CN112316111A - 一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112316111A
CN112316111A CN202011220791.0A CN202011220791A CN112316111A CN 112316111 A CN112316111 A CN 112316111A CN 202011220791 A CN202011220791 A CN 202011220791A CN 112316111 A CN112316111 A CN 112316111A
Authority
CN
China
Prior art keywords
subtilin
mildew
tumor
effect
resistant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011220791.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112316111B (zh
Inventor
赵惠新
赵和平
谢尔瓦尼木
林荣荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinjiang Normal University
Original Assignee
Xinjiang Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinjiang Normal University filed Critical Xinjiang Normal University
Priority to CN202011220791.0A priority Critical patent/CN112316111B/zh
Publication of CN112316111A publication Critical patent/CN112316111A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112316111B publication Critical patent/CN112316111B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用，采用分离自新疆和硕境内连作棉田，经冬季低温自然冻封后的棉花根际土壤的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)，经提取、纯化和鉴定，抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的分子式为：C51H80N12O14，相对分子质量为1084.38，将其应用于制备抗肿瘤药物中，抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在体外对肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞都有很好的杀伤作用，其半致死浓度均在4‑20mg/L；采用灌胃、腹腔或静脉注射对小鼠肝癌肿瘤效果显著，其中剂量为3mg/kg时，腹腔注射，抑瘤率达80％以上；同时抗枯草菌素与DDP抗癌药物达到相同治疗效果的基础上，抗枯草菌素产生的副作用小，对小鼠体重增长的抑制作用显著低于DDP，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物应用。

Description

一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物与新医药技术领域，特别涉及一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
“癌症”，指恶性肿瘤，具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征。因病因不清，治疗困难，几个世纪以来，癌症像幽灵一般死死地纠缠着人类，每年要吞噬数百万人的生命。目前，根据患者的身体状况、肿瘤的病理类型、侵犯范围等，主要采用手术、化疗、放疗、免疫治疗等手段治疗癌症。手术治疗绝大多数早期肿瘤的首选治疗方法，虽然疗效直接，但对于中晚期病例风险极高，且对于部位敏感的肿瘤，如脑肿瘤等，即便是早期，手术治疗成功率也很低。化疗亦是癌症治疗的常用方法之一，但目前化疗所用的药物副作用很大，放疗一般需配合手术治疗，虽然对肿瘤具有较好的疗效，但在杀伤肿瘤细胞的同时，也会杀伤人体内的正常细胞，导致免疫系统功能受损。靶向治疗是近年来治疗癌症较为新兴的一个方式，其治疗目的明确、副作用小，对于一些敏感性强的患者，控制癌症发展的效果良好，但不是所有的癌症患者都适合用靶向治疗，只适用于一些体内存在基因突变的患者，而对大多数患者无效。目前，临床上使用的抗癌药物多为人工合成类药物，还缺乏疗效好、副作用小的药物。
