CN112342221A

CN112342221A - 一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法

Info

Publication number: CN112342221A
Application number: CN202011391223.7A
Authority: CN
Inventors: 曾珍; 韩芳; 陈剑; 韦海燕
Original assignee: Jiangsu Maisha Industrial Co ltd
Current assignee: Jiangsu Maisha Industrial Co ltd
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明首公开了一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法，到目前为止，尚未有人体外表达过NtARF6蛋白，而本发明通过基因工程方法，本发明首次成功表达纯化了NtARF6蛋白。

Description

一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法。

背景技术

烟草是重要的经济作物，是切克一年生草本植物。烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95％左右。

ARF(Auxin Response Factor)类型的转录因子基因是普通烟草生长发育过程当中重要的调控因子。近年来，随着基因组和测序技术的发展，正向调控烟草尼古丁生物合成调控因子已经基本明确，而且相关分子调控机理也逐渐清晰。相比之下，烟草中能够负向调控尼古丁生物合成的调控因子却鲜见报道。具相关文献报道，负向调控烟草尼古丁合成基本上是通过直接或间接影响不同植物激素之间的互作来实现的，比如生长素(IAA)、乙烯利(Ethylene)。我们通过对乙烯利处理后烟草根部组织转录组进行分析后获得NtARF6基因表达模式和NtARF6与相关尼古丁合成代谢酶转录组共表达分析的结果，确定了NtARF6与尼古丁合成直接相关，相关应用实践结果表明过表达NtARF6能够显著降低烟草烟叶中四种生物碱的含量，此结果为利用植物基因工程技术降低烟叶中生物碱含量提供了靶标基因。

发明内容

针对现在技术的不足，本发明的目的是提供一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

本发明保护一种编码烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还保护上述基因编码的NtARF6蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还保护包含上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明还保护上述重组表达载体的制备方法。

其中，所述重组载体的制备方法如下：提取4-5叶烟苗总RNA，接着反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增NtARF6基因；将NtARF6扩增产物经BamH I和Hind III双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒pBI121-NtARF6。

本发明还保护一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法，包括以下步骤：

(1)用上述重组表达载体转化大肠杆菌细胞，得到表达NtARF6蛋白的重组原核表达菌株PBI121-NtARF6-BL21；

(2)利用步骤(1)所述菌株PBI121-NtARF6-BL21生产重组NtARF6蛋白，具体为：将菌株PBI121-NtARF6-BL21接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养过夜，按照1:100接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养至OD600达到0.6-0.8，然后加入IPTG至终浓度为0.1-1.0mM，20-37℃，220转/分培养2小时以上离心并收集菌体，超声破碎后、离心、收集上清，经分离纯化得到重组NtARF6蛋白。

优选的，将分离纯化得到的重组鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白加入到透析袋中，在20mMPB,0.5mM NaCl,0.5mM EDTA,pH8.0进行透析过夜；然后把透析后的蛋白溶液加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时，去掉滤出液，得到重组NtARF6蛋白。

采用上述方案后，本发明提供的一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法，与现有技术相比，具有如下有益效果是：到目前为止，尚未有人体外表达过NtARF6，而本发明通过基因工程方法，首次成功表达纯化了烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

实施例1：烟草生物碱合成负向调控基因NtARF6大肠杆菌表达载体PBI121-NtARF6的构建

1、提取4-5叶烟苗总RNA，接着反转录出cDNA；

2、以cDNA为模板，利用引物扩增NtARF6基因。

用于载体构建的基因扩增所用的PCR扩增体系如下：5×buffer 10μL，DNA聚合酶1μL，25mmol dNTPs 4μL，cDNA模板0.5μL，10μmol上下游引物各1μL，ddH2O 32.5μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；然后72℃延伸10min。

