CN112315867B - 一种五味子胶红酵母发酵提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种五味子胶红酵母发酵提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于化妆品原料技术领域，公开了一种五味子胶红酵母发酵提取物及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：(1)将五味子粉碎后按质量比1:2‑1:10与水混合均匀，巴氏消毒后冷却至室温，加入果胶酶，得到五味子粉碎液；将胶红酵母活化、扩增后，加入五味子粉碎液中，每千克五味子粉碎液加入1×106‑1×109个胶红酵母活菌体；在20‑32℃温度下，培养24‑72小时，得到五味子胶红酵母发酵液；将五味子胶红酵母发酵液升温至40‑60℃，保温2‑8小时后离心，并将离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤，得到五味子胶红酵母发酵提取物。本发明方法保留了五味子良好的抑菌效果，提高了抗氧化性，降低了刺激性。

Description

一种五味子胶红酵母发酵提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化妆品原料技术领域，特别涉及一种五味子胶红酵母发酵提取物及其制备方法和应用。
背景技术
五味子为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis(Turcz.)Bailll]及华中五味子(Schisandra sphenanthera Rehd et Wils.)的干燥成熟果实，前者称北五味子，后者称南五味子，是常用的药食同源的中草药。药理学研究表明：五味子除了具有镇静、催眠、抗惊厥等作用外，还具有强心、保肝、抑菌、抗肿瘤、抗氧化及延缓衰老等功效。
胶红酵母广泛分布于自然界，在土壤、动物、植物体内、河、湖泊等淡水水域和含盐的海洋环境均有胶红酵母菌的存在。营养成分丰富，除了富含蛋白质、多糖等常规营养成分还含有类胡萝卜素、多不饱和脂肪酸、VE等多种生物活性物质。
五味子提取工艺主要以有机溶剂提取为主，传统提取工艺由水或者有机溶剂提取，水提存在回收率低，有机溶剂提取有环境和安全性方面的考虑。而且这类植物提取物普遍存在过敏源，对皮肤有一定的刺激，存在较大的风险。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种五味子胶红酵母发酵提取物的制备方法；该方法通过五味子胶红酵母生物发酵的方法不仅保留了五味子良好的抑菌效果，而且提高了五味子中活性成分的回收率，快速降解致敏物。
本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的五味子胶红酵母发酵提取物。
本发明的再一目的在于提供一种上述五味子胶红酵母发酵提取物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种五味子胶红酵母发酵提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将五味子粉碎后按照质量比1:2-1:10与水混合均匀，经过巴氏消毒处理，冷却至室温，加入果胶酶，得到五味子粉碎液；
(2)将胶红酵母活化、扩增后，加入步骤(1)所得五味子粉碎液中，每千克五味子粉碎液加入1×106-1×109个胶红酵母活菌体；在20-32℃温度下，培养24-72小时，得到五味子胶红酵母发酵液；
(3)将步骤(2)所得五味子胶红酵母发酵液升温至40-60℃，保温2-8小时后离心，并将离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤，得到五味子胶红酵母发酵提取物。
步骤(1)中所述五味子是南五味子和/或北五味子的新鲜果实或干燥果实。
步骤(1)中所述果胶酶的加入量为五味子粉碎液质量的0.01％。
步骤(2)中所述将胶红酵母活化、扩增是采用液体培养或者固体平板培养；所述胶红酵母活菌体是酵母液、酵母干粉或酵母泥。
步骤(3)中所述将发酵液升温后保温处理是为了促进酵母自溶，释放更多活性物质，是酵母自溶常规处理方式，此温度范围下也有利于降低五味子活性损失。
一种根据上述的制备方法制备得到的五味子胶红酵母发酵提取物。
上述的五味子胶红酵母发酵提取物在化妆品中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明中所用的酵母为胶红酵母，与酿酒酵母相比，胶红酵母有更丰富的分泌酶，淀粉酶、纤维素酶、角质酶等，能加快分解五味子中对皮肤刺激的成分，即使较低的接种量也能充分分解。