目前报道芽孢杆菌属(Bacillus)革兰氏阳性杆菌菌株可以分泌多种环脂肽类化合物，其中部分环脂肽类物质具有较好的抗菌活性物质，比如表面活性素(Surfactin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)、伊枯草菌素(Iturin)和丰源素(fengycin)等。这些环脂肽类化合物主要由肽段和脂肪酸链组成环状结构，在芽孢杆菌内通过非核糖体途径合成，作为次级代谢产物排出菌体体外。这类物质分子量较低，现有研究表明，环脂肽类物质主要具有抗菌、抗炎、抗病毒等生物学功能。其中有关伊枯草菌素、芬介素、杆菌霉素、表面活性剂等环脂肽类物质抑癌功能均有报道，但未见抗霉枯草菌素抗癌功能和应用的报道。抗霉枯草菌素为伊枯草菌素同系物，抗霉枯草菌素环肽结构中的八个氨基酸残基中有两个与伊枯草菌素序列不同，在性质上较伊枯草菌素更稳定，在抗真菌活性上比伊枯草菌素更强。
发明内容
本发明针对伊枯草菌素性质不稳定，且尚未见有文献报道和披露抗霉枯草菌素在抗肿瘤方面应用的报道。本发明旨在于提供一种抗霉枯草菌素在抗肿瘤方面应用，本发明采用分离自枯草芽孢杆菌的抗霉枯草菌素，通过化合物的提取、纯化和鉴定，抗霉枯草菌素的分子式为：C51H80N12O14，相对分子质量为1084.38，将该化合物应用于制备抗肿瘤的药物中，抗霉枯草菌素在体外对肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞都有很好的杀伤所用，其半致死浓度均在4-20mg/L；采用灌胃、腹腔或静脉注射对小鼠肝癌肿瘤都有很好的效果，其中3mg/kg剂量腹腔注射，抑瘤率达80％以上。
为了达到以上技术目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用。
同时本发明提供一种在制备抗肿瘤药物中应用的抗霉枯草菌素的提取方法，包括如下步骤：
(1)将保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于装有5mL NB培养液的试管中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养12h，得种子液；
(2)将步骤(1)中所得种子液以以体积比1:10接种于含有发酵培养基的三角瓶中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养18-36h，得发酵液，用抽滤法去除菌体，收集无菌发酵液。
(3)将浓盐酸加入步骤(2)所得无菌发酵液，调节pH值至2.0，于4℃静置10h，离心后取沉淀，得到粗提物浸膏。
(4)将步骤(3)所得粗提物浸膏用20mL正丁醇充分溶解，然后离心去除不溶性杂质，对上清液进行半制备液相纯化，获得抗霉枯草菌素。
所述抗霉枯草菌素的分子式为C51H80N12O14，相对分子质量为1084.38，结构式为：
Figure BDA0002761913550000041
所述抗霉枯草菌素可在制备治疗肝癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌等的抗肿瘤药物中应用。
本发明中，采用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)株为农业部允许使用的无害安全菌株，可于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)等公共渠道购买，普通技术人员可以通过公众渠道获得，该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)培养采用公知的培养基和培养方法，本发明采用的菌种分离自新疆和硕连作棉田根际土壤，该菌种于2017年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC No：M2017309。
采用上述技术方案后，本发明获得有益效果如下：
(1)抗霉枯草菌素在体外对肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞都有很好的杀伤所用，其半致死浓度均在4-20mg/L。且通过体内试验表明，灌胃、腹腔或静脉注射对小鼠肝癌肿瘤都有很好的效果，其中3mg/kg剂量腹腔注射，抑瘤率达80％以上。
(2)本发明提供的抗枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用，抗枯草菌素与DDP抗癌药物达到相同治疗效果的基础上，抗枯草菌素产生的副作用小，对小鼠体重增长的抑制作用显著低于DDP，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物应用。
附图说明：
图1抗霉枯草菌素分子结构字母式简图。
图2抗霉枯草菌素分子结构线条式简图。
图3为不同浓度抗霉枯草菌素对鼠源肝癌细胞H22致死作用。
图4为不同浓度抗霉枯草菌素对人源肝癌细胞Bel7404致死作用图。