4、构建NtARF6基因重组载体

合成的烟草生物碱合成负向调控NtARF6基因和PBI121载体用限制性内切酶BamHI和Hind III 37℃双酶切。体系如下：内切酶各1μL；重组质粒5μL；10×Buffer T 14μL；总体系20μL。

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用回收试剂盒进行回收，用TAKARAT4连接酶16℃连接过夜。

pET-28a(+)0.5μL；目的基因4.5μL；T4 DNA Ligase 0.5μL；10×Ligase Buffer 1μL；ddH2O 3.5μL；总体系10μL。

将连接产物用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21中，用LB平板筛选转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的基因和表达载体PBI121(+)大小相同，再测序验证其序列正确性。测序结果表明，所获得的NtARF6基因编码区序列与预计相符，证明编码烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的基因已克隆入大肠杆菌表达载体PBI121(+)中，重组质粒命名为PBI121-NtARF6。

实施例2：NtARF6蛋白的诱导表达

1、获得烟草生物碱合成负向调控NtARF6基因的重组原核表达菌株

挑选实施例1中测序成功的单克隆接种到50ug/mL卡那霉素液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养，按照天根质粒小量提取试剂盒将pBI121-NtARF6重组表达载体提取出来，取重组表达载体质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)检测GUS蛋白的表达。

2、诱导表达

将制备好的重组质粒PBI121-NtARF6用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，在LB平板上37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取大肠杆菌工程菌PBI121-NtARF6-BL21单菌落接种在10mL LB液体培养基中，37℃，220转/分培养过夜培养。将培养过夜的菌液按1:100的比例接种于10mL LB液体培养基中，37℃，220转/分培养至OD600到0.6-0.8；添加IPTG至终浓度为1mM，30℃、200r/min振荡培养6h；获得NtARF6的重组蛋白。

实施例3：ORF66重组蛋白的纯化

按照诱导条件大量表达，冰浴超声破碎，沉淀经洗涤后，用含6mo1/L尿素的变性剂溶解，His亲和层析纯化，蛋白定量。

(1)单菌落震荡培养过夜，次日按1％的比例接种于LB液体培养基(40μg/mL Kan)中，按最佳诱导条件诱导，5000rpm/min离心l0min，倾去上清；

(2)湿菌用PBS缓冲液重悬，冰浴超声破碎，超声条件为:300w功率，超5s停5s,共20min，10000rpm，4℃离心15min，弃上清；

(3)沉淀重悬于洗涤缓冲液(2M尿素、20mMPB,0.5mM NaCl、2％Triton X-100,PH8.0)缓冲液中，4℃涡旋搅拌30min,10000rpm/min离心10min，收集沉淀，重复洗涤一次；沉淀用变性缓冲液(8ML尿素、20mMPB,0.5mM NaCl、2％Triton X-100、l0 mmol/L咪唑、PH8.0)重悬。冰浴lh。4℃，16000g离心30min，上清采用0.45μm滤膜过滤后上柱；再按照试剂盒说明书的方法进行蛋白纯化即可。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。

