CN112345676A - 同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的hplc法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，6种活性成分包括熊果酸、齐墩果酸、苦杏仁苷、梓醇、甘草酸和甘草苷；步骤包括：量取待测川贝清肺糖浆样品，加入醇类水溶液后提取，得到供试品溶液；注入到高效液相色谱仪中，采用HPLC法测试后得到色谱图，其中，流动相A和流动相B分别为乙腈和0.08‑0.12％磷酸水溶液；以外标法计算得到川贝清肺糖浆中6种活性成分的含量。本发明通过优化流动相和梯度洗脱方式，提高色谱峰之间的分离度，检测方法灵敏度高；通过采用苯甲酰氯衍生化试剂进行衍生化，可提高灵敏度，并能准确有效地定量检测低丰度的活性成分；该方法检测速度快，灵敏度高、精确度高，重复性好。

Description

同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法

技术领域

本发明涉及药物活性成分的检测技术领域，更具体地，涉及同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法。

背景技术

咳嗽是一种临床的常见疾病，但却很少能快速治愈。目前，口服化学药物和输液都不能完全快速治愈咳嗽；相比而言，中药制剂副作用小，即便是用药周期稍长(7-10天)也不会有副作用显现，于是中药的优势得到显著体现。

川贝清肺糖浆来源于医圣张仲景的《伤寒杂病论》中的经典名方，由枇杷叶、苦杏仁、川贝母、甘草、麦冬、地黄、桔梗、薄荷等8味中药组成；其具有清肺润燥和止咳化痰的功效，用于治疗干咳、咽干和咽痛，其效果明显，且安全性好。

现有川贝清肺糖浆的成品质量标准中没有含量测定方法，对成品质量没有控制指标，而中成药发挥疗效是靠多种活性成分配合，共同作用才能达到预期效果。因此，活性成分的含量测定是中药质量标准中的关键内容之一，对于复方制剂而言，仅针对制剂中的某单一成分或较少的几种成分进行含量测定，是难以客观、全面和灵敏地反应川贝清肺糖浆制剂质量情况的，即难以全面控制中药制剂的质量。

综上所述，如何准确定量检测川贝清肺糖浆中6种活性成分是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，该方法具有检测速度快、灵敏度高、精确度高和重复性好等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，

所述6种活性成分分别为：熊果酸、齐墩果酸、苦杏仁苷、梓醇、甘草酸和甘草苷；

具体包括以下步骤：

S1、量取待测川贝清肺糖浆样品，加入醇类水溶液后提取，得到供试品溶液；

S2、注入到高效液相色谱仪中，采用HPLC法测试后得到色谱图；

S3、以外标法计算得到川贝清肺糖浆中6种活性成分的含量；

步骤S2中，所述HPLC法采用的流动相A和流动相B分别为乙腈和0.08-0.12％磷酸水溶液。

本发明通过大量的研究得出，采用上述流动相，可以在相对较短的时间内非常有效且准确地测定出川贝清肺糖浆中的熊果酸、齐墩果酸、苦杏仁苷、梓醇、甘草酸和甘草苷，灵敏度高。

在上述技术方案中，步骤S2中，所述HPLC法采用的梯度洗脱参数为：

其中，流动相A和流动相B的比例均为体积比。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，还包括，在注入到高效液相色谱仪之前，采用苯甲酰氯衍生化试剂对供试品溶液进行衍生化处理。

具体地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述衍生化处理包括，依次加入三乙胺和苯甲酰氯/乙醚溶液进行衍生化反应。

具体地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述衍生化处理的反应温度和时间分别为20-45℃和15-35min。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述醇类水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、正丁醇水溶液和异戊醇水溶液中的一种，优选为浓度25-35wt％的乙醇水溶液。

具体地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述提取具体为，将待测川贝清肺糖浆样品溶解于醇类水溶液中，在50-65℃下超声处理。

在一个优选实施例中，所述提取的具体过程包括，精密量取10ml待测川贝清肺糖浆样品，置于具有密封塞的锥形瓶中，加入50ml 30％乙醇水溶液，密封后精密称重，在55-60℃下超声处理后放置冷却，用30％乙醇水溶液补足减失重量，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述超声处理的具体工艺条件为：频率40KHz，功率200W，处理时间20-30min。

