CN112314326B - 一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，属于牛樟芝培育技术领域，该方法包括以下步骤：马铃薯琼脂培养基的配制；蜜环菌的分离提纯；蜜环菌原液的制备；牛樟芝固体培养基的配制；牛樟芝子实体培养基的制备：将已脱水10%的栎树锯成20cm长木段，然后劈成小块，用铁圈扎捆，并用铁丝捆紧，再在外面套上聚丙稀袋，高压灭菌后冷却，然后无菌接入蜜环菌原液，置于室内培养，当蜜环菌菌索长到聚丙稀袋的袋底时，再在无菌室内接入牛樟芝原种，继续培养，直至长出牛樟芝子实体，本发明利用熟料短段木栽培，并采用蜜环菌培养，让蜜环菌将木质分解而利于牛樟芝菌生长，加速了牛樟芝的生长速度，缩短了牛樟芝的生长周期。

Description

一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法

技术领域

本发明涉及牛樟芝培育技术领域，更具体地说，它涉及一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法。

背景技术

牛樟芝，又名牛樟菇，属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属多年生菌类，只生长在台湾特有百年以上牛樟树干腐朽之心材内壁，或枯死倒伏之牛樟树木材潮湿表面。野生牛樟芝极其稀少，但因牛樟芝中含有可抑制癌细胞生长的三萜类化合物，能抑制癌细胞生长，提高人体免疫力，保肝护肝，促进血小板凝集等多种功效，近年来，不少科研人员已举力研究牛樟芝的人工栽培。然而牛樟芝子实体生长很慢，周期太长，因而成本造价太高且只能成年老树，资源太少，难以满足人们日益增大的需求。

为解决牛樟树资源短缺，子实体产生周期太长的问题，本发明提供一种利用小枝块段木熟料袋装速生栽培方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，包括以下步骤：

S1、马铃薯琼脂培养基的配制

以马铃薯、琼脂、葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母粉、维生素B1为原料，加水配制，得到马铃薯琼脂培养基；

S2、蜜环菌的分离提纯

选择皮棕红、尖端嫩白、海绵体粗而白的菌索，将其放入0.1%的升汞水中浸泡1min，取出按干，再用75%酒精棉消毒后去其外皮，得到白色海绵体；将白色海绵体放在消过毒平板上，用无菌刀切成1cm长的小段，用无菌夹接入带有马铃薯琼脂培养基的试管内，将试管置于22℃恒温箱，直至长出新菌索，得到蜜环菌母种；

S3、蜜环菌原液的制备

将玉米粉、麦麸、阔叶杂木屑和熟石膏粉混合，得到蜜环菌培养料；将马铃薯放入水中煮沸，过滤得到马铃薯水煮液；将蜜环菌培养料装入培养瓶中，盖上棉塞，常压灭菌，冷却后无菌接入蜜环菌母种，并置于22℃恒温箱培养30-45d，直至长满菌丝，得到蜜环菌原液；

S4、牛樟芝固体培养基的配制

将牛樟木屑或栎树木屑、麦麸、玉米粉、熟石膏粉和葡萄糖混合，得到牛樟芝培养料；将胡萝卜放入水中煮沸，过滤得到胡萝卜水煮液；将牛樟芝培养料装入培养瓶中，盖上棉塞，高压灭菌，冷却后无菌接入牛樟芝母种，并置于26℃恒温箱中在散光环境下培养60d，直至长满菌丝，得到牛樟芝原种。

S5、牛樟芝子实体培养基的制备

将已脱水10%的栎树锯成20cm长木段，然后劈成小块，用铁圈扎捆，并用铁丝捆紧，再在外面套上聚丙稀袋，高压灭菌后冷却至20℃，然后无菌接入蜜环菌原液，置于22-26℃室内培养40-50d，当蜜环菌菌索长到聚丙稀袋的袋底时，再在无菌室内接入牛樟芝原种，继续培养60d，直至长出牛樟芝子实体。

进一步优选为：在步骤S1中，按照马铃薯200g；琼脂18g；葡萄糖20g；蛋白胨5g；硫酸镁0.5g；磷酸二氢钾1g；酵母粉5g；维生素B10.1g；水1000g进行配制，得到马铃薯琼脂培养基。