序列表

<110> 江苏麦莎实业有限公司

<120> 一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2481

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 1

atgagggtat cttcagctgg gttcaatcct caaccagagg aagcagggga gaagaaatgc 60

ttgaattcag agttgtggca cgcgtgtgcc gggccactag tttcgcttcc gcctgtagga 120

agcagagttg tgtattttcc tcaagggcat agtgaacagg ttgctgcctc gacaaacaag 180

gaagtagatg ctcatatccc taactatcct ggtttaccac ctcagctaat ttgtcagctt 240

cacaacctga caatgcatgc agatgttgag accgatgaag tatatgctca aatgacgttg 300

cagccactaa gtgcacaaga gcaaaaggat gtgtgcctgc taccagcaga acttggcatc 360

ccgagtaaac aaccaaccaa ctatttctgc aaaaccttga cggcaagtga caccagtact 420

cacggtggat tctctgtccc ccgacgtgca gcagaaaaag tttttccccc tcttgattac 480

tctcagcagc cgccctgtca agagttgatt gcaaaagatc tccatggaaa tgaatggaaa 540

ttccggcata tttttcgtgg ccaaccaaag aggcatctat tgacaacagg atggagtgtg 600

ttcgtaagtg caaagagact tgttgcgggt gatgcagtca tctttatctg gaatgaaaat 660

aatcaattgc ttttggggat tcgacgtgct aatcgtcctc aaaccgttat gccttcttca 720

gttttgtcaa gtgatagcat gcacattggt ctccttgctg cggcggctca tgcagctgca 780

actaatagcc gctttacaat attttataat ccaagggcaa gtccatcaga gtttgtcata 840

cctcttgcca agtatgctaa agcagtttat catacacgga tttctgttgg tatgaggttc 900

cggatgctgt ttgaaacaga agaatcgagt gtccgtaggt atatgggcac aattaccggt 960

atcagtgatt tagatcctgt tcgttggcca aattcacatt ggcggtctgt gaaggttgga 1020

tgggatgaat caactgcagg agagaggcag cccagagttt cgctgtggga aattgaacct 1080

ctgacaactt ttcctatgta tccttctcct ttctctctta ggctaaaaag gccttggcca 1140

tctggactac cttctctccc tggttttccc aatggtgata tgactatgaa ttctccactc 1200

tcgtggctgc gtggtgacat aggagaccaa gggattcagt cgcttaattt ccagggctat 1260

ggtgttactc cgtttatgca gccaagaatt gatgcttcta tgttaggttt gcaacctgac 1320

attctgcaaa caatggctgc actagatcca tcgaaacttg caaatcaatc ctttatgcag 1380

ttccaacaaa gtatacctgg cggttcagca tctttgagtc atagtcaaat tttgcagcct 1440

tctcattcac agcaaaatct gctccacggc ttctccgaaa accagttaat atctcaggca 1500

cagatgcttc agcaacaatt gcagcgccgt cagaattata atgatcaaca gcaattgctg 1560

cagccacagc ttcagcaaca ccaagaagtg aactcctcgc agtttcaaca tcaacagcaa 1620

accaaggcca tgtccagtct ctctcagatg acttcggctg cgcagcccca gctttctcat 1680

ttgcgagtct taagttcaac tggttctcca caaacatttt ctgatatact tggtaaccat 1740

gtcaatgcat ctagtaattc tactatgcaa agtctgttga gttcattttc ccatgatgga 1800

gcgtctgctg tccttaacat gcatgaagct caccctctag tgtcttcgtc ctcatcatca 1860

aagcgaattg ctctagaatc tcagctccct tctcgggtta ctccattcgc tgtgccccag 1920

cctgaggatg tgatatcaca caatactaaa gtttctgatc tttcctctct gttgccccct 1980

tttcctggca gagagtcttt ttctgattat agaggagtag aagatagcca aaacaatgca 2040

ctgtatggat ttaataccga ctctttgaac atactgccga atggtatgtc caacatgaag 2100

gatagtagtg gtgataatgg atctttatct attccttatg ctacctctac cttcacaaat 2160

actgtgggca acgagtatcc cattaactca gacatgacaa cttcaagttg tgtagatgaa 2220

