CN112321703A - 一种乳状液膜法纯化水蛭素方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳状液膜法纯化水蛭素方法，所述方法，包括以下步骤：1)水蛭用水煎煮1‑3次，每次1‑3小时，合并煎液，浓缩加入乙醇至含醇量为80‑90％，静置，离心，取上清液调节pH＝4‑6，备用；2)大豆油，表面活性剂，液体石蜡混合，取此混合物加入NaOH水溶液，搅拌即制得稳定的乳状液；3)将步骤1)得到的备用液与步骤2)得到的乳状液混合搅拌提取，静置分层，分离出乳液，水浴加热乳液进行破乳，静置后分离得到的水层，即为水蛭素溶液。

Description

一种乳状液膜法纯化水蛭素方法

技术领域：

本发明涉及一种水蛭素纯化方法，特别涉及一种采用乳状液膜法纯化水蛭素工艺。

背景技术：

水蛭素(Hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中提取出的一种成分，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。天然水蛭素是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约为7000，能在极端的pH和热条件下稳定存在。

水蛭素通常以丙酮、乙醇和水处理原料得到粗提取物，再用液相色谱或等电聚焦进行纯化，如：1985年Markwardt等采用离子交换与亲合色谱相结合的方法从日本医蛭鲜体中获得了高纯度的水蛭素。1990年Steiner等运用凝胶色谱、离子色谱、反相色谱进行纯化，采用高效液相色谱毛细管区带电泳和等离子飞行时间质谱进行鉴定，分离得到两种水蛭素亚型P6和P18，抗凝活性与HV1相似。1992年，Emanuela利用离子色谱、亲和色谱和反相色谱三者相结合，从菲牛蛭头部中提取得到2种水蛭素(Hm1和Hm2)。

使用凝胶色谱，离子交换色谱，反相液相色谱、亲和色谱，多维液相色谱等也有报道，这些方法各有优缺点，分别适合不同分子量的产物。现有色谱法存在以下缺点，制约水蛭素纯化。

一是需要采用峰容量更大，纯化度更高的多维液相色谱技术对水蛭素进行分离纯化，设备要求高，成本高。

二是特异选择性较差，纯化后所得产物的蛋白含量和抗凝活性较低，含有大量杂蛋白及小分子杂质组分。

三是分离纯化中被广泛应用的大孔吸附树脂在生产和使用过程中往往存在正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯等有毒物质残留,可能造成纯化产物的污染。

水蛭中含有大量的伪水蛭素组分，结构上与水蛭素类似，要得到更高纯度的水蛭素，需要有针对性地设计提取及纯化方法。

乳状液膜分离技术是通过两液相间形成的界面液相膜,将2种组成不同但又互相混溶的溶液隔开,经选择性渗透,将物质分离提纯的方法。乳状液膜的分离过程是将含有表面活性剂和膜溶剂的油相和水相(内水相)置于容器中,在高速搅拌下制成油包水型乳状液,再将此乳状液分散到另一种水溶液(第3相)中,就得到了水包油再油包水型(W/O/W)乳状液膜。乳状液膜体系包括膜相(液膜)、回收相(内相)和连续相(外相)3个部分。当乳状液分散到第3相时,形成许多直径为0105～0120cm的乳珠。在乳珠与第3相间有巨大的接触面积,同时每个乳珠内部又包含无数个直径非常小的内水相微滴,分隔水相的有机液膜最薄可以达到1～10μm。这样具有巨大的接触面积和很薄的液膜,决定了分散体系有很快的传质速度,具有高效快速的优点。另外,由于内水相的作用,它的分离富集作用不受平衡的影响,打破了萃取过程的平衡,而且把萃取和反萃取合二为一,因此在分离富集那些含量比较低的物质时,更是具有萃取分离所无法比拟的优越性。通常内相和连续相是互溶的,膜相则以膜溶剂为基本成分。为了维持乳状液一定的稳定性及选择性,往往在膜相中加入表面活性剂和添加剂。

《中国中药杂志》2012年20期公开了一种以D2EHPA为流动载体的乳状液膜萃取菲牛蛭中的水蛭素的方法，该方法以菲牛蛭为原料,二-(2-乙基已基)磷酸(D2EHPA)作流动载体,脱水山梨醇脂肪酸酯(Span 80)为乳化剂,辛烷与D2EHPA混合构成膜溶液,稀HCl溶液作内水相的水蛭素乳状液膜体系萃取。得到的结论是:乳状液膜体系萃取水蛭素工艺较简单,实验样品纯度及ATU回收率均较高。