进一步优选为：在步骤S3中，按照玉米粉：麦麸：阔叶杂木屑：熟石膏粉=59：20：20：1的质量比，称取玉米粉、麦麸、阔叶杂木屑和熟石膏粉，然后将其混匀，得到蜜环菌培养料。

进一步优选为：在步骤S3中，按照马铃薯：水=1：1.5质量比，将马铃薯放入水中煮沸。

进一步优选为：在步骤S3中，蜜环菌培养料装入培养瓶中时，倒入蜜环菌培养料以使蜜环菌培养料体积占培养瓶体积的3/5，然后将马铃薯水煮液加入瓶中，待蜜环菌培养料吸水饱和后，再加马铃薯水煮液以使水面高出蜜环菌培养料顶面1cm。

进一步优选为：在步骤S4中，按照牛樟木屑或栎树木屑：麦麸：玉米粉：熟石膏粉：葡萄糖=78：10：10：1：1的质量比，称取牛樟木屑或栎树木屑：麦麸：玉米粉：熟石膏粉：葡萄糖，然后将其混匀，得到牛樟芝培养料。

进一步优选为：在步骤S4中，按照胡萝卜：水=1：1.1质量比，将胡萝卜放入水中煮沸。

进一步优选为：在步骤S4中，牛樟芝培养料装入培养瓶中时，倒入牛樟芝培养料以使牛樟芝培养料体积占培养瓶体积的3/5，然后将胡萝卜水煮液加入瓶中，待牛樟芝培养料吸水饱和后，再加胡萝卜水煮液以使水面高出牛樟芝培养料顶面1cm。

进一步优选为：在步骤S5中，牛樟芝子实体培养过程中，培养室内温度为75-85℃，散射光强度为300lx。

进一步优选为：在步骤S5中，牛樟芝子实体培养过程中，牛樟芝子实体要定时采收。

综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明存在以下特点：

1.熟料短段木栽培，并采用蜜环菌培养，让蜜环菌将木质分解而利于牛樟芝菌生长，加速了牛樟芝的生长速度，缩短了牛樟芝的生长周期。

2.用短段木熟料栽培，提高了原材料的利用率，也缓解了牛樟树大树稀缺的矛盾。

3.用短段木熟料栽培，有力的控制了其他杂菌的污染，提高了产量。

4.有利于工厂化栽培，提高产品品质。

附图说明

图1是实施例1中的流程框图，主要用于体现利用段木熟料培育牛樟芝的方法。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。

实施例1：一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，如图1所示，包括以下步骤：

S1、马铃薯琼脂培养基（PAD）的配制

按照马铃薯（去皮）200g；琼脂18g；葡萄糖20g；蛋白胨5g；硫酸镁0.5g；磷酸二氢钾1g；酵母粉5g；维生素B10.1g；水1000g；Ph自然进行配制，得到马铃薯琼脂培养基。

配制时，先将清洗、去皮后的马铃薯切成小块，放入锅中，加水，煮沸30min，然后用纱布滤去马铃薯残渣，然后加入葡萄糖、琼脂，熔化后，再将其余营养物质全部加入，然后分装试管并制成斜面。

S2、蜜环菌的分离提纯

选择皮棕红、尖端嫩白、海绵体粗而白的菌索，将其放入0.1%的升汞水中浸泡1min，取出按干，再用75%酒精棉消毒后去其外皮，得到白色海绵体。将白色海绵体放在消过毒平板上，用无菌刀切成1cm长的小段，用无菌夹接入带有马铃薯琼脂培养基的试管内，将试管置于22℃恒温箱，直至长出新菌索，得到蜜环菌母种。

S3、蜜环菌原液的制备

按照玉米粉：麦麸：阔叶杂木屑：熟石膏粉=59：20：20：1的质量比，称取玉米粉、麦麸、阔叶杂木屑和熟石膏粉，然后将其混匀，得到蜜环菌培养料。按照马铃薯：水=1：1.5质量比，将马铃薯放入水中煮沸，过滤得到马铃薯水煮液。将蜜环菌培养料装入培养瓶中，稍压紧蜜环菌培养料，以使蜜环菌培养料体积占培养瓶体积的3/5，然后将马铃薯水煮液加入瓶中，待蜜环菌培养料吸水饱和后，再加马铃薯水煮液以使水面高出蜜环菌培养料顶面1cm。盖上棉塞，常压灭菌，冷却后再在无菌条件下接入蜜环菌母种，并置于22℃恒温箱培养40d，直至长满菌丝，得到蜜环菌原液。

S4、牛樟芝固体培养基的配制

按照牛樟木屑：麦麸：玉米粉：熟石膏粉：葡萄糖=78：10：10：1：1的质量比，称取牛樟木屑：麦麸：玉米粉：熟石膏粉：葡萄糖，然后将其混匀，得到牛樟芝培养料。按照胡萝卜：水=1：1.1质量比，将胡萝卜放入水中煮沸，过滤得到胡萝卜水煮液。将牛樟芝培养料装入培养瓶中，稍压紧牛樟芝培养料，以使牛樟芝培养料体积占培养瓶体积的3/5，然后将胡萝卜水煮液加入瓶中，待牛樟芝培养料吸水饱和后，再加胡萝卜水煮液以使水面高出牛樟芝培养料顶面1cm。盖上棉塞，高压灭菌，冷却后再在无菌条件下接入牛樟芝健康母种，并置于26℃恒温箱中在散光环境下（散射光强度低于300lx）培养60d，直至长满菌丝，得到牛樟芝原种。

牛樟芝母种培育过程为：将牛樟芝菇体切下，取菇体内部肉质，切成0.2-0.7cm菇块。装有马铃薯琼脂培养基的试管冷却后，将试管内蒸汽水烘干，然后放入超净工作台，菇块随同放入，以使菇块无菌接种于试管中，做好紫外线遮盖，开启紫外线灯灭菌。按正规操作程序进行牛樟芝子实体分离，分离好后，放于恒温箱内22℃保温培养，并每日检查。半个月后，菌丝长好后再扩管提纯，得到牛樟芝母种。

S5、牛樟芝子实体培养基的制备

将已脱水10%的栎树锯成20cm长木段，用刀劈成一寸面宽的小块。然后用一固定大小的铁圈扎捆，两头用小铁丝捆紧，要求边缘光滑无尖利物，再在外面再套上尺寸为40*65*6的聚丙稀袋，下部密封不漏气，上部用绳扎紧开口部。高压灭菌后冷却至20℃，然后在无菌条件下接入蜜环菌原液，置于24℃室内培养42d，当蜜环菌菌索长到聚丙稀袋的袋底时，再在无菌室内接入牛樟芝原种，继续培养60d，直至长出牛樟芝子实体。牛樟芝子实体培养过程中，培养室内温度为78℃，散射光强度为300lx。为增加牛樟芝药效含量，牛樟芝子实体要适时采收。

本发明存在以下特点：

1.熟料短段木栽培，并采用蜜环菌培养，让蜜环菌将木质分解而利于牛樟芝菌生长，加速了牛樟芝的生长速度，缩短了牛樟芝的生长周期。

2.用短段木熟料栽培，提高了原材料的利用率，也缓解了牛樟树大树稀缺的矛盾。

3.用短段木熟料栽培，有力的控制了其他杂菌的污染，提高了产量。

4.有利于工厂化栽培，提高产品品质。

本发明利用牛樟树树枝及边角料，以及用来种灵芝菌的麻栎、白栎等优质山毛榉科的树种（栎树），按照天麻、茯苓等共生菌的栽培方式，用蜜环菌帮助先期分解木材，让牛樟芝直接吸取营养，以达到牛樟芝快速生长的目的，极大的缩短了牛樟芝的生长周期，也极大的缓解了牛樟树奇缺的矛盾。

实施例2：一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，与实施例1的区别在于，在步骤S3中，接入蜜环菌母种后，在22℃恒温箱培养30d；在步骤S5中，接入蜜环菌原液后，在22℃的室内环境下，培养40d；牛樟芝子实体培养过程中，培养室内温度为75℃。

实施例3：一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，与实施例1的区别在于，在步骤S3中，接入蜜环菌母种后，在22℃恒温箱培养45d；在步骤S5中，接入蜜环菌原液后，在26℃的室内环境下，培养50d；牛樟芝子实体培养过程中，培养室内温度为85℃。

本牛樟芝动物抗疲劳活性试验

产品：实施例1中的牛樟芝子实体。

试验动物：昆明系小鼠，雌雄各半，体重20±2g，购于长春生物制品研究所。

牛樟芝对动物行为的影响：

1.动物行为学实验分组与给药

取雌雄各半昆明小鼠，随机分成8组，每组12只。所有实验动物均按照0.1mL/10g的体积，经口灌胃给药。低、中、高剂量牛樟芝子实体组浓度分别为0.1g/kg、0.3g/kg、0.9g/kg，空白对照组灌胃给予同体积生理盐水，连续进行2周。

2.自主活性实验

末次灌胃给药30min后，依次将空白组与0.1g/kg、0.3g/kg、0.9g/kg牛樟芝剂量组小鼠放置于自主活动测试仪中，盖上闭光板。实验小鼠首先进行适应5min，随后利用仪器记录5min内小鼠站立次数及自主活动次数，平行3次。

3.抗疲劳转棒实验

末次灌胃给药30min后，依次将空白组与0.1g/kg、0.3g/kg、0.9g/kg

牛樟芝剂量组小鼠放置于跑步机中。实验小鼠首先进行训练5min，使其掌握在转棒中保持平衡的方法。随后将转棒转速以每秒1rpm递增至20rpm，记录小鼠从放置开始到从转棒上跌落的时间，平行3次。

4.小鼠耐力跑实验

末次灌胃给药30min后，依次将空白组与0.1g/kg、0.3g/kg、0.9g/kg牛樟芝剂量组小鼠放置于跑步机中。实验小鼠首先进行训练5min，使其掌握逃离电击区的方法。随后将电流强度设置为最高，转速以每秒1rpm递增至20rpm，记录小鼠到力竭的跑步时间，力竭判定标准为小鼠在电击区静止10s。

5.负重游泳实验

末次灌胃给药30min后，依次在空白组与0.1g/kg、0.3g/kg、0.9g/kg牛樟芝剂量组小鼠尾根部负重铅粒，铅粒重量为小鼠体重的10%。将负重小鼠放置于直径为25cm，水深为小鼠2倍体长的游泳桶中，水温为27±1℃。测定各组小鼠力竭游泳时间。力竭游泳的标准是小鼠头部持续没入水中10s。

采用SPSS19.0统计软件分析各实验结果，采用t检验分析各组间显著性差异，若P≤0.05，差异在统计学上具有显著性意义。

结果：

1.自主活性实验

小鼠灌胃给药2周后，开展小鼠自主活动实验，考察牛樟芝对雄性和雌性小鼠中枢神经系统的影响。测定结果为：雌性小鼠自主活动次数普遍小于雄性小鼠自主活动，而站立次数实验中雄性与雌性小鼠间无明显差异。与空白组相比，各剂量组的雌性和雄性小鼠的自主活动次数与站立的次数均无明显的差异（P＞0.5），因此，可以推测牛樟芝对小鼠中枢神经系统可能无影响。

2.抗疲劳转棒实验

与空白组相比，对雌性小鼠而言，牛樟芝中和高剂量组能够显著影响其疲劳转棒实验的结果，延长小鼠立于转棒上的时间。但是，各剂量组对雄性在转棒上停留时间虽有增长趋势，但无显著意义。结果表明牛樟芝能够增加小鼠的耐力和平衡性。

3.小鼠耐力跑实验

对于雌性小鼠而言，牛樟芝中和高剂量组与空白组相比，能够显著延长小鼠耐力跑时间。对于雄性小鼠而言，牛樟芝高剂量组与空白组相比，具有显著的统计学意义。结果表明，无论雌性还是雄性小鼠，牛樟芝能够显著提高其耐力。

4.负重游泳实验

结果表明，与空白组相比，牛樟芝中和高剂量组能够显著延长雄性小鼠的负重游泳时间，但与空白组相比，各剂量组对雌性小鼠负重游泳时间的影响无显著差异。实验结果表明，牛樟芝可显著地延长小鼠负重游泳时间，缓解小鼠的疲劳度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、马铃薯琼脂培养基的配制