tcaggtttct tgcagtcctc cgagaatggg gatcaaggaa acccaactaa tagaaccttt 2280

gtgaaggttc ataaatcagg gtcctttgga cggtcactcg atatctccaa gtttagcagc 2340

tatcacgaac ttcgaagtga gcttgctcac atgtttgggc tagaaggctt gttggaggac 2400

cctgagagat caggctggca gcttgtattt gtagaccgag agaatgatgt tctcctcctc 2460

ggtgacgatc cctggcagta a 2481

<210> 2

<211> 826

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 2

Met Ala Val Ser Ser Ala Gly Pro Ala Pro Gly Pro Gly Gly Ala Gly

1 5 10 15

Gly Leu Leu Cys Leu Ala Ser Gly Leu Thr His Ala Cys Ala Gly Pro

20 25 30

Leu Val Ser Leu Pro Pro Val Gly Ser Ala Val Val Thr Pro Pro Gly

35 40 45

Gly His Ser Gly Gly Val Ala Ala Ser Thr Ala Leu Gly Val Ala Ala

50 55 60

His Ile Pro Ala Thr Pro Gly Leu Pro Pro Gly Leu Ile Cys Gly Leu

65 70 75 80

His Ala Leu Thr Met His Ala Ala Val Gly Thr Ala Gly Val Thr Ala

85 90 95

Gly Met Thr Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gly Gly Gly Leu Ala Val Cys

100 105 110

Leu Leu Pro Ala Gly Leu Gly Ile Pro Ser Leu Gly Pro Thr Ala Thr

115 120 125

Pro Cys Leu Thr Leu Thr Ala Ser Ala Thr Ser Thr His Gly Gly Pro

130 135 140

Ser Val Pro Ala Ala Ala Ala Gly Leu Val Pro Pro Pro Leu Ala Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Pro Pro Cys Gly Gly Leu Ile Ala Leu Ala Leu His Gly

165 170 175

Ala Gly Thr Leu Pro Ala His Ile Pro Ala Gly Gly Pro Leu Ala His

180 185 190

Leu Leu Thr Thr Gly Thr Ser Val Pro Val Ser Ala Leu Ala Leu Val

195 200 205

Ala Gly Ala Ala Val Ile Pro Ile Thr Ala Gly Ala Ala Gly Leu Leu

210 215 220

Leu Gly Ile Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gly Thr Val Met Pro Ser Ser

225 230 235 240

Val Leu Ser Ser Ala Ser Met His Ile Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala

245 250 255

His Ala Ala Ala Thr Ala Ser Ala Pro Thr Ile Pro Thr Ala Pro Ala

260 265 270

Ala Ser Pro Ser Gly Pro Val Ile Pro Leu Ala Leu Thr Ala Leu Ala

275 280 285

Val Thr His Thr Ala Ile Ser Val Gly Met Ala Pro Ala Met Leu Pro

290 295 300

Gly Thr Gly Gly Ser Ser Val Ala Ala Thr Met Gly Thr Ile Thr Gly

305 310 315 320

Ile Ser Ala Leu Ala Pro Val Ala Thr Pro Ala Ser His Thr Ala Ser

325 330 335

Val Leu Val Gly Thr Ala Gly Ser Thr Ala Gly Gly Ala Gly Pro Ala

340 345 350

Val Ser Leu Thr Gly Ile Gly Pro Leu Thr Thr Pro Pro Met Thr Pro

355 360 365

Ser Pro Pro Ser Leu Ala Leu Leu Ala Pro Thr Pro Ser Gly Leu Pro

370 375 380

Ser Leu Pro Gly Pro Pro Ala Gly Ala Met Thr Met Ala Ser Pro Leu

385 390 395 400

Ser Thr Leu Ala Gly Ala Ile Gly Ala Gly Gly Ile Gly Ser Leu Ala

405 410 415

Pro Gly Gly Thr Gly Val Thr Pro Pro Met Gly Pro Ala Ile Ala Ala

420 425 430

Ser Met Leu Gly Leu Gly Pro Ala Ile Leu Gly Thr Met Ala Ala Leu

435 440 445

Ala Pro Ser Leu Leu Ala Ala Gly Ser Pro Met Gly Pro Gly Gly Ser

450 455 460

Ile Pro Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ser His Ser Gly Ile Leu Gly Pro