但该方法具有以下缺点：

膜体系稳定性较差,随着反应进行，内外水相间H+浓度差异变大，会加大膜相的渗透作用，易导致液膜的溶胀，严重时出现膜相结构破裂，降低萃取效率。

辛烷与D2EHPA均为毒性有机溶剂，对人体粘膜有刺激作用，不宜应用于医药产品的生产。

本发明将乳状液膜技术应用于水蛭素的纯化上，对工艺条件进行了摸索，找到一种适合工业化水蛭素的纯化方法。

发明内容：

本发明提供一种适合工业化水蛭素的纯化方法，所述方法，包括以下步骤：

1)水蛭用水煎煮，每次加水量为水蛭重量的5-10倍量，煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.04-1.06，加入乙醇至含醇量为80-90％，零下温度下静置10-36小时，离心，取上清液用盐酸调节pH＝4-6，备用；

2)取膜溶剂大豆油30-50份，表面活性剂Span80 4-5份，膜增强剂液体石蜡1.5-2.5份，将三者进行混合，取此混合物按1∶1.5-3的体积比缓慢加入质量分数为4-6％的NaOH水溶液，在2000-3000转/分的转速下搅拌10-20min，即制得稳定的乳状液；

3)将步骤1)得到的备用液与步骤2)得到的乳状液按照1∶2.5-3.5体积比加入到提取器中，在100-300转/分的低速搅拌提取10-30min；静置分层，分离出乳液，水浴加热乳液进行破乳，静置后分离得到的水层，即为水蛭素溶液。

优选的，本发明的制备方法如下：

1)水蛭用水煎煮，每次加水量为水蛭重量的6倍量，煎煮2次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.04-1.06，加入乙醇至含醇量为85％，零下温度下静置24小时，离心，取上清液用盐酸调节pH＝5，备用；

2)取膜溶剂大豆油40份，表面活性剂Span80 4.5份，膜增强剂液体石蜡2份，将三者进行混合，取此混合物按1∶2的体积比缓慢加入质量分数为5％的NaOH水溶液，在2500转/分的转速下搅拌10min，即制得稳定的乳状液；

3)将步骤1)得到的备用液与步骤2)得到的乳状液按照1∶3体积比加入到提取器中，在200转/分的低速搅拌提取20min；

静置分层，分离出乳液，水浴加热乳液进行破乳，静置后分离得到的水层，即为水蛭素溶液。

其中，所述取膜溶剂大豆油40份，表面活性剂Span80 4.5份，膜增强剂液体石蜡2份，其中的份是体积份。

本发明的方法和现有技术进行比较，主要差异如下表：

本发明的方法和现有技术进行比较，得到的技术参数如下：

经过比对，本发明在技术参数上优于现有技术。

本发明和现有技术相比的优点如下：

优点1选择性好。在纯化过程中,水蛭素不断经料液/膜相的界面溶入膜相,在浓度梯度作用下从膜相的外界面扩散到内界面,再由内界面扩散进入内水相.本专利采用5％的NaOH溶液为内水相,使水蛭素在膜相/内水相界面处发生碱基化反应,从而使内相中水蛭素浓度实际趋近于0,于是膜相内、外两侧水蛭素的浓度梯度维持最大,从而外水相中的水蛭素逐渐浓集到内相中,从而达到高效分离纯化水蛭素的目的。优点2利用非流动载体乳状液膜体系进行分离纯化，避免了流动载体造成的溶胀现象，提高了膜的稳定性，

优点3采用大豆油、液体石蜡等无毒或低毒的原料，具有较高的人体安全性。

优点4本专利无流动载体，可采用加热直接破乳的方式，油相损耗小、回收率高，整个纯化流程工艺简单，用时较短，不超过40min。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

水蛭素的纯化方法，所述方法，包括以下步骤：

1)水蛭1kg，每次加水6倍量，水煎煮两次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.04-1.06，加入95％以上乙醇至含醇量为85％，-30℃静置24小时，离心，取上清液用0.1mol/L的HCl调节pH＝5，备用；