图5为抗霉枯草菌素引起鼠源肝癌细胞H22凋亡的流式细胞检测象限图，图中，a抗霉枯草菌素浓度为0μg/mL、b抗霉枯草菌素浓度为10μg/mL、c抗霉枯草菌素浓度为20μg/mL、d抗霉枯草菌素浓度为40μg/mL、e抗霉枯草菌素浓度为50μg/mL、f抗霉枯草菌素浓度为100μg/mL。
图6为抗霉枯草菌素引起人源肝癌细胞Bel7404凋亡的流式细胞检测象限图，图中，a抗霉枯草菌素浓度为0μg/mL、b抗霉枯草菌素浓度为10μg/mL、c抗霉枯草菌素浓度为20μg/mL、d抗霉枯草菌素浓度为40μg/mL、e抗霉枯草菌素浓度为50μg/mL、f抗霉枯草菌素浓度为100μg/mL。
图7为腹腔注射不同剂量抗霉枯草菌素对小鼠肝癌肿瘤抑制作用图。
图8为腹腔注射不同剂量抗霉枯草菌素对小鼠肝癌肿瘤抑制作用统计图。
图9为腹腔注射不同剂量抗霉枯草菌素对荷瘤(肝癌)小鼠体重的影响图。
图10为不同浓度抗霉枯草菌素对人源宫颈癌细胞Hela致死作用图。
图11为不同浓度抗霉枯草菌素对人源肺癌细胞A549致死作用图。
图12为不同浓度抗霉枯草菌素对人源结肠癌细胞Sw480致死作用图。
具体实施方式
下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下属实施例。
本发明中选用的所有材料、实际和仪器的测定方法都为本领域熟知的但不限制本发明的实施例，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可以适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1：抗霉枯草菌素的制备
一种在抗肿瘤中应用的抗霉枯草菌素的提取方法，具体包括如下步骤：
(1)将保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于装有5mL NB培养液的试管中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养12h，得种子液；
(2)将步骤(1)中所得种子液以以体积比1:10接种于含有发酵培养基的三角瓶中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养18-36h，得发酵液，用抽滤法去除菌体，收集无菌发酵液。
(3)将浓盐酸加入步骤(2)所得无菌发酵液，调节pH值至2.0，于4℃静置10h，离心后取沉淀，得到粗提物浸膏。
(4)将步骤(3)所得粗提物浸膏用20mL正丁醇充分溶解，然后离心去除不溶性杂质，对上清液进行半制备液相纯化，获得抗霉枯草菌素。
将充分干燥的抗霉枯草菌素用500～600uL氘代丙酮溶解，完全溶解后转移至核磁管内密封，用于测试1H-NMR和13C-NMR核磁共振波谱，核磁谱的测定由北京师范大学代为测定完成。
从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中提取并分离了抗霉枯草菌素，经过进一步的纯化，结合高效液相色谱，质谱和核磁共振技术分析鉴定该化合物的结构特征参见附图1-2所示。
实施例2：抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
本实施例在实施例1的基础上，使用细胞体外培养技术，在体外贴壁培养的人源肝癌细胞Bel7404中添加不同剂量的抗霉枯草菌素，不添加抗霉枯草菌素或DDP为空白对照，以其它条件完全一致，处理一定时间，采用MTT法测定活性细胞量，考察抗霉枯草菌素在体外对鼠源及人源肝癌细胞的致死作用；用不同剂量抗霉枯草菌素处理定量细胞一段时间后，收集细胞，采用流式细胞检测法检测，做象限图考察抗霉枯草菌素对诱导鼠源肝癌细胞H22及人源肝癌细胞Bel7404凋亡的作用。
(1)细胞培养
细胞培养基为含8％-15％胎牛血清、5％青霉素-链霉素双抗的DMEM完全培养基，于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养细胞，待单层细胞融合至70％以上，胰蛋白酶消化，收集细胞备用。
(2)MTT法检测抗霉枯草菌素对对鼠源肝癌细胞H22、人源肝癌细胞Bel7404的致死作用
将生长至对数期的Bel7404细胞，制备成细胞数为5.0×104个/mL的单细胞悬液，按照100μL/孔取单细胞悬液接入96孔培养板培养，待细胞完全贴壁后，弃培养液上清液；按照4mL/孔加入DMEM完全培养基，分别含不同浓度的抗霉枯草菌素100μL，最终浓度分别为0(空白组)、4、8、12、16μg/mL，另以终浓度为20μg/mL DDP作为对照组。每个处理平行进行6个孔，培养24h后，每孔中加入浓度为5mg/mL的MTT 20μL，置于CO2培养箱中继续培养4h后，弃培养板孔内上清，按照添加量为150μL/孔加入DMSO，充分振荡使蓝紫色沉淀充分溶解。用酶标仪在490nm处测定吸光度值，计算抑制细胞活性率。细胞增殖抑制率计算按照下列公式：抑制率％＝[1-(实验组OD值/空白组OD值)]×100％。同样方法检测抗霉枯草菌素对鼠源肝癌细胞H22致死作用。