465 470 475 480

Ser His Ser Gly Gly Ala Leu Leu His Gly Pro Ser Gly Ala Gly Leu

485 490 495

Ile Ser Gly Ala Gly Met Leu Gly Gly Gly Leu Gly Ala Ala Gly Ala

500 505 510

Thr Ala Ala Gly Gly Gly Leu Leu Gly Pro Gly Leu Gly Gly His Gly

515 520 525

Gly Val Ala Ser Ser Gly Pro Gly His Gly Gly Gly Thr Leu Ala Met

530 535 540

Ser Ser Leu Ser Gly Met Thr Ser Ala Ala Gly Pro Gly Leu Ser His

545 550 555 560

Leu Ala Val Leu Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Ser Ala Ile

565 570 575

Leu Gly Ala His Val Ala Ala Ser Ser Ala Ser Thr Met Gly Ser Leu

580 585 590

Leu Ser Ser Pro Ser His Ala Gly Ala Ser Ala Val Leu Ala Met His

595 600 605

Gly Ala His Pro Leu Val Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ile Ala

610 615 620

Leu Gly Ser Gly Leu Pro Ser Ala Val Thr Pro Pro Ala Val Pro Gly

625 630 635 640

Pro Gly Ala Val Ile Ser His Ala Thr Leu Val Ser Ala Leu Ser Ser

645 650 655

Leu Leu Pro Pro Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro Ser Ala Thr Ala Gly

660 665 670

Val Gly Ala Ser Gly Ala Ala Ala Leu Thr Gly Pro Ala Thr Ala Ser

675 680 685

Leu Ala Ile Leu Pro Ala Gly Met Ser Ala Met Leu Ala Ser Ser Gly

690 695 700

Ala Ala Gly Ser Leu Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ser Thr Pro Thr Ala

705 710 715 720

Thr Val Gly Ala Gly Thr Pro Ile Ala Ser Ala Met Thr Thr Ser Ser

725 730 735

Cys Val Ala Gly Ser Gly Pro Leu Gly Ser Ser Gly Ala Gly Ala Gly

740 745 750

Gly Ala Pro Thr Ala Ala Thr Pro Val Leu Val His Leu Ser Gly Ser

755 760 765

Pro Gly Ala Ser Leu Ala Ile Ser Leu Pro Ser Ser Thr His Gly Leu

770 775 780

Ala Ser Gly Leu Ala His Met Pro Gly Leu Gly Gly Leu Leu Gly Ala

785 790 795 800

Pro Gly Ala Ser Gly Thr Gly Leu Val Pro Val Ala Ala Gly Ala Ala

805 810 815

Val Leu Leu Leu Gly Ala Ala Pro Thr Gly

820 825

Claims

1.一种编码烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述基因编码的NtARF6蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.包含权利要求1所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求3所述的重组表达载体的制备方法如下：提取4-5叶烟苗总RNA，接着反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增NtARF6基因；将NtARF6扩增产物经BamH I和Hind III双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pET-28a表达载体中，得到重组质粒pBI121-NtARF6。

5.一种烟草生物碱合成负向调控NtARF6蛋白的原核表达、蛋白纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用权利要求4所述的重组表达载体转化大肠杆菌细胞，得到表达NtARF6蛋白的重组原核表达菌株PBI121- NtARF6-BL21；

(2)利用步骤（1）所述菌株PBI121-NtARF6-BL21生产重组NtARF6蛋白，具体为：将菌株PBI121-NtARF6-BL21接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养过夜，按照1:100接种在LB液体培养基中，37℃，220转/分培养至OD600达到0.6-0.8，然后加入IPTG至终浓度为0.1-1.0mM，20-37℃，220转/分培养2小时以上离心并收集菌体，超声破碎后、离心、收集上清，经分离纯化得到重组NtARF6蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：将分离纯化得到的重组鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白加入到透析袋中，在20mMPB, 0.5mM NaCl ,0.5mM EDTA,pH8.0进行透析过夜；然后把透析后的蛋白溶液加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时，去掉滤出液，得到重组NtARF6蛋白。