详细地，在一个具体实施例中，步骤S2中，所述HPLC法采用的梯度洗脱参数为：

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述高效液相色谱仪的条件为：

色谱柱为C18色谱柱；

和/或，柱温为37-42℃，优选为40℃；

和/或，流速为0.8-1.2ml/min，优选为1.0ml/min；

和/或，检测器为二极管阵列检测器。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所提供的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法通过优化流动相，并在此基础上优化梯度洗脱方式，可使川贝清肺糖浆中的活性成分的色谱峰之间的分离度好，干扰小，峰形好，基线平稳，检测方法灵敏度高；

(2)本发明所提供的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法通过采用苯甲酰氯衍生化试剂进行衍生化处理能更有效改善和提高色谱峰峰形及分离度，提高检测灵敏度，而且还可准确有效地定量检测低丰度的活性成分；

(3)本发明所提供的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法通过超声提取，分离富集待测活性成分，使得检测结果稳定性大大提高，与中药活性成分的其他检测提取方法相比，该方法操作简便，耗时少；

(4)本发明所提供的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法具有检测速度快、灵敏度高、精确度高和重复性好等优点，实际应用效果优异。

附图说明

图1为本发明实施例1的川贝清肺糖浆样品中6种活性成分的HPLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下实施例，仅用于说明本发明的内容，但不用来限制本发明的范围。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都应属于本发明的保护范围。

1、材料

苦杏仁苷对照品：中国食品药品检定研究院，批号：110820-201808，纯度：88.2％。

齐墩果酸对照品：中国食品药品检定研究院，批号：110709-201808，纯度：91.1％。

熊果酸对照品：中国食品药品检定研究院，批号：110742-201823，纯度：99.9％。

甘草苷对照品：中国食品药品检定研究院，批号：111610-201908，纯度：95.0％。

甘草酸铵对照品：中国食品药品检定研究院，批号：110731-202021，纯度：96.2％。

梓醇对照品：中国食品药品检定研究院，批号：110808-201711，纯度：99.6％。

川贝清肺糖浆：葵花药业集团湖北武当有限公司，批号：200109。

甲醇为色谱纯(阿拉丁试剂有限公司，中国)，磷酸和三乙胺为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水。

2、仪器

岛津液相色谱仪(包括，全自动进样器，柱温箱，并配有岛津数据工作站，检测器为二极管阵列检测器)。

实施例1同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法

具体步骤如下：

S1、精密量取10ml待测川贝清肺糖浆样品，置于具有密封塞的锥形瓶中，加入50ml30％乙醇水溶液，密封后精密称重，在55-60℃下超声处理(频率40KHz，功率200W，处理时间25min)后放置冷却，用30％乙醇水溶液补足减失重量，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液；

S2、将得到的供试品溶液加入15μL三乙胺和85μL 0.4mg/L苯甲酰氯/乙醚溶液，在35℃下衍生化反应30min后，注入到高效液相色谱仪中，采用HPLC法测试后得到色谱图；

色谱条件如下：

色谱柱型号为岛津C18(4.6*250mm，5μm)，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；

流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；

流速为0.5ml/min，柱温为40℃，进样量10μl；

梯度洗脱参数为：

S3、以外标法计算得到川贝清肺糖浆中6种活性成分的含量；

分别配制6种活性物质的系列标准工作溶液，然后将标准工作溶液按步骤S2的方法衍生化反应后，注入到高效液相色谱仪中进行检测，以浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标，绘制得到工作曲线，结合步骤S2得到的供试品溶液的色谱图和工作曲线，计算得到川贝清肺糖浆中6种活性成分的含量。

检测结果如下：

图1为本发明实施例1的川贝清肺糖浆样品中6种活性成分的HPLC图；从图1中可以看出，该检测方法可准确定量分析，分离效果好、灵敏度高，进一步地，结合标准曲线可计算得到，川贝清肺糖浆中熊果酸含量为0.05mg/ml，齐墩果酸含量为0.02mg/ml，苦杏仁苷含量为0.05mg/ml，甘草苷含量为0.02mg/ml，甘草酸含量为0.1mg/ml，梓醇含量为0.02mg/ml。

实施例2同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法

本实施例所提供的检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：

流动相梯度洗脱参数为：

实施例2与实施例1相比，活性成分的色谱峰之间的分离度和灵敏度均有所下降；具体地，其灵敏度(依据最低检测定量限)降低了4.8-8.7％。

对比例1同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法

本对比例所提供的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其步骤与实施例1的步骤相似，区别仅在于：

流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸水溶液。

对实施例1与对比例1中6种活性成分的检测方法进行灵敏度对比分析。

灵敏度对比实验结果如表1示。

表1灵敏度对比实验结果

对比分析表1中实施例1与对比例1的灵敏度对比实验结果可以发现，本申请实施例1中的HPLC法检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的灵敏度明显提高，灵敏度(依据最低检测定量限)提高了6.28-42.29倍。

对比例2同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法

本对比例所提供的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其步骤与实施例1的步骤相似，区别仅在于：

未采用苯甲酰氯衍生化试剂进行衍生化处理。

对实施例1与对比例2中6种活性成分的检测方法进行灵敏度对比分析。

灵敏度对比实验结果如表2示。

表2灵敏度对比实验结果

对比分析表2中实施例1与对比例2的灵敏度对比实验结果可以发现，本申请实施例1中的HPLC法检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的灵敏度明显提高，灵敏度(依据最低检测定量限)提高了8.19-62.4倍。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内内。

Claims (10)

1.同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

所述6种活性成分分别为：熊果酸、齐墩果酸、苦杏仁苷、梓醇、甘草酸和甘草苷；

具体包括以下步骤：

S1、量取待测川贝清肺糖浆样品，加入醇类水溶液后提取，得到供试品溶液；

S2、注入到高效液相色谱仪中，采用HPLC法测试后得到色谱图；

S3、以外标法计算得到川贝清肺糖浆中6种活性成分的含量；

步骤S2中，所述HPLC法采用的流动相A和流动相B分别为乙腈和0.08-0.12％磷酸水溶液。

2.根据权利要求1所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

步骤S2中，所述HPLC法采用的梯度洗脱参数为：

3.根据权利要求1或2所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

步骤S2中，还包括，在注入到高效液相色谱仪之前，采用苯甲酰氯衍生化试剂对供试品溶液进行衍生化处理。

4.根据权利要求3所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

所述衍生化处理包括，依次加入三乙胺和苯甲酰氯/乙醚溶液进行衍生化反应。

5.根据权利要求3所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

所述衍生化处理的反应温度和时间分别为20-45℃和15-35min。

6.根据权利要求1所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

步骤S1中，所述醇类水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、正丁醇水溶液和异戊醇水溶液中的一种，优选为浓度25-35wt％的乙醇水溶液。

7.根据权利要求6所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

步骤S1中，

所述提取具体为，将待测川贝清肺糖浆样品溶解于醇类水溶液中，在50-65℃下超声处理；

优选地，所述提取的具体过程包括，精密量取10ml待测川贝清肺糖浆样品，置于具有密封塞的锥形瓶中，加入50ml 30％乙醇水溶液，密封后精密称重，在55-60℃下超声处理后放置冷却，用30％乙醇水溶液补足减失重量，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液。

8.根据权利要求7所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

步骤S1中，所述超声处理的具体工艺条件为：频率40KHz，功率200W，处理时间20-30min。

9.根据权利要求1-8任一项所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

步骤S2中，所述HPLC法采用的梯度洗脱参数为：

10.根据权利要求1所述的同时检测川贝清肺糖浆中6种活性成分的HPLC法，其特征在于，

步骤S2中，所述高效液相色谱仪的条件为：

色谱柱为C18色谱柱；

和/或，柱温为37-42℃，优选为40℃；

和/或，流速为0.8-1.2ml/min，优选为1.0ml/min；

和/或，检测器为二极管阵列检测器。

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