(3)流式细胞检测法
收集对数生长期细胞，制备成细胞数为1×105个/mL的单细胞悬液，接种于60mm细胞培养皿中，待细胞完全贴壁后，弃培养液上清，加入不同浓度的抗霉枯草菌素4mL于各培养皿中，抗霉枯草菌素终浓度分别为0、10、20、40、50、100μg/mL，每个浓度平行做3个重复，培养24h后，用胰酶消化，收集细胞，再用预冷PBS洗涤细胞2次，将细胞重悬于500μL的结合缓冲液中(细胞密度为1.0×106个/mL)，加入5μL Annexin V-FITC和10μL的PI染料，轻轻混匀，室温避光反应15min，流式细胞仪测细胞凋亡率。
(4)结果分析
本实施例通过体外贴壁培养的人源肝癌细胞Bel7404中添加不同剂量的抗霉枯草菌素，以添加DDP为抗癌药物对照，考查了抗霉枯草菌素对鼠源肝癌细胞H22、人源肝癌细胞Bel7404的作用，具体结果分别参见附图3-4。由附图3-4可知，随着抗霉枯草菌素添加浓度的增加，其对鼠源肝癌细胞H22致死作用逐渐增强，且当抗霉枯草菌素添加量为12-20μg/mL时，其对鼠源肝癌细胞H22的致死作用，比添加20μg/mL DDP抗癌药物更强。抗霉枯草菌素添加量为11-15μg/mL时，其对人源肝癌细胞Bel7404致死作用比添加20μg/mLDDP抗癌药物更强。这也表明，抗霉枯草菌素对鼠源肝癌细胞H22及人源肝癌细胞Bel7404的致死作用均显著强于DDP。
通过采用流式细胞检测法，本试验进一步考察抗霉枯草菌素对诱导鼠源肝癌细胞H22及人源肝癌细胞Bel7404凋亡的作用，由附图5-6的数据可知，抗霉枯草菌素对H22、Bel7404细胞均有诱导凋亡作用。
实施例3：抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
(1)抗霉枯草菌素对小鼠肝癌肿瘤生长的影响试验
本实施例在实施例1的基础上，取皮下荷瘤(肝癌)小鼠(昆明小鼠)48只，以12只为1组，随机分为4组，分别用体积相同的盐水、剂量为1mg/kg抗霉枯草菌素溶液、剂量为3mg/kg抗霉枯草菌素溶液、剂量为2mg/kg DDP溶液对小鼠进行腹腔注射处理，四组分别记为CK、1mg/kg J-15-MYC、3mg/kg J-15-MYC、2mg/kg DDP组。其中前三组每天注射1次、2mg/kg DDP组隔天注射一次。共给药处理20天。用游标卡尺跟踪测量各组小鼠肿瘤体积变化，并在治疗20天时处死小鼠、解剖出肿瘤，称量肿瘤重量，及小鼠的死亡率进行统计分析。结果参见附图7-9及附表1所示。
由附图7-8及附表1的结果可知，通过腹腔注射不同剂量的抗霉枯草菌素溶液对小鼠肝癌肿瘤的抑制，较不进行处理的对照组有明显改善，随着注射天数的增加，肿瘤的体积变大趋势被抑制，且随着注射剂量的增加肿瘤的体积变大趋势抑制更显著，当抗霉枯草菌素注射剂量为3mg/kg，注射天数为20天时，肿瘤体积被抑制在50mm3以内，这与注射剂量为2mg/kg的DDP抑制作用相当，这表明，抗霉枯草菌素对肝瘤肿瘤的生长有明显的抑制作用。进一步考察腹腔注射抗霉枯草菌素对荷瘤(肝癌)小鼠体重的影响，由附图9可知，小鼠的体重随着抗霉枯草菌素注射天数的增加，小鼠的体重与对照组相比无显著差异，而对比注射2mg/kg的DDP小鼠体重，注射DDP的小鼠体重在注射10天后开始降低，注射20天时，小鼠的体重低于原始体重，表明注射DDP对小鼠生长有明显的副作用，而注射抗霉枯草菌素组小鼠的体重增重显著优于注射DDP组，表明注射抗霉枯草菌素对小鼠产生副作用小于注射DDP；同时对小鼠瘤重、死亡率抑瘤率进行了统计具体结果见表1。由表1的数据可知，肿瘤重量因抗霉枯草菌素的作用而被抑制，抗霉枯草菌素注射剂量为1mg/kg和3mg/kg时，抗霉枯草菌素抑瘤率分别为65.2-84.3％。其中注射剂量为3mg/kg抗霉枯草菌素抑瘤率与注射DDP的抑瘤率分别为84.3％和87.4％，二者无显著性差异，对比二者小鼠死亡率，注射抗霉枯草菌素组小鼠死亡率明显降低，特别是当抗霉枯草菌素的注射剂量为3mg/kg时，小鼠的死亡率为0％，而注射DDP组小鼠死亡率高达36.3％，这进一步表明，在抑瘤率相当的情况下，抗霉枯草菌素对小鼠的副作用显著减小。
表1：腹腔注射抗霉枯草菌素对小鼠肝癌肿瘤重量、小鼠死亡率的影响
组别 瘤重(g) 抑瘤率(％) 死亡率(％)
control 1.108±0.587 - 9.09
1mg/kg J-15-MYC 0.386±0.117 65.2 10.00
3mg/kg J-15-MYC 0.174±0.044<sup>a</sup> 84.3 0.00
2mg/kg ddp 0.14±0.097<sup>a</sup> 87.4 36.30
实施例4：抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
本实施例在实施例1的基础上，使用细胞体外培养技术，在体外培养的人宫颈癌细胞Hela细胞中添加不同剂量的抗霉枯草菌素，以添加DDP为抗癌药物对照，以其它条件完全一致，处理一定时间，采用MTT法测定活性细胞量，考察抗霉枯草菌素在体外对宫颈癌细胞Hela细胞的致死作用，具体结果见附图10所示。