2)取膜溶剂大豆油40mL，表面活性剂Span80总量为4.5mL，膜增强剂液体石蜡2mL，将三者进行混合，取此混合物按1∶2的体积比缓慢加入质量分数为5％的NaOH溶液，在2500转/分的转速下搅拌10min，即制得稳定的乳状液；

3)将水蛭提取液与乳状液按照乳水体积比为1∶3加入提取器中，在200转/分的低速搅拌提取20min；

静置分层，分出乳液水浴加热破乳，分出水层即得水蛭素溶液。

实施例2

水蛭素的纯化方法，所述方法，包括以下步骤：

1)取水蛭粗粉1kg，每次加水10倍量，水煎煮两次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.04-1.06，加入95％以上乙醇至含醇量为85％，-30℃静置24小时，离心，取上清液用0.1mol/L的HCl调节pH＝5，备用；

2)在制乳器中加入膜溶剂大豆油40mL，表面活性剂Span80 4.5mL，膜增强剂液体石蜡2mL，将三者进行混合，取此混合物按1∶2的体积比缓慢加入质量分数为5％的NaOH溶液，在2500转/分的转速下搅拌10min，即制得稳定的乳状液。

3)将水蛭提取液与乳状液按照乳水体积比为1∶3加入提取器中，在200转/分的低速搅拌提取20min；静置分层，由放料阀分出乳液，对乳液进行水浴加热破乳后回收油相，分出的水层即得水蛭素溶液。

实施例3

蛋白含量测定

1、绘制标准曲线：按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；取酶标板，各孔加入200μL BCA工作液；酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

2、稀释待测样品(本发明实施例1样品)至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；

3、根据所测样品的吸光值及稀释倍数，根据标准曲线即可计算相应的蛋白含量(μg/mL)。

实施例4

抗凝活性测定取所得水蛭素溶液(实施例1)，采用凝血酶滴定法测定抗凝活性,方法如下：

在37±0.5℃恒温条件下,吸取样品20μL,置反应板孔中,加入含0.5％牛纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液,混合均匀,恒温5分钟,滴加每1ml中50单位的凝血酶溶液(每一分钟滴加一次,每次5μL,边滴加边搅匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液体积,结果按下式计算：

式中C1:凝血酶的单位浓度,NIH/mL；

V1:消耗凝血酶体积,μL；

C2:样品的单位抗凝活性,ATU/mL；

V2:样品加入量,μL。

结果：

Claims (2)

1.一种乳状液膜法纯化水蛭素方法，所述方法，包括以下步骤：

1)水蛭用水煎煮，每次加水量为水蛭重量的5-10倍量，煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.04-1.06，加入乙醇至含醇量为80-90％，零下温度下静置10-36小时，离心，取上清液用盐酸调节pH＝4-6，备用；

2)取膜溶剂大豆油30-50份，表面活性剂Span80 4-5份，膜增强剂液体石蜡1.5-2.5份，将三者进行混合，取此混合物按1∶1.5-3的体积比缓慢加入质量分数为4-6％的NaOH水溶液，在2000-3000转/分的转速下搅拌10-20min，即制得稳定的乳状液；

3)将步骤1)得到的备用液与步骤2)得到的乳状液按照1∶2.5-3.5体积比加入到提取器中，在100-300转/分的低速搅拌提取10-30min；静置分层，分离出乳液，水浴加热乳液进行破乳，静置后分离得到的水层，即为水蛭素溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法，包括以下步骤：

1)水蛭用水煎煮，每次加水量为水蛭重量的6倍量，煎煮2次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.04-1.06，加入乙醇至含醇量为85％，零下温度下静置24小时，离心，取上清液用盐酸调节pH＝5，备用；

2)取膜溶剂大豆油40份，表面活性剂Span80 4.5份，膜增强剂液体石蜡2份，将三者进行混合，取此混合物按1∶2的体积比缓慢加入质量分数为5％的NaOH水溶液，在2500转/分的转速下搅拌10min，即制得稳定的乳状液；

3)将步骤1)得到的备用液与步骤2)得到的乳状液按照1∶3体积比加入到提取器中，在200转/分的低速搅拌提取20min；

静置分层，分离出乳液，水浴加热乳液进行破乳，静置后分离得到的水层，即为水蛭素溶液。