以马铃薯、琼脂、葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、酵母粉、维生素B1为原料，加水配制，得到马铃薯琼脂培养基；

S2、蜜环菌的分离提纯

选择皮棕红、尖端嫩白、海绵体粗而白的菌索，将其放入0.1%的升汞水中浸泡1min，取出按干，再用75%酒精棉消毒后去其外皮，得到白色海绵体；将白色海绵体放在消过毒平板上，用无菌刀切成1cm长的小段，用无菌夹接入带有马铃薯琼脂培养基的试管内，将试管置于22℃恒温箱，直至长出新菌索，得到蜜环菌母种；

S3、蜜环菌原液的制备

将玉米粉、麦麸、阔叶杂木屑和熟石膏粉混合，得到蜜环菌培养料；将马铃薯放入水中煮沸，过滤得到马铃薯水煮液；将蜜环菌培养料装入培养瓶中，倒入蜜环菌培养料以使蜜环菌培养料体积占培养瓶体积的3/5，然后将马铃薯水煮液加入瓶中，待蜜环菌培养料吸水饱和后，再加马铃薯水煮液以使水面高出蜜环菌培养料顶面1cm，盖上棉塞，常压灭菌，冷却后无菌接入蜜环菌母种，并置于22℃恒温箱培养30-45d，直至长满菌丝，得到蜜环菌原液；

S4、牛樟芝固体培养基的配制

将牛樟木屑或栎树木屑、麦麸、玉米粉、熟石膏粉和葡萄糖混合，得到牛樟芝培养料；将胡萝卜放入水中煮沸，过滤得到胡萝卜水煮液；将牛樟芝培养料装入培养瓶中，倒入牛樟芝培养料以使牛樟芝培养料体积占培养瓶体积的3/5，然后将胡萝卜水煮液加入瓶中，待牛樟芝培养料吸水饱和后，再加胡萝卜水煮液以使水面高出牛樟芝培养料顶面1cm，盖上棉塞，高压灭菌，冷却后无菌接入牛樟芝母种，并置于26℃恒温箱中在散光环境下培养60d，直至长满菌丝，得到牛樟芝原种；

S5、牛樟芝子实体培养基的制备

将已脱水10%的栎树锯成20cm长木段，然后劈成小块，用铁圈扎捆，并用铁丝捆紧，再在外面套上聚丙稀袋，高压灭菌后冷却至20℃，然后无菌接入蜜环菌原液，置于22-26℃室内培养40-50d，当蜜环菌菌索长到聚丙稀袋的袋底时，再在无菌室内接入牛樟芝原种，继续培养60d，直至长出牛樟芝子实体。

2.根据权利要求1所述的一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：在步骤S1中，按照马铃薯200g；琼脂18g；葡萄糖20g；蛋白胨5g；硫酸镁0.5g；磷酸二氢钾1g；酵母粉5g；维生素B10.1g；水1000g进行配制，得到马铃薯琼脂培养基。

3.根据权利要求1所述的一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：在步骤S3中，按照玉米粉：麦麸：阔叶杂木屑：熟石膏粉=59：20：20：1的质量比，称取玉米粉、麦麸、阔叶杂木屑和熟石膏粉，然后将其混匀，得到蜜环菌培养料。

4.根据权利要求1或3所述的一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：在步骤S3中，按照马铃薯：水=1：1.5质量比，将马铃薯放入水中煮沸。

5.根据权利要求1所述的一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：在步骤S4中，按照牛樟木屑或栎树木屑：麦麸：玉米粉：熟石膏粉：葡萄糖=78：10：10：1：1的质量比，称取牛樟木屑或栎树木屑：麦麸：玉米粉：熟石膏粉：葡萄糖，然后将其混匀，得到牛樟芝培养料。

6.根据权利要求5所述的一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：在步骤S4中，按照胡萝卜：水=1：1.1质量比，将胡萝卜放入水中煮沸。

7.根据权利要求1所述的一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：在步骤S5中，牛樟芝子实体培养过程中，培养室内温度为75-85℃，散射光强度为300lx。

8.根据权利要求7所述的一种利用段木熟料培育牛樟芝的方法，其特征在于：在步骤S5中，牛樟芝子实体培养过程中，牛樟芝子实体要定时采收。

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