+ em concentrações de 50 nM e superiores (Figura 13C), sugerindo que NX-13 é capaz de atuar de maneira pró-regulatória além do efeito anti-inflamatório direto em células T CD4+ efetoras. Diminuições dependentes da dose foram observadas em células IFNγ+ acima de NX-13 50 nM (Figura 13D).
[00253] Esses resultados indicam que o NX-13 é uma pequena molécula viável para a ativação de NLRX1 em células humanas e para a inibição de respostas inflamatórias. Exemplo 17. Eficácia do NX-43 em um modelo de adenocarcinoma de camundongo
INTRODUÇÃO
[00254] Noventa e cinco por cento dos casos de câncer colorretal são adenocarcinomas. Os adenomas ou pólipos, se não identificados em colonoscopias de rotina, podem se espalhar para a parede intestinal a partir do epitélio e, eventualmente, metastatizar após trafegar para o sangue ou linfa. Além do câncer de cólon em estágio 1, que pode ser comumente tratado por excisão de um pólipo ou área afetada, a taxa de sobrevivência de cinco anos é desanimadora, variando de 63- 87% para cânceres em estágio 2 a 11% para cânceres em estágio 4, de acordo com o American Cancer Society. Evidências claras se acumularam de que fatores facilitadores além da instabilidade genética, proliferação ilimitada e resistência apoptótica são necessários no desenvolvimento do câncer. Esses fatores, como angiogênese local, metabolismo alterado e evasão imunológica, levaram a uma nova geração de terapêuticas do câncer com capacidade de melhorar o prognóstico em estágios intermediários e avançados. Como um regulador imunológico com função importante nas células imunológicas e epiteliais do intestino, o NLRX1 pode servir como um alvo potente para o tratamento do câncer colorretal.
MÉTODOS
[00255] Modelo de camundongo. Camundongos BALB/c adultos foram injetados com 5 x 106 células de carcinoma CT26 por via subcutânea no flanco traseiro. Os camundongos foram tratados diariamente com NX-43 a 40 mg/kg via gavagem começando no dia 9. Os camundongos foram pesados diariamente e o diâmetro do tumor foi medido a cada 3 dias até o dia 21. Os tumores foram coletados e pesados na necropsia. Um segundo modelo de camundongo foi usado. Os camundongos APCmin/+ receberam DSS em água potável começando com 5 semanas de idade. Os camundongos foram desafiados com DSS por um total de 5 dias antes do retorno da água potável padrão. Após DSS, os camundongos foram tratados com NX-43 (40 mg/kg) por gavagem oral por quatro semanas. Após quatro semanas, os cólons foram excisados e lavados. O número de pólipos foi contado e os pesos do cólon foram obtidos.
[00256] Expressão gênica. O RNA total de tumores e nódulos linfáticos pode ser gerado usando o mini kit Qiagen RNeasy. O cDNA pode ser gerado usando o kit de síntese de cDNA BioRad iScript. As curvas padrão foram geradas por diluição em série do produto purificado a partir de uma reação de PCR padrão com Taq DNA polimerase seguida por purificação com o uso do kit de purificação Qiagen MinElute PCR. Os níveis de expressão foram obtidos a partir da PCR quantitativa em tempo real com a supermistura SybrGreen em um termociclador BioRad CFX96 seguido de normalização para expressão da β-actina. A expressão do gene pode ser medida para genes que marcam a ativação imune, como citocinas inflamatórias ou receptores de superfície, supressão imune, como CTLA-4, PD-1 ou ARG-1, e crescimento tumoral e metástase.
[00257] Histopatologia. As seções de tumor e linfonodos corados com H&E podem ser preparadas a partir de tecido coletado em formalina tamponada a 10% e embebido em parafina. As lâminas foram examinadas por um patologista veterinário certificado por meio de um microscópio Olympus e as imagens foram coletadas com o software Image-Pro. As amostras podem ser pontuadas e avaliadas quanto à presença de leucócitos infiltrantes de tumor, áreas de necrose e proporção de células tumorais em proliferação.