由附图10的结果可知，抗霉枯草菌素处理24-48h对宫颈癌细胞Hela有致死作用，半致死剂量介于12-16μg/ml。
实施例5：抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
本实施例在实施例1的基础上，使用细胞体外培养技术，在体外培养的人肺癌细胞A549中添加不同剂量的抗霉枯草菌素，以添加DDP为抗癌药物对照，以其它条件完全一致，处理一定时间，采用MTT法测定活性细胞量，考察抗霉枯草菌素在体外对肺细胞A549的致死作用，具体结果参见附图11所示。
由附图11的结果可知，抗霉枯草菌素对肺癌细胞A549有致死作用，半致死剂量约为16μg/ml。
实施例6：抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
本实施例在实施例1的基础上，使用细胞体外培养技术，在体外培养的结肠癌细胞-Sw480细胞中添加不同剂量的抗霉枯草菌素，以添加DDP为抗癌药物对照，以其它条件完全一致，处理一定时间，采用MTT法测定活性细胞量，考察抗霉枯草菌素在体外对结肠癌癌细胞的致死作用，具体结果参见附图12所示。
由附图12的结果可知，抗霉枯草菌素对Sw480细胞有致死作用，半致死剂量介于8-12μg/ml。
综上所述，采用分离自新疆和硕境内连作棉田，经冬季低温自然冻封后的棉花根际土壤的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抗霉枯草菌素，通过化合物的提取、纯化和鉴定，抗霉枯草菌素的分子式为：C51H80N12O14，相对分子质量为1084.38，将其应用于抗肿瘤的药物中，抗霉枯草菌素在体外对肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞都有很好的杀伤作用，其半致死浓度均在4-20mg/L；采用灌胃、腹腔或静脉注射对小鼠肝癌肿瘤效果显著，其中抗霉枯草菌素剂量为3mg/kg时，腹腔注射，抑瘤率达80％以上；同时抗枯草菌素与DDP抗癌药物达到相同治疗效果的基础上，抗枯草菌素产生的副作用小，对小鼠体重增长抑制作用显著低于DDP，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物应用。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.一种在制备抗肿瘤药物中应用的抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)将保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于装有5mL NB培养液的试管中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养12h，得种子液；
(2)将步骤(1)中所得种子液以以体积比1:10接种于含有发酵培养基的三角瓶中，并在37℃、180r·min-1下振荡培养18-36h，得发酵液，用抽滤法去除菌体，收集无菌发酵液。
(3)将浓盐酸加入步骤(2)所得无菌发酵液，调节pH值至2.0，于4℃静置10h，离心后取沉淀，得到粗提物浸膏。
(4)将步骤(3)所得粗提物浸膏用20mL正丁醇充分溶解，然后离心去除不溶性杂质，对上清液进行半制备液相纯化，获得抗霉枯草菌素。
3.如权利要求1所述一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的分子式为C51H80N12O14，相对分子质量为1084.38，结构式为：
Figure FDA0002761913540000021
4.如权利要求1所述的一种抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗霉枯草菌素可在制备治疗肝癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌的抗肿瘤药物中应用。
CN202011220791.0A 2020-11-05 2020-11-05 一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用 Active CN112316111B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011220791.0A CN112316111B (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011220791.0A CN112316111B (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112316111A true CN112316111A (zh) 2021-02-05
CN112316111B CN112316111B (zh) 2024-03-29