(2)本发明中五味子经过胶红酵母发酵，与酿酒酵母发酵相比，胶红酵母能发酵生产多种抗氧化活性物，例如β-胡萝卜素、虾青素等，五味子所含成分能促进胶红酵母发酵生产更多抗氧化物质，从而起使得发酵提取物更具活性。
(3)本发明中的五味子经过胶红酵母发酵，与酿酒酵母相比，胶红酵母生长代谢过程可产生多不饱和脂肪酸等疏水性物质，减少部分五味子活性物在酵母菌体上吸附。在保证发酵分解五味子所含刺激成分的前提下，可以选择更低接种量，减少酵母菌体对五味子抑菌成分的吸附，从而使得发酵更具优势。
附图说明
图1是胶红酵母和酿酒酵母对五味子不同接种量所得发酵提取物的DPPH自由基清除率图。
图2是五味子粉碎液及高温对胶红酵母和酿酒酵母发酵提取物的DPPH自由基清除率图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)取五味子100g，粉碎后与1000g的水混合均匀，巴氏消毒处理冷却室温加入果胶酶，得到五味子粉碎液；所述果胶酶的加入量为五味子粉碎液质量的0.01％；
(2)每千克五味子粉碎液分别接种胶红酵母种子液1、2、4、6、8、12ml(1×106CFU/ml)，25℃培养48小时，得到不同接种量发酵的五味子胶红酵母发酵液；
(3)五味子胶红酵母发酵液升温至50℃，保温3小时后离心，并将离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤，得到不同接种量发酵的提取物。
实施例2
(1)取五味子100g，粉碎后与300g水混合均匀，巴氏消毒处理冷却至室温加入果胶酶，得到五味子粉碎液；所述果胶酶的加入量为五味子粉碎液质量的0.01％；
(2)取上述得到粉碎液1g，加入200ml基础发酵培养基中；基础发酵培养基的配方包括以下质量百分比计的成分：葡萄糖5％、(NH4)2SO4 0.1％、KH2PO40.1％、CaCl20.01％、NaCl 0.04％、MgSO4·7H2O 0.1％，pH调至6.5；
(3)将10ml(1×106CFU/ml)胶红酵母种子接入上述培养基中，培养24小时，离心取样上清液检测。
对比例1
将实施例1中的胶红酵母换成酿酒酵母，其余条件不变，得不同接种量的酿酒酵母发酵提取物。
对比例2
高温处理：将实施例2中的步骤(1)制备的粉碎液121℃处理30min，其余条件不变；
空白处理：将实施例2中的步骤(1)删减，步骤(2)中的粉碎液换成等质量的水，其余条件不变。
对比例3
将实施例2与对比例2中的胶红酵母换成酿酒酵母，其余条件不变。
对比例4
五味子乙醇提取工艺参考以下文献：《五味子提取工艺优化及乙醇提取物的皮肤细胞抗氧化作用研究》[J].药学实践杂志,2019,(第3期)，具体按照以下步骤：
称取100g五味子药材，粉碎后加入1000g水，50～60℃加热蒸煮2h，过滤，弃滤液，得药渣；对药渣进行进一步乙醇提取，加10倍质量的70％乙醇，60℃提取60分钟，所得的乙醇提取液过滤，滤液中加入壳聚糖，絮凝大分子杂质，并精滤；所得滤液反复蒸馏；对滤液进行浓缩除醇得到五味子乙醇提取物。
对各提取物的评价：
为了客观比较，对上述所有实施例和对比例的提取物冷冻干燥，用同等质量五味子得到的提取物，做抗氧化活性、抑菌效果、安全性三者的比较。
(1)抗氧化活性测定：
将实施例1和对比例1所得提取物进行抗氧化活性测定，按照每1g五味子得到的提取物的量，用95％乙醇定容于1000ml，参照《T/SHRH 006-2018化妆品-自由基(DPPH)清除实验方法》，测定DPPH清除率。如图1所示，实施例1与对比例1中，胶红酵母在不同接种量下得到的提取物均优于酿酒酵母，胶红酵母比酿酒酵母发酵五味子更具抗氧化活性。
将实施例2、对比例2和对比例3所得发酵上清液进行抗氧化活性测定，发酵上清液100ml冷冻干燥后，用95％乙醇定容于50ml，参照《T/SHRH006-2018化妆品-自由基(DPPH)清除实验方法》，测定DPPH清除率。实施例2所得发酵上清液为不作处理组，对比例2中高温处理后的发酵上清液为高温处理组，对比例2中空白处理的发酵上清液为空白对照组，对比例3用酿酒酵母发酵所得各发酵上清液分别对应上述三组，结果如图2所示：实施例2中的胶红酵母在加入五味子粉碎液后，相比对比例2空白对照组的发酵上清液中的抗氧化活性物质明显增加，而且从对比例2高温处理组看来五味子粉碎液经过高温处理之后再用胶红酵母发酵所得发酵上清液在抗氧化活性物质不多，可见五味子中存在不耐高温的活性物质，而这些不耐高温的活性物质正是对胶红酵母发酵有促进作用；对比例3中，五味子粉碎液对酿酒酵母发酵液的活性影响不大。总之，五味子粉碎液中的活性成分促进了胶红酵母发酵产生更多抗氧化活性物质，两者结合发酵更具优势。
(2)抑菌效果评价：
用抑菌圈法测定提取物的抑菌效果。抑菌圈的大小反映抑菌效果，通过测量抑菌圈的直径来判定提取物对测试菌抑制效果。将实施例1和对比例1所得提取物进行抑菌效果评价，按照每50g五味子得到的提取物的量，用30％乙醇溶液定容于100ml。
将活化后的测试菌菌液调至600nm＝2.3，LB琼脂培养基置室温使其冷却至50℃，按100ml培养基中加入100ul菌液，摇匀。吸取含测试菌的培养基10.5ml于90mm培养皿内均匀摊布，使其在水平台面上凝固，凝固后用灭菌的打孔器(3mm)打孔，每孔加入5ul样品液。37℃培养18小时后测定抑菌圈直径。
如表1所示，由实施例1得到不同接种量的五味子胶红酵母发酵提取物其抑菌活性随着接种量增加先升后降，即使增加接种量还能保留一定抑菌活性，对比例1中酿酒酵母发酵提取物随着接种量增加呈下降趋势，增加到一定值会失去抑菌活性。
表1抑菌活性评价
Figure BDA0002807502890000061
注：“-”表示无抑菌圈
(3)安全性检测
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例与对比例获得的五味子提取物进行人体封闭式斑贴试验，对其潜在皮肤刺激性进行评估。
实施例1中与对比例1中选取1ml、6ml、12ml接种量得到的提取物，胶红酵母提取物分别记作提取物A、提取物B、提取物C，酿酒酵母提取物分别记作提取物D、提取物E、提取物F。对比例4中所得五味子乙醇提取物，记作提取物G。
按照每10g五味子得到的提取物的量，用70％乙醇溶液定容于100ml。
试验对象：
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
试验方法：
移液器吸取0.050mL滴加于滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的70％乙醇。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。
斑贴试验评价：
其中，*"-"＝阴性反应；
一级不良反应："±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；
二级不良反应："+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；
三级不良反应："++"＝强阳性反应(疱疹反应)：红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，反应可超出受试区；
四级不良反应："+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)：明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，反应超出受试区。
根据化妆品卫生规范2007，人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。
从表2可以看出，实施例1中不同接种量获得的五味子胶红酵母发酵提取物未产生可疑反应，明显优于对比例4的五味子乙醇提取物，说明本发明提取物有更高的安全性。对比例1中不同接种量获得的酿酒酵母发酵提取物，较低接种量下存在一定刺激。
表2人体斑贴试验结果
Figure BDA0002807502890000081
Figure BDA0002807502890000091
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种五味子胶红酵母发酵提取物在化妆品中的应用，其特征在于：所述五味子胶红酵母发酵提取物按照以下步骤制备得到：
(1)将五味子粉碎后按照质量比1:2-1:10与水混合均匀，经过巴氏消毒处理，冷却至室温，加入果胶酶，得到五味子粉碎液；
(2)将胶红酵母活化、扩增后，加入步骤(1)所得五味子粉碎液中，每千克五味子粉碎液中接种4-6mL浓度为1×106 CFU/mL的胶红酵母种子液；在20-32℃温度下，培养24-72小时，得到五味子胶红酵母发酵液；
(3)将步骤(2)所得五味子胶红酵母发酵液升温至40-60℃，保温2-8小时后离心，并将离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤，得到五味子胶红酵母发酵提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述五味子是南五味子和/或北五味子的新鲜果实或干燥果实。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述果胶酶的加入量为五味子粉碎液质量的0.01％。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述将胶红酵母活化、扩增是采用液体培养或者固体平板培养；所述胶红酵母活菌体是酵母液、酵母干粉或酵母泥。
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