[00258] Citometria de fluxo. Os tumores e nódulos linfáticos podem ser coletados em tampão RPMI/FBS contendo colagenase (300U/ml) e DNase (50U/ml) para digestão. Os tecidos podem ser digeridos durante 60 minutos sob agitação a 37 °C. As suspensões celulares resultantes podem ser filtradas através de filtros de 100 µm, centrifugadas (300 xg, 8 min) e lavadas em RPMI fresco. Após a filtração das suspensões de células únicas resultantes, as células imunes podem ser purificadas por gradiente de Percoll de Percoll contendo células 40% sobrepostas em solução de
Percoll a 70%. Após a centrifugação, a interfase pode ser coletada e lavada para obter frações de células imunes enriquecidas. As células foram marcadas com misturas de anticorpos extracelulares (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK1.1, CD25, F4/80, CD11b, Gr1, CX3CR1, CD64, CD40, CTLA4) e anticorpos intracelulares (Tbet, RORγT, FOXP3, IFNγ, IL17, IL10, granzima B, iNOS) em uma coloração viva sequencial em placas de 96 poços. Os dados foram adquiridos com o uso de um citômetro de fluxo FACS Celesta com o software FACSDiva.
RESULTADOS
[00259] O modelo de tumor sólido CT26 é um modelo altamente imunogênico de carcinoma, tornando-o um modelo valioso na avaliação de novas terapêuticas. Os inibidores de NLRX1, como o NX-43, reduzem o tamanho do tumor em relação aos controles não tratados (Figuras 14A e 14B). Significativamente, a redução no diâmetro do tumor foi observada em menos de 10 dias após o início do tratamento com NX-43. Entretanto, após 12 dias de tratamento, observou-se que a massa tumoral global estava reduzida em mais de 70%. No modelo APCmin/+ de câncer colorretal (Figuras 15A e 15B), o tratamento pós-inflamação com NX-43 reduziu o número de pólipos do cólon e a carga global do tumor (conforme evidenciado pelo peso do cólon). Histologicamente, estima-se que esses efeitos se correlacionem com proporções aumentadas de leucócitos infiltrantes de tumor. Esstima-se que a expressão dos genes de ativação imunológica aumente, enquanto os genes supressores devem ser regulados para baixo. Por citometria de fluxo, estima-se que o número de tipos de células supressoras, como Tregs ou células supressoras derivadas de mieloides, diminua, e o número de células T citotóxicas ativadas e células de granzima B+ aumentem. Exemplo 18. Eficácia do NX-43 em um modelo de infecção viral
INTRODUÇÃO
[00260] Como um sensor de ácido nucleico viral e um modulador das vias MAVS e STING, o NLRX1 é fundamental para a resposta aos vírus. Na verdade, a importância de NLRX1 na resposta viral nativa foi identificada em modelos de vírus influenza,
hepatite C, HIV e herpes [7, 9, 12, 14]. Embora os meandros da resposta imune geral variem entre os vírus, é claro que os mecanismos mediados por NLRX1 estão presentes em cada um com efeitos a jusante na expressão de interferons do tipo I e na depuração viral. Nesse sentido, prevê-se que a inibição de NLRX1 por inibidores específicos ative a resposta imune, evite a evasão e imunossupressão do hospedeiro e inicie vias de eliminação viral. Para validar a eficácia do NX-43, um modelo de camundongo da infecção pelo vírus da gripe pode ser usado.
MÉTODOS
[00261] Modelo de camundongo. Camundongos C57BL/6 do tipo selvagem com oito a dez semanas de idade podem ser anestesiados por inalação de isoflurano. Os camundongos podem ser infectados com influenza A (H1N1) por via intranasal a um título de desafio de 350 pfu/camundongo [37]. Os camundongos podem ser tratados diariamente com NX-43 em doses de 10, 20 e 40 mg/kg por via oral por gavagem ou por injeção intravenosa na veia da cauda. Os camundongos podem ser pesados e avaliados diariamente ao longo de 14 dias. Os camundongos podem ser sacrificados nos dias 3, 7, 11 e 14 para medir os títulos do vírus no pulmão e a geração de respostas imunes por expressão gênica e citometria de fluxo.
[00262] Título viral. Homogenatos de pulmão podem ser preparados a partir de camundongos não tratados e tratados com NX-43. As células MDCK podem ser cultivadas até a confluência em placas de seis poços. As células podem ser lavadas de meio contendo soro antes da exposição. As diluições em série da amostra de vírus podem ser feitas em meio de crescimento sem soro contendo a fração V BSA. As células podem ser incubadas com 1 ml de diluição de vírus por 1h a 37 °C. O sobrenadante pode ser removido e as células podem ser lavadas. As células podem ser cobertas com uma mistura de ágar MEM e incubadas por 72h. A cobertura pode ser removida e os poços podem ser tingidos com violeta cristal. A diluição mais baixa com pelo menos 50 placas pode ser contada.
[00263] Expressão gênica. O RNA total do pulmão pode ser gerado usando o mini kit Qiagen RNeasy. O cDNA pode ser gerado usando o kit de síntese de cDNA BioRad iScript. As curvas padrão foram geradas por diluição em série do produto purificado a partir de uma reação de PCR padrão com Taq DNA polimerase seguida por purificação com o uso do kit de purificação Qiagen MinElute PCR. Os níveis de expressão foram obtidos a partir da PCR quantitativa em tempo real com a supermistura SybrGreen em um termociclador BioRad CFX96 seguido de normalização para expressão da β-actina. A expressão do gene pode ser medida para IL-6, interferon-alfa, interferon-beta, Stat2, Oas1a, RIG-I e MAVS.
[00264] Citometria de fluxo. Os pulmões podem ser cortados em pedaços pequenos e coletados em tampão RPMI/FBS/CaCl2 contendo colagenase (300U/ml) e DNase (50U/ml) para digestão. Os tecidos podem ser digeridos durante 60 a 90 minutos sob agitação a 37 °C. As suspensões celulares resultantes podem ser filtradas através de filtros de 100 µm, centrifugadas (300 xg, 8 min) e lavadas em RPMI fresco. Os glóbulos vermelhos podem ser lisados por lise hipotônica e removidos por filtração. As células podem ser lavadas e semeadas para coloração por citometria de fluxo. As células foram marcadas com misturas de anticorpos extracelulares (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK1.1, CD25, F4/80, CD11b, CD11c, Gr1, CX3CR1, CD64, SiglecF, Ly6C) e anticorpos intracelulares (Tbet, RORγT, FOXP3, IFNγ, IL6, IL10, IFNb) em uma coloração viva sequencial em placas de 96 poços. Os dados foram adquiridos com o uso de um citômetro de fluxo FACS Celesta com o software FACSDiva.
RESULTADOS
[00265] A eficácia primária do NX-43 neste modelo de infecção por influenza A pode ser a avaliação dos títulos virais. Com a inibição de NLRX1, maior ativação imunológica e respostas de interferon são previstas, o que é previsto para reduzir o nível de vírus nos pulmões e fornecer eliminação mais cedo do que em camundongos não tratados. Como afirmado, prevê-se que essa depuração seja ativada pelo aumento da expressão de interferons do tipo 1 e citocinas inflamatórias, como IL-6. Prevê-se que a eliminação facilitada do vírus resulte em uma recuperação mais rápida do peso após a fase inicial da infecção. Prevê-se que a resposta imune ativada resulte em porcentagens mais altas de células T inflamatórias, macrófagos e neutrófilos nos pulmões durante a infecção. Exemplo 19. Eficácia do NX-13 na infecção por Clostridium difficile como modelo de infecção bacteriana
INTRODUÇÃO
[00266] A infecção por Clostridium difficile é uma infecção entérica de difícil tratamento devido a uma associação com o uso de antibióticos, surgimento de cepas resistentes a antibióticos e altas taxas de recidiva. O C. difficile pode ser controlado por meio da inibição competitiva promovida por cepas comensais nativas de bactérias. Para facilitar o crescimento dessas bactérias após os antibióticos, a ativação de NLRX1 deve modular a resposta imune em direção a um ambiente tolerogênico. Para validar a eficácia do NX-13, podemos usar um modelo de camundongo da infecção por C. difficile.
MÉTODOS
[00267] Modelo de camundongo. Os camundongos C57Bl/6 de tipo selvagem podem ser infectados com C. difficile por via oral por gavagem. Os camundongos podem ser tratados diariamente com NX-13 em doses de 10, 20 e 40 mg/kg por via oral por gavagem ou por injeção intravenosa na veia da cauda. Os camundongos podem ser pesados e avaliados diariamente ao longo de 12 dias. Os camundongos podem ser sacrificados nos dias 4, 8 e 12 para medir a contagem de C. difficile no intestino e geração de respostas imunológicas por expressão gênica e citometria de fluxo.
[00268] Contagens de C. difficile. Homogenatos fecais podem ser preparados a partir de camundongos não tratados e tratados com NX-43, e as contagens de C. difficile podem ser determinadas usando métodos padrão.
[00269] Expressão gênica. O RNA total do intestino pode ser gerado usando o mini kit Qiagen RNeasy. O cDNA pode ser gerado usando o kit de síntese de cDNA BioRad iScript. As curvas padrão foram geradas por diluição em série do produto purificado a partir de uma reação de PCR padrão com Taq DNA polimerase seguida por purificação com o uso do kit de purificação Qiagen MinElute PCR. Os níveis de expressão foram obtidos a partir da PCR quantitativa em tempo real com a supermistura SybrGreen em um termociclador BioRad CFX96 seguido de normalização para expressão da β-actina. A expressão do gene pode ser medida para IL10, IL6, S100A8, S100A9 e DefB1.
[00270] Citometria de fluxo. O intestino pode ser cortado em pequenos pedaços e coletado em tampão RPMI/FBS/Hepes contendo colagenase (300U/ml) e DNase (50U/ml) para digestão. Os tecidos podem ser digeridos durante 60 minutos sob agitação a 37 °C. As suspensões celulares resultantes podem ser filtradas através de filtros de 100 µm, centrifugadas (300 xg, 8 min) e lavadas em RPMI fresco. Os glóbulos vermelhos podem ser lisados por lise hipotônica e removidos por filtração. As células podem ser lavadas e semeadas para coloração por citometria de fluxo. As células foram marcadas com misturas de anticorpos extracelulares (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK1.1, CD25, F4/80, CD11b, CD11c, Gr1, CX3CR1, CD64, SiglecF, Ly6C) e anticorpos intracelulares (Tbet, RORγT, FOXP3, IFNγ, IL6, IL10, IL17) em uma coloração viva sequencial em placas de 96 poços. Os dados foram adquiridos com o uso de um citômetro de fluxo FACS Celesta com o software FACSDiva.
RESULTADOS
[00271] A eficácia primária do NX-13 neste modelo de infecção por C. difficile pode ser a avaliação da contagem de bactérias no intestino. Com a ativação de NLRX1, maior tolerância imunológica e respostas de IL-10 são previstas, o que é previsto para reduzir o nível de bactérias patogênicas no intestino por meio do recrescimento aprimorado de cepas comensais. Por meio dessa tolerância aumentada, níveis mais baixos de danos aos tecidos são esperados como resultado de uma resposta Treg aumentada em relação às células Th17 nos cólons de camundongos tratados. Com a redução em Th17, neutrófilos colônicos inferiores e expressão de peptídeos antimicrobianos são esperados. Espera-se que as alterações imunológicas e microbianas induzidas pelo NX-13 reduzam a perda de peso e os escores de atividade da doença, permitindo doença menos grave e recuperação acelerada. Exemplo 20: Uso de NX-13 para tratar o Diabetes Tipo 1 (T1D)
INTRODUÇÃO
[00272] Prevê-se que o NX-13 e outros agonistas de NLRX1 tratem o diabetes tipo 1 de maneira eficaz.
MÉTODOS
[00273] Camundongos. Os camundongos NOD podem ser adquiridos no Laboratório Jackson e alojados em condições livres de patógenos específicos em racks ventilados. Os camundongos podem ser mantidos em instalações para animais. Todos os protocolos experimentais serão aprovados por um comitê institucional de cuidado e uso de animais e atenderam ou excederam as diretrizes do National Institutes of Health Office de Laboratory Animal Welfare and Public Health Service.
[00274] Avaliação do peso corporal e tolerância à glicose. Todos os camundongos podem ser determinados como normoglicêmicos (níveis de glicose no sangue em jejum inferiores a 250 mg/dl) e com pesos semelhantes (20 ± 1,5 g) antes do início do estudo. Os camundongos podem ser pesados semanalmente e examinados por observadores cegos quanto a sinais clínicos de doença. Após um jejum padrão de 12 horas, a glicose pode ser medida usando um glicosímetro ACCU-CHEK® (Indianapolis, IN). O sangue pode ser coletado pela veia lateral da cauda e colocado em tubos de coleta de sangue capilar.
[00275] Histopatologia. As seções pancreáticas de estudos NOD em camundongos podem ser fixadas em formalina neutra tamponada a 10%, posteriormente embebidas em parafina e então secionadas (5 µm) e coradas com coloração H&E para exame histológico. As seções podem ser classificadas com uma pontuação de 0–4, dependendo da infiltração linfocítica, dano celular e erosão do tecido, e os dados podem ser analisados como uma pontuação combinada normalizada.
[00276] Análises estatísticas. Os dados paramétricos podem ser analisados usando a ANOVA seguida pelo método de comparação múltipla de Scheffe. Os dados não paramétricos podem ser analisados usando o teste U de Mann-Whitney seguido por um teste de comparações múltiplas de Dunn. A ANOVA pode ser realizada usando o procedimento de modelo linear geral do SAS, versão 6.0.3 (SAS Institute). A significância estatística pode ser avaliada com um P≤0,05.
RESULTADOS
[00277] Prevê-se que o NX-13 reduza os níveis de glicose no sangue em jejum e aumente a insulina em um modelo de camundongo com diabetes tipo 1.
[00278] A fim de determinar o efeito de NX-13 na modulação dos níveis glicêmicos em um modelo de camundongo de T1D, um teste de glicose no sangue em jejum pode ser realizado nas semanas 0, 1, 3, 4, 5, 10 e 11 após o início do estudo. Os resultados devem mostrar como os camundongos tratados com NX-13 têm níveis mais baixos de glicose no sangue após um período de 12h de jejum. Em paralelo, os níveis de insulina podem ser avaliados na semana 5 e os resultados são previstos para mostrar como os camundongos tratados com NX-13 aumentaram significativamente os níveis de insulina no plasma.
[00279] Prevê-se que o NX-13 melhore as lesões pancreáticas histopatológicas clínicas e a inflamação no modelo NOD de camundongo. Para avaliar as lesões histopatológicas no modelo de camundongo de T1D, o pâncreas pode ser coletado e fixado com formalina a 10%. As seções pancreáticas podem ser coradas com H&E e observadas ao microscópio. Os resultados devem mostrar como o tratamento com NX-13 reduz significativamente as lesões histopatológicas clínicas no pâncreas em camundongos quando comparados aos camundongos tratados com veículo.
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Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto de fórmula Z tendo um anel A, um anel B, um anel C e um anel D, ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de que: Z é: A D B C ; X em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em N e CR6; Y em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em NR6, O, S, C(R6)2 e CR7; A1, A2, A3, A4 e A5 em cada caso são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em N e C; R1, R2, R3, R4, R5 e R6, quando presentes, são em cada caso selecionados independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, hidroxi, acetila, halogênio e carboxila; uma porção química substituída ou não substituída selecionada a partir do grupo que consiste em amino, alquila, alcoxi, carboxialquila, acila, acilamino arila, arilalquila, heteroalquila, heteroalcoxi, heterocarboxialquila, heteroacila, heteroacilamino, heteroarila e heteroarilalquila; e qualquer combinação dos anteriores, com a condição de que qualquer um de R1, R2, R3, R4 e/ou R5 em um dado anel está ausente quando A1, A2, A3, A4 e/ou A5 no dado anel, respectivamente, é N; e
R7 em cada caso é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em =O, =S e =NR6.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: pelo menos um X é C; a Y entre o anel D e o anel A é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S, C(R6)2, e CR7; pelo menos um de A1 e A3 no anel A é C; A2 em que o anel A é C; e A5 no anel A é N.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que cada X é C.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o Y entre o anel D e o anel A é O.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que A1, A2, A3 e A4 no anel A são C.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R1, R2, R3 e R4 no anel A não é hidrogênio.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R1 e R4 no anel A não é hidrogênio.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: cada X é C; o Y entre o anel D e o anel A é O; A1, A2, A3 e A4 no anel A são C; e A5 no anel A é N.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R1 e R4 no anel A não é hidrogênio.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: cada X é C; cada Y é O; A1, A2, A3 e A4 em cada um dos anéis A e B são C; e A5 em cada um dos anéis A e B é N.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R1 e R4 no anel A e pelo menos um de R1 e R4 no anel B não hidrogenado.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: pelo menos um X é C; a Y entre o anel D e o anel A é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S, C(R6)2, e CR7; A2 e A3 no anel A são C; e A5 no anel A é N.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: pelo menos um X é C; pelo menos um de A1 e A3 no anel A é C; A2 em que o anel A é C; A5 no anel A é N; e pelo menos um de R1, R2, R3 e R4 no anel A não é hidrogênio.
14. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: A5 no anel A é N; e R1 no anel A não é hidrogênio.
15. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é simétrico.
16. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é assimétrico.
17. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto tem a estrutura de: ; ; ; ; ; ; ; ;
; ; ;
;
; ; ;
;
; ; ;
; ou um sal de qualquer um dos anteriores.
18. Método de tratamento de uma condição em um animal com um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz do composto ao animal, em que a condição é selecionada a partir do grupo que consiste em uma doença gastrointestinal inflamatória, imunomediada ou crônica; uma doença imunomediada sistêmica; câncer; e uma doença infecciosa.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a condição é uma doença gastrointestinal inflamatória, imunomediada ou crônica e a condição compreende doença inflamatória intestinal.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória intestinal, incluindo colite ulcerosa.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória intestinal, inclui a doença de Crohn.
22. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a condição é uma doença gastrointestinal inflamatória, imunomediada ou crônica e a condição compreende a síndrome do intestino irritável.
23. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a condição é uma doença imunomediada sistêmica e a doença imunomediada sistêmica é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes tipo 1 e psoríase.
24. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a condição é uma doença imunomediada sistêmica e a doença imunomediada sistêmica compreende diabetes tipo 1.
25. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a condição é câncer e em que o câncer compreende câncer colorretal.
26. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a condição é uma doença infecciosa e as doenças infecciosas compreendem uma infecção selecionada do grupo que consiste em uma infecção viral e uma infecção bacteriana.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a doença infecciosa compreende uma infecção viral e a infecção viral compreende infecção por influenza.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a doença infecciosa compreende uma infecção bacteriana e a infecção bacteriana compreende infecção por Clostridium difficile.
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