Family

ID=74316031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011220791.0A Active CN112316111B (zh) 2020-11-05 2020-11-05 一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112316111B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105648001A (zh) * 2016-01-28 2016-06-08 淮阴工学院 对橙色粘球菌jch-04次级代谢产物分离纯化提取抗霉枯草菌素的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105648001A (zh) * 2016-01-28 2016-06-08 淮阴工学院 对橙色粘球菌jch-04次级代谢产物分离纯化提取抗霉枯草菌素的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAOBIN ZHAO等: "Potential of iturins as functional agents: safe, probiotic, and cytotoxic to cancer cells" *
李红亚等: "益生芽孢杆菌脂肽类抑菌成分的高效液相色谱－电喷雾串联质谱分析" *
谢尔瓦尼木·阿不都艾尼: "枯草芽孢杆菌J-15次生代谢产物的抑肝癌作用及机制研究" *
金清等: "新型抗菌肽--表面活性素、伊枯草菌素和丰原素" *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112316111B (zh) 2024-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114306616B (zh) 脆弱拟杆菌和免疫检查点抑制剂的新应用
CN114891677B (zh) 一种具有抗癌作用的菌株的分离及应用
CN106668022B (zh) 氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂TJM2010-5的应用
CN100522184C (zh) 具有抗肿瘤和抗毒活性的提取物
CN108553455B (zh) 三醛基间苯三酚缩氨基硫脲杂合体化合物在抗肿瘤药物中的应用
CN112316111B (zh) 一种抗霉枯草菌素在制备抗肿瘤药物中的应用
WO2024031928A1 (zh) α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用及药物
CN114404598B (zh) 脆弱拟杆菌荚膜多糖a联合pd-1抑制剂在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用
CN107286123B (zh) 一种二苯呋喃类化合物的制备方法与应用
CN111803484B (zh) 奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用
CN103992394B (zh) 一种人工合成的阳离子肽及其在制备抗肿瘤药物中的用途
WO2018058863A1 (zh) 聚醚类化合物用途
CN112138018A (zh) 铁皮石斛多糖在制备靶向肿瘤相关巨噬细胞治疗肿瘤药物中的应用
CN101862313A (zh) 蒽环类化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用
CN114106097B (zh) 用于治疗肝细胞癌的多肽及其应用
CN111655252A (zh) 含有亚铁氨基酸粒子的组合物及其用于制造治疗或改善胰脏相关疾病的医药品的用途
CN116421590B (zh) 二乙酸氯己定在制备预防或/和治疗肝癌的药物中的用途
CN104887681B (zh) 一种抑制肺癌细胞转移的组合药物以及检测方法
CN107737332B (zh) 一种蜘蛛细胞毒活性肽在抗肿瘤药物研发中的应用
CN114642675B (zh) L-山梨糖在制备治疗肿瘤的药物中的应用
CN104873513B (zh) 一种抑制肺癌细胞转移的药物组合物以及检测方法
CN113181166B (zh) 莪术烯醇在制备抗肺癌药物中的应用
EP4342463A1 (en) Stilbene compounds for use in the treatment of tumour and eye diseases
CN114224880B (zh) 5,7,4`-三甲氧基黄酮在制备预防和治疗抗肿瘤药物中的应用
CN113402630B (zh) 一种壳聚糖衍生物递药载体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant