CN112313329A - 干细胞培养用添加物和培养用培养基、以及培养方法 - Google Patents

干细胞培养用添加物和培养用培养基、以及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明的特征在于，制成含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的干细胞培养用添加物、或含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的干细胞培养用培养基，利用含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的干细胞培养用培养基进行干细胞的悬浮培养。根据本发明，在干细胞的悬浮培养中，能够提高干细胞的细胞团块形成率并控制其形状、进一步提高干细胞的增殖率和未分化维持率。

Description

干细胞培养用添加物和培养用培养基、以及培养方法
技术领域
本发明涉及添加在用于培养干细胞的培养基等中的干细胞培养用添加物和用于培养干细胞的培养基、以及干细胞的培养方法。
发明背景
以胚胎干细胞、人工多能干细胞为代表的人干细胞通过使用以基质胶、玻连蛋白、层粘连蛋白等人型重组体基质等作为锚定材料的粘附培养维持增殖。
然而，为了将干细胞应用于研究、生产、医疗等，寻求高效增殖的培养方法。作为大量培养干细胞的方法，广泛使用的是以细胞团块的状态悬浮培养的方法，而不是上述粘附培养。
对干细胞进行悬浮培养时，为了抑制细胞的过度凝集并且不会由于培养液流产生的剪切应力而引起细胞死亡，正在开发具有改良的搅拌子的悬浮培养装置、驱动培养容器本身而使培养液流动的培养装置。
细胞团块的培养中，为了确保细胞品质、进行最适的工艺构建，希望控制细胞团块形成率、形状，为干细胞的情况下，要求不会由于培养而分化，维持未分化能力。
作为涉及的控制方法，正在考虑利用培养基、培养基成分、培养器材的控制，开发以向大量培养扩大为前提的培养基质、培养液。例如，正在开发不含层状片段(LM－E8)、玻连蛋白片段(VTN－N)等来自异种动物的成分的(无异种蛋白)培养基质、无异种蛋白、进一步无白蛋白的无血清培养基(非专利文献1、2)。
但特别希望有能够应用于大量悬浮培养、不会使细胞品质降低的控制方法。
此外，最近报道硫酸葡聚糖具有控制多能性干细胞(人胚胎干细胞)的凝集的效果，促进均匀且小的细胞凝集团的生成(非专利文献3)。
然而，非专利文献3中虽然记载了4,000kDa～40,000kDa的高分子量硫酸葡聚糖的上述效果，但没有具体提及任何关于低分子量的硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖以外的多糖类的效果。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:生物工程92(9)469-472(2014)
非专利文献2:生物工程92(9)487-490(2014)
非专利文献3:Biotechnology and Bioengineering 2018,1-6
发明概述
发明所要解决的课题
本发明是基于上述情况做出的。
即，本发明的目的在于，提供适合用于在干细胞的悬浮培养中提高干细胞的细胞团块形成率并控制其形状、进一步提高干细胞的增殖率和未分化维持率的培养用添加物，进一步，提供用于培养干细胞的培养基以及干细胞的培养方法。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现，通过将含有低分子量的硫酸葡聚糖等硫酸化多糖等高分子量硫酸葡聚糖以外的多糖类的添加物添加在干细胞培养用培养基中进行干细胞的悬浮培养，或者通过利用含有低分子量的硫酸葡聚糖等硫酸化多糖等高分子量硫酸葡聚糖以外的多糖类的干细胞培养用培养基进行干细胞的悬浮培养，能够提高干细胞的增殖率和存活率，进一步提高细胞团块形成率，也能够良好控制细胞团块的形状，能够提高未分化维持率，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
[1]一种干细胞培养用添加物，含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类。
[2]根据[1]所述的添加物，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上。
[3]根据[1]或[2]所述的添加物，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为作为前述硫酸葡聚糖以外的多糖类的、具有带有负电荷的官能团的阴离子性多糖类或其盐。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的添加物，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为前述硫酸葡聚糖以外的硫酸化多糖或其盐。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的添加物，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为选自由肝素及其盐以及重均分子量为5,000～50,000的硫酸葡聚糖及其盐组成的组的1种或2种以上。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的添加物，其添加于干细胞培养用培养基。
[7]根据[6]所述的添加物，相对于培养基的总量，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类以浓度为1μg/mL～1mg/mL的方式进行添加。
[8]一种干细胞培养用培养基，含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类。
[9]根据[8]所述的培养基，用于选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上的培养。
[10]根据[8]或[9]所述的培养基，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为作为前述硫酸葡聚糖以外的多糖类的、具有带有负电荷的官能团的阴离子性多糖类或其盐。
[11]根据[8]～[10]中任一项所述的培养基，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为前述硫酸葡聚糖以外的硫酸化多糖或其盐。
[12]根据[8]～[11]中任一项所述的培养基，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为选自由肝素及其盐以及重均分子量为5,000～50,000的硫酸葡聚糖及其盐组成的组的1种或2种以上。
[13]根据[8]～[12]中任一项所述的培养基，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的含量为1μg/mL～1mg/mL。
[14]根据[8]～[13]中任一项所述的培养基，其为无饲养层培养基。
[15]根据[14]所述的培养基，其为无血清培养基。
[16]一种干细胞的培养方法，包括用含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的干细胞培养用培养基对干细胞进行悬浮培养。
[17]根据[16]所述的培养方法，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上。
[18]根据[16]或[17]所述的培养方法，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为作为前述硫酸葡聚糖以外的多糖类的、具有带有负电荷的官能团的阴离子性多糖类或其盐。
[19]根据[16]～[18]中任一项所述的培养方法，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为前述硫酸葡聚糖以外的硫酸化多糖或其盐。
[20]根据[16]～[19]中任一项所述的培养方法，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为选自由肝素及其盐以及重均分子量为5,000～50,000的硫酸葡聚糖及其盐组成的组的1种或2种以上。
[21]根据[16]～[20]中任一项所述的培养方法，干细胞培养用培养基中分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的含量为1μg/mL～1mg/mL。
[22]根据[16]～[21]中任一项所述的培养方法，干细胞培养用培养基为无饲养层培养基。
[23]根据[22]所述的培养方法，干细胞培养用培养基为无血清培养基。
发明效果
根据本发明，能够提供适合干细胞的悬浮培养的培养用添加物和培养基、以及干细胞的培养方法。
因此，根据本发明，能够在干细胞的悬浮培养中提高干细胞的增殖率和存活率，能够提高大小和形状受到控制的细胞团块形成率，能够进一步提高未分化维持率。
附图说明
图1为显示实施例1的人iPS细胞的搅拌培养中，肝素钠和葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)对细胞团块形成和细胞状态产生的效果的图。需说明的是，图中的“硫酸葡聚糖”表示葡聚糖硫酸钠。
图2为显示实施例2的人iPS细胞的搅拌继代培养中，重复继代时肝素钠的效果的图。
图3为显示实施例3的人iPS细胞的搅拌继代培养中，重复继代时葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的效果的图。需说明的是，图中的“硫酸葡聚糖”表示葡聚糖硫酸钠。
图4为显示实施例4的人iPS细胞的搅拌培养中，各种肝素类的效果的图。
图5为显示实施例5的人iPS细胞的搅拌培养中，分子量不同的葡聚糖硫酸钠的效果的图。需说明的是，图中的“硫酸葡聚糖”表示葡聚糖硫酸钠。
图6为显示实施例6的用各种干细胞培养培养基对人iPS细胞的搅拌培养中，肝素钠的效果的图。
图7为显示实施例7的用各种干细胞培养培养基对人iPS细胞的搅拌培养中，葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的效果的图。需说明的是，图中的“硫酸葡聚糖”表示葡聚糖硫酸钠。
图8为显示实施例8的人iPS细胞的搅拌培养中，细胞团块形成率提高效果的肝素钠浓度依赖性的图。
图9为显示实施例9的人iPS细胞的搅拌培养中，细胞团块形成率提高效果的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)浓度依赖性的图。需说明的是，图中的“硫酸葡聚糖”表示葡聚糖硫酸钠。
图10为显示实施例10的人iPS细胞的振荡培养中，肝素钠对细胞团块形成和细胞状态产生的效果的图。
图11为显示实施例11的人iPS细胞的搅拌培养中，细胞团块形成率提高效果的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)浓度依赖性的图。
具体实施方式
本发明提供一种可添加在干细胞培养用培养基中的干细胞培养用添加物(以下在本说明书中也称为“本发明的添加物”)。
这里，“干细胞”是指维持自我复制能力和分化成其他种类细胞的能力、可以无限增殖的细胞。
可列举例如：造血干细胞、卫星细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、嗅粘膜干细胞、神经冠干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞、肠道干细胞、毛囊干细胞等成体干细胞，胚胎干细胞(ES细胞)、胚性肿瘤细胞、胚性生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)等多能性干细胞，癌干细胞等。
本发明的添加物优选用于成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞的培养，更优选用于胚胎干细胞和人工多能干细胞的培养。
本发明的添加物含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类。
本发明中，“分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类”是指，多个(2个以上)单糖分子通过糖苷键结合而成的物质中具有4,000kDa～40,000kDa的分子量的高分子量硫酸葡聚糖以外的物质，以下在本说明书中，有时也表述为“本发明的多糖类”。
作为构成本发明的多糖类的单糖，可例示：赤藓酮糖等四碳酮糖，赤藓糖、苏糖等四碳醛糖，核酮糖、木酮糖等戊酮糖，核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖等戊醛糖，别体酮糖(阿洛酮糖)、果糖、山梨糖、塔格糖等六碳酮糖，阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖等六碳醛糖，景天庚酮糖等七碳酮糖等4碳糖～7碳糖、脱氧核糖、岩藻糖、墨角藻糖、鼠李糖等脱氧糖，阿拉伯糖酸、果糖酸、塔格糖酮酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、古罗糖醛酸、艾杜糖醛酸、古罗糖醛酸等糖醛酸，氨基葡萄糖、N－乙酰氨基葡萄糖、半乳糖胺、N－乙酰半乳糖胺、甘露糖胺、N－乙酰甘露糖胺、N－乙酰胞壁酸、神经氨糖酸、N－乙酰神经氨糖酸等氨基糖及其N－乙酰化物等。
作为本发明的多糖类，使用由从上述单糖选择的1种或2种以上构成的同多糖、杂多糖、粘多糖以及它们的脱乙酰化物、硫酸化物等化学修饰物等。
为了本发明的目的，上述多糖类可以使用从低分子量至高分子量各种分子量的多糖。
本说明书中，“分子量”是通过尺寸排阻色谱法测得的分子量。
为了本发明的目的，作为上述多糖类，优选使用通过尺寸排阻色谱法测得的重均分子量为300～500,000左右的多糖，更优选使用1,000～50,000左右的多糖，进一步优选使用4,000～50,000左右的多糖。
需说明的是，本说明书中，有时将上述重均分子量简单表述为“平均分子量”。
多糖类的尺寸排阻色谱法可以根据多糖类的种类等，利用以一般使用的亲水性聚合物为载体的色谱柱、在使用硝酸钠水溶液等中性盐洗脱液的洗脱条件下等来进行。
此外，本发明中，上述多糖类为后述阴离子性多糖类的情况下，也可以以盐的形态使用。作为该盐，可例示例如：锂盐、钠盐、钾盐等碱金属盐，镁盐、钙盐等碱土金属盐，铵盐，三乙醇胺盐、吡啶鎓盐等有机胺盐等。
为了本发明的目的，优选使用具有带有负电荷的官能团的阴离子性多糖类，例如可例示下述物质作为优选的多糖：透明质酸、聚半乳糖醛酸、果胶、海藻酸等含有分子内具有羧酸的糖醛酸作为构成单元的多糖类，卡拉胶、墨角藻聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸葡聚糖(分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖除外)、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸软骨素(软骨素4－硫酸、软骨素6－硫酸等)等硫酸化多糖。
其中，更优选使用硫酸化多糖，进一步优选使用硫酸化程度高的肝素、硫酸葡聚糖(分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖除外)、硫酸软骨素等。作为硫酸化多糖，优选使用全部羟基的硫酸化程度为10％～90％左右的物质，更优选使用20％～80％左右的物质。
需说明的是，硫酸葡聚糖是使仅由葡萄糖构成的、含有大量α－1,6－键的多糖类硫酸化而得的物质。
本发明中，使用具有4,000kDa～40,000kDa的分子量的高分子量硫酸葡聚糖以外的硫酸葡聚糖，优选使用通过尺寸排阻色谱法测得的重均分子量为1,000～50,000左右的硫酸葡聚糖，更优选使用前述重均分子量为4,000～50,000左右的硫酸葡聚糖。
本发明的添加物中，上述本发明的多糖类可以选择使用1种，也可以选择2种以上组合使用。
本发明的培养用添加物中本发明的多糖类的含量以添加至培养基时培养基组合物中本发明的多糖类的含量在后述含量范围内的方式设定。
需说明的是，从干细胞培养中的细胞团块形成促进效果等观点出发，作为上述本发明的多糖类特别优选的例子，可列举肝素及其盐、以及平均分子量(通过尺寸排阻色谱法测得的重均分子量)为5,000～50,000左右的硫酸葡聚糖及其盐。
因此，本发明特别优选的方式中，作为上述本发明的多糖类，使用选自由肝素及其盐、以及平均分子量为5,000～50,000左右的硫酸葡聚糖及其盐组成的组的1种或2种以上。
本发明中，可以将上述本发明的多糖类直接作为培养用添加物，此外也可以在水等溶剂中溶解或者分散、制成水溶液、分散液等液状培养用添加物，或者也可以与赋形剂、粘合剂等一般的制剂化中使用的成分混合，制成粉末状、颗粒状、锭剂状等固体形状的培养用添加物。
此外，还可以将上述本发明的多糖类与碳水化合物、无机盐等以下提及的培养基成分的一部分混合，制备成培养用添加物。
从便于向干细胞培养用培养基添加且容易与培养基混和的观点出发，本发明的添加物优选以液状、粉末状、颗粒状、锭剂状等形态提供。
本发明的添加物优选灭菌处理后进行制备。灭菌处理的方法没有特别限制，可列举例如121℃下20分钟的高压灭菌、放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、过滤器过滤灭菌等，可以根据本发明的添加物的形态等适当选择。
本发明的添加物添加在后述干细胞培养用培养基的成分中用于干细胞培养用培养基的制备，或者添加在后述干细胞培养用培养基中使用。
将本发明的添加物添加在培养用培养基中对干细胞进行悬浮培养的情况下，能够提高干细胞的增殖率和存活率、有效形成大小和形状受到控制的细胞团块，进一步，干细胞的未分化维持率提高。
这里，“细胞团块”是指细胞彼此集合或凝集化而成的球状细胞集合体，也称为“球体”。“有效形成大小和形状受到控制的细胞团块”是指高密度地形成小球状的均匀的细胞团块。
此外，本发明还提供干细胞培养用培养基(以下在本说明书中也称为“本发明的培养基”)。
本发明的培养基在含有干细胞的培养中通常使用的培养基成分的同时含有本发明的多糖类。
本发明的培养基中可单独含有1种本发明的多糖类，或者也可以组合含有2种以上。
本发明的培养基中含有的本发明的多糖类可以以作为上述本发明的添加物制备的状态与前述培养基成分同时含有，或者也可以直接添加在培养基成分中。
作为培养时的终浓度，本发明的培养基中上述本发明的多糖类的含量通常为1μg/mL～1mg/mL，优选为10μg/mL～1mg/mL，更优选为20μg/mL～250μg/mL。
作为本发明的培养基中可含有的培养基成分，可以列举干细胞的培养中通常使用的培养基成分，可列举例如：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖，天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等氨基酸，白蛋白、转铁蛋白等蛋白质和肽，血清，维生素A、维生素B族(硫胺素、核黄素、吡哆素、氰钴铵素、生物素、叶酸、泛酸、烟酰胺等)、维生素C、维生素E等维生素，油酸、花生四烯酸、亚油酸等脂肪酸、胆固醇等脂质，氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钠等无机盐，锌、铜、硒等微量元素，N,N－双(2－羟乙基)－2－氨基乙磺酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES))、4－(2－羟乙基)－1－哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES))、N－[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine))等缓冲剂，两性霉素B、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素等抗生素，I型胶原、II型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚L-赖氨酸、聚D-赖氨酸等细胞粘附因子和细胞外基质成分，白细胞介素、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)－α、转化生长因子(TGF)－β、血管内皮生长因子(VEGF)、肌动蛋白A等细胞因子和生长因子，地塞米松、氢化可的松、雌二醇、黄体酮、升血糖激素、胰岛素等激素等，可以根据培养的干细胞的种类选择使用适当的成分。
需说明的是，血清中有可能含有未知因子、朊病毒、病毒等，因此，本发明的培养基优选不含血清作为培养基成分。此外，本发明的培养基作为人干细胞培养用培养基制备的情况下，优选不含来自人以外的动物的成分。
此外，本发明中，作为培养基成分，可以使用已有的干细胞培养用培养基，也可以使用市售培养基。
作为该培养基，可列举STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(生命技术(LifeTechnologies)公司)、mTeSR1培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、TeSR2培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、TeSR－E8培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、Essencial 8培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、HEScGRO(商标)Serum－Free Medium for hES cells(密理博(Millipore)公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPS Medium(EMD密理博(EMD Millipore)公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(博艾生物工业科技有限公司(Biological Industries IsraelBeit-Haemek Ltd.)、NutriStem(商标)XF/FF Culture Medium(干细胞基因(Stemgent)公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(博艾生物工业科技有限公司(BiologicalIndustries Israel Beit-Haemek Ltd.)、S－medium(DS制药生物医药有限公司)、StemFit(注册商标)AK03培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF－FX培养基、CDM培养基、DEF－CS 500Xeno－Free 3D Spheroid Culture Medium(赛拉提斯(Cellartis)公司)、StemFlex培养基(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司)等。
对于本发明的目的而言，优选使用无饲养层的干细胞培养用培养基，进一步更优选使用无血清培养基，此外，为了用于人的干细胞培养用培养基，优选不含来自人以外的动物的成分的培养基(无异种蛋白培养基)。
从用于干细胞的悬浮培养的观点出发，本发明的培养基优选制成溶液、分散液等液态形态。
本发明的培养基可以将按照公知的组成从上述培养基成分适当选择的成分与本发明的多糖类一起添加在水等溶剂中溶解或分散而制备。
此外，本发明的培养基还可以在由各公司、各机构提供的上述干细胞培养用培养基中添加本发明的多糖类，溶解或分散而制备。
进一步，本发明的培养基还可以制成下述样式：制备成比使用时的浓度浓缩的状态、冷冻干燥的粉末状状态，使用时，用水等溶剂稀释、或者在水等溶剂中溶解或分散而使用。
本发明的培养基优选实施上述那样的灭菌处理进行制备。
通过使用本发明的培养基对干细胞进行悬浮培养，能够以高增殖率和存活率实现干细胞的三维培养，能够有效地形成大小和形状受到控制的细胞团块。此外还能够提高干细胞的未分化维持率。
进一步，本发明提供一种干细胞的培养方法(以下在本说明书中也称为“本发明的培养方法”)。
本发明的培养方法包括用含有本发明的多糖类的干细胞培养用培养基对干细胞进行悬浮培养。
关于“含有本发明的多糖类的干细胞培养用培养基”，如上所述，本发明中，干细胞培养用培养基中含有的本发明的多糖类可以作为上述本发明的添加物制备添加，也可以直接添加本发明的多糖类本身。
此外，本发明中，作为培养时的终浓度，本发明的多糖类通常以浓度1μg/mL～1mg/mL的方式在培养基中添加，优选以浓度10μg/mL～1mg/mL的方式在培养基中添加，更优选以浓度20μg/mL～250μg/mL的方式在培养基中添加。
本发明的培养方法中，干细胞的培养可以按照通常的悬浮培养方法进行。即，根据培养规模适当使用细胞培养用板、细胞培养瓶、生物反应器等培养器具或培养装置，在上述本发明的培养基或添加有本发明的添加物的干细胞培养用培养基中接种干细胞，通常在25℃～39℃、优选为33℃～39℃，通常为4体积％～10体积％、优选为4体积％～6体积％的二氧化碳存在下，此外通常为1体积％～25体积％、优选为4体积％～20体积％的氧气存在下，通常进行1天～30天、优选为3天～14天培养。需说明的是，每隔2～3天进行培养基更换。
培养基更换可以在通过离心分离、过滤使干细胞与培养基分离后将新的培养基添加在干细胞中。或者，可以在通过进行离心分离、过滤使干细胞适当浓缩后，将新的培养基添加在该浓缩液中。
上述离心分离时的重力加速度(G)通常为50G～1,000G，优选为100G～500G，过滤中使用的过滤器中细孔的大小通常为10μm～200μm。
为了高效获得大小受到控制的细胞团块，干细胞的培养优选进行搅拌或振荡来实施。
搅拌通常以10rpm～2,000rpm、优选以40rpm～1,000rpm的搅拌速度进行。
此外，振荡通常以10rpm～500rpm、优选以50rpm～250rpm的振荡速度进行。
培养的干细胞可以通过离心分离或用过滤器过滤进行回收。
离心分离以50G～1,000G、优选以100G～500G进行1分钟～10分钟左右。
此外，过滤可以使用具有10μm～200μm左右的细孔的过滤器来进行。
培养的干细胞优选使用STEM－CELLBANKER(日本全药工业株式会社)等含有冷冻保护剂的冷冻用培养基在液氮中保存。
利用本发明的培养方法，能够以高增殖率和存活率进行干细胞的三维培养，能够有效获得大小和形状受到控制的细胞团块。此外，能够获得未分化维持率提高的干细胞的培养细胞。
实施例
以下，通过实施例进一步详细地对本发明进行说明。
以下的实施例中，使用下面所示干细胞培养用培养基和作为本发明的多糖类的下述多糖类，使用作为干细胞的未分化的人iPS细胞(hiPSC)，如下所述通过搅拌进行悬浮培养和通过振荡进行悬浮培养。
(1)作为干细胞培养用培养基，使用StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、Essential 8培养基(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司，A1517001)、mTeSR1培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司，85850)、DEF－CS500Xeno－Free 3D Spheroid Culture Medium(赛拉提斯(Cellartis)公司，Y30047)和StemFlex培养基(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司，A3349401)。
(2)作为本发明的多糖类，使用肝素钠(Heparin sodium)(NACALAI TESQUE,INC.，17513-54)、肝素锂(Heparin lithium)(NACALAI TESQUE,INC.，02869-74)、肝素铵(Heparin ammonium)(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich公司)，H6279)、克赛(依诺肝素钠)(赛诺菲有限公司)(平均分子量＝4,500的低分子量肝素钠)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate)(按照国际公开第2017/115675号记载的方法制造)和葡聚糖硫酸钠(Sodiumdextran sulfate)(和光纯药工业株式会社，191-08365)(平均分子量＝5,000)、葡聚糖硫酸钠(MP生物医学(MP BIOMEDICALS)，0216011090)(分子量36,000～50,000)。
(3)作为未分化hiPSC，使用1210B2株和1231A3株(参照Nakagawa,M.等，Sci.Rep.4,3594,2014)的hiPS细胞。
(4)通过搅拌进行的悬浮细胞培养中，作为培养器材，使用30mL容量(ABLE株式会社(ABLE Corporation)，BWV-S03A)和5mL容量(ABLE株式会社(ABLE Corporation)，S-1467)的一次性使用生物反应器来进行。
30mL规模的悬浮培养中，在30mL容量的生物反应器中添加30mL含有10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)(富士胶片和光纯药株式会社，034-24024)的培养基，5mL规模的悬浮培养中，在5mL容量的生物反应器中添加5mL含有10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)的培养基，添加单细胞化的hiPSC，在37℃、5体积％二氧化碳的条件下，以各实施例记载的转速进行搅拌培养。
第2天以后进行培养基更换。培养基更换如下进行：抽取各实施例记载量的培养基上清，500G离心分离5min，将上清除去后，添加等量新的培养基，使沉淀悬浮后，添加在生物反应器中。
通过振荡进行的悬浮培养如下实施：在6孔细胞培养板(格瑞纳生物国际(GreinerBio-One International)公司，657160)上添加5mL含有10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)的培养基，添加1×106细胞的单细胞化的hiPSC，在37℃、5体积％二氧化碳的条件下，以95rpm进行水平振荡。
此外，在下述各实施例中，培养的干细胞中细胞团块数和长径的测定、细胞数和存活率的测定、以及细胞的未分化维持率的测定按以下方式进行。
(1)细胞团块数和长径的测定
在24孔板上分取500μL含有细胞团块的培养基上清。对细胞团块进行振荡使其分散后，用BZ－X荧光显微镜(株式会社基恩士(Keyence))对全部孔进行拍照。对于拍摄的图像进行宏细胞计数(Macro cell count)，从而求出细胞团块的个数和长径的平均。
(2)细胞数和存活率的测定
将含有细胞团块的培养基上清全量回收，500G离心分离5min。将上清除去后，进行10次敲击，添加1mL的细胞分离/分散溶液(Accumax(密理博(Millipore)公司，SCR006)，使细胞团块沉淀悬浮。室温温育5min后，通过吹吸使细胞团块再悬浮。再次室温温育5min后，通过吹吸使细胞团块单细胞化。添加4mL的培养基，500G离心分离5min。将上清除去后，进行10次敲击，从而使沉淀破碎，添加1mL的含有Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)的培养基，通过吹吸使细胞再悬浮。使细胞悬浮液通过40μm的细胞过滤器(BD Falcon(康宁公司)，2-1919-02)，进一步用4mL的含有Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)的培养基对细胞过滤器进行润洗。将回收的细胞悬浮液用全自动化细胞计数与活力分析仪Vi－CELL XR(贝克曼库尔特株式会社)进行分析，从而进行细胞数和存活率的测定。
(3)细胞的未分化维持率的测定
将培养后单细胞化的细胞用细胞固定化/细胞通透化溶液(BD Cytofix/Cytoperm(商标)Kit(碧迪生物科学(BD Biosciences)公司，554714))固定。具体地，添加200μL的Cytofix/Cytoperm，冰上静置20分钟，从而进行hiPSC的固定。
接下来，添加1mL的BD Perm/Wash buffer(商标)(碧迪生物科学(BDBiosciences)公司，554723)，5,000rpm进行2min离心分离，将上清除去。接下来，悬浮在适量BD Perm/Wash buffer(商标)中，分为双重染色用样品、单染色用样品、同型对照用样品、非染色用样品，分别注入离心管，5,000rpm进行2min离心分离，将上清除去。
双重染色和单染色通过下述方法进行：添加100μL将1:5(5倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)488mouse anti－oct3/4(贝顿·狄金森(Becton Dickinson)公司，560253)和1:10(10倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)647mouse anti―SSEA－4(贝顿·狄金森(Becton Dickinson)公司，560796)中的两者或一者添加在BD Perm/Wash buffer(商标)中所得的溶液，室温、遮光下温育20min。
在同型对照用样品中，加入100μL添加有1:20(20倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)488Mouse IgG1κIsotype Control(贝顿·狄金森(Becton Dickinson)公司，557721)或1:20(20倍)稀释的Alexa Fluor(注册商标)647Mouse IgG3、κIsotype Control(贝顿·狄金森(Becton Dickinson)公司，560803)所得的BD Perm/Wash buffer(商标)，同样地在室温、遮光下温育20min。
上述各反应后，添加500μL的BD Perm/Wash buffer(商标)，5,000rpm离心分离2min，将上清除去。在各样品中添加1mL Focusing fluid(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)公司，4488621)，再次5,000rpm进行2min离心分离后，悬浮在200μL的Focusingfluid(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司，4488621)中。制备的样品用Attune NxT Flow Cytometer(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司)实施分析。Alexa Fluor(注册商标)488色素用BL1进行检测，Alexa Fluor(注册商标)647色素用RL1进行检测。
细胞的未分化维持率可以用培养的细胞中的Oct3/4/SSEA4阳性率来表示。
[实施例1]使用分别含有肝素钠和葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基的hiPSC的搅拌培养
在StemFit(注册商标)AK03N培养基中分别添加0.25mg/mL的肝素钠和0.1mg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)，对hiPSC进行搅拌悬浮培养，评价肝素钠和平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠对于hiPSC细胞团块的形成和细胞状态的效果。
将1210B2株hiPSC在30mL的生物反应器中接种2×106细胞，以55rpm的搅拌速度进行搅拌培养。第2天和第3天进行21mL的培养基更换。
第4天通过上述方法测定细胞团块形成数、细胞团块的平均长径、增殖率、细胞存活率、未分化维持率，将结果示于图1。
如图1所示，如果用添加有肝素钠或葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基进行培养，细胞团块形成数均比未添加时(Mock)提高至约2倍，确认到细胞团块长径减小。此外，细胞的增殖率、存活率、未分化维持率全部提高。
根据这些结果，可见通过在培养基中添加肝素钠或平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠进行hiPSC的搅拌培养，能够大量形成小的细胞团块，能够使存活率和未分化维持率高的iPS细胞高效增殖。
[实施例2]使用含有肝素钠的培养基的hiPSC的搅拌继代培养
在StemFit(注册商标)AK03N培养基中添加0.1mg/mL的肝素钠，对hiPSC进行4次继代时间的搅拌培养，评价重复继代时肝素钠的效果。
将1210B2株hiPSC在30mL的生物反应器中接种6×106细胞，以120rpm的搅拌速度进行搅拌培养。第2天～第5天、第9天～第11天、第15天～第17天、第21天进行21mL的培养基更换，第6天、第12天、第18天、第22天进行30mL全量培养基更换。第7天、第13天、第19天、第23天将细胞团块破碎，测定细胞团块形成数、细胞团块的平均长径、细胞增殖率(累积增殖率)、细胞存活率、未分化维持率。此外，第7天、第13天将回收并单细胞化的细胞在新的生物反应器中继代接种6×106细胞、第19天将回收的单细胞化的细胞在新的生物反应器中继代接种3×107细胞。
将各继代时的细胞团块数、细胞增殖率、细胞存活率、未分化维持率示于图2。
由图2可见，如果用添加有肝素钠的培养基进行培养，则与未添加肝素钠的培养基(Mock)相比，在任何继代数下细胞团块形成数、细胞的增殖率、存活率、未分化维持率均全部提高。
根据这些结果，通过在培养基中添加肝素钠进行hiPSC的搅拌培养，能够持续大量形成小的细胞团块，此外能够使存活率和未分化维持率高的iPS细胞高效增殖。
[实施例3]使用含有葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基的hiPSC的搅拌继代培养
在StemFit(注册商标)AK03N培养基中添加0.1mg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)，对hiPSC进行3次继代时间的搅拌培养，评价重复继代时葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的效果。
将1210B2株hiPSC在30mL的生物反应器中接种6×106细胞，以55rpm的搅拌速度进行8天搅拌培养，之后以120rpm的搅拌速度进行6天搅拌培养。第2天～第3天、第6天～第7天、第10天～第12天进行21mL的培养基更换，第13天、第22天进行30mL全量培养基更换。第4天、第8天、第14天将细胞团块破碎，测定细胞团块形成数、细胞团块的平均长径、细胞增殖率、细胞存活率、未分化维持率。此外，第4天、第8天将进行回收并单细胞化的细胞在新的生物反应器中继代接种6×106细胞。
将继代时的细胞团块数、细胞增殖率、细胞存活率、未分化维持率示于图3。
如图3所示，如果用添加有葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基进行培养，则与未添加葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的Mock相比，虽然细胞增殖率没有观察到差别，但在任何继代数中，细胞团块形成数、细胞的存活率、未分化维持率均全部提高。
根据这些结果，可见通过在培养基中添加平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠进行hiPSC的搅拌培养，能够持续大量形成小的细胞团块，此外能够使存活率和未分化维持率高的iPS细胞高效增殖。
[实施例4]使用含有各种肝素类的培养基的hiPSC的搅拌培养
在StemFit(注册商标)AK03N培养基中分别添加0.25mg/mL的肝素钠(Na)、肝素锂(Li)、肝素铵(NH4)、硫酸乙酰肝素和50U/mL的克赛(依诺肝素钠)(低分子量肝素，平均分子量＝4,500)，对hiPSC进行搅拌培养，评价各种肝素类的效果。
将1210B2株hiPSC在5mL的生物反应器中接种1×106细胞，以120rpm的搅拌速度进行搅拌培养。培养第2天以后每天进行3.5mL的培养基更换，使用分别添加有肝素Na和肝素Li的培养基的培养中，在第3天测定细胞团块形成数，使用添加有除此以外的肝素类的培养基的培养中，在第4天测定细胞团块形成数，将结果示于图4。
如图4所示，使用分别添加有各肝素盐、低分子量肝素和硫酸乙酰肝素的培养基进行搅拌培养时，与未添加前述任一物质的Mock相比，细胞团块形成数提高。
根据这些结果，可见反阳离子的种类、分子量或硫酸化程度不同的肝素类均具有使细胞团块大量形成的效果。
[实施例5]使用分子量不同的葡聚糖硫酸钠的hiPSC的搅拌培养
在StemFit(注册商标)AK03N培养基中分别添加0.1mg/mL平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠和分子量为36,000～50,000的葡聚糖硫酸钠，对hiPSC进行搅拌培养，评价分子量不同的葡聚糖硫酸钠的效果。
将1210B2株hiPSC在5mL的生物反应器中接种1×106细胞，以120rpm的搅拌速度进行搅拌培养，第4天测定细胞团块形成数，将结果示于图5。
如图5所示，添加有任一分子量的葡聚糖硫酸钠的情况下，与未添加葡聚糖硫酸钠的Mock相比，细胞团块形成数提高，添加有平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠的情况下，显示出高的细胞团块形成促进效果。
[实施例6]使用含有肝素钠的各种培养基的hiPSC的搅拌培养
分别在StemFlex培养基、DEF－CS 500Xeno－Free 3D Spheroid CultureMedium、Essential 8培养基、mTeSR1培养基中添加0.25mg/mL的肝素钠，对hiPSC进行搅拌培养，评价使用前述各培养基的搅拌培养中肝素钠的效果。
将1210B2株hiPSC在30mL的生物反应器中接种6×106细胞，以55rpm的搅拌速度进行搅拌培养。培养第2天以后每天进行21mL的培养基更换，在使用DEF－CS 500Xeno－Free3D Spheroid Culture Medium培养基的实验中，第6天测定细胞团块形成数、细胞团块的长径和细胞增殖率，在除此以外的实验中，第5天测定细胞团块形成数、细胞团块的长径和细胞增殖率，将结果示于图6。
如图6所示，使用任一培养基的情况下，与未添加肝素钠时相比，在添加有肝素钠时均观察到细胞团块形成数的提高和细胞团块长径的减小。此外，使用mTeSR1培养基和Essential 8培养基的培养中，通过肝素钠的添加，观察到细胞增殖率的显著提高。
根据这些结果，可见不管培养中使用的培养基的种类如何，肝素盐均具有提高细胞团块形成率并控制细胞的大小、促进增殖的效果。
[实施例7]使用含有葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的各种培养基的hiPSC的搅拌培养
分别在Essential 8培养基和mTeSR1培养基中添加0.1mg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)，对hiPSC进行搅拌培养，评价使用前述各培养基的培养中葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的效果。
将1210B2株hiPSC在5mL的生物反应器中接种1×106细胞，以80rpm的搅拌速度进行搅拌培养。培养第2天以后每天进行3.5mL的培养基更换，第4天测定细胞团块形成数和细胞增殖率，将结果示于图7。
如图7所示，在任一培养基中，添加葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)进行培养时确认到细胞团块形成数提高、细胞增殖率大幅提高。
根据这些结果，可见不管使用的培养基的种类如何，平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠促进细胞团块的形成和增殖。
[实施例8]使用含有各种浓度的肝素钠的培养基的hiPSC的搅拌培养
在mTeSR1培养基中添加0.25μg/mL～250μg/mL的肝素钠，对hiPSC进行搅拌培养，评价细胞团块形成率提高效果的肝素钠浓度依赖性。
将1210B2株hiPSC在5mL的生物反应器中接种1×106细胞，以80rpm的搅拌速度进行搅拌培养。培养第2天～第3天进行3.5mL的培养基更换，第4天测定细胞团块形成数。
此外，在StemFit(注册商标)AK03N培养基中添加0.1mg/mL和1mg/mL各浓度的肝素钠，对hiPSC进行搅拌培养。
将1210B2株的人hiPSC在30mL的生物反应器中接种6×106细胞，以120rpm的搅拌速度进行搅拌培养。培养第2天～第4天进行21mL的培养基更换，第5天进行30mL的培养基更换，第6天测定细胞团块形成数。
将上述各个细胞团块数测定结果示于图8。
如图8所示，使用在mTeSR1培养基中添加有2.5μg/mL～250μg/mL的肝素钠的培养基进行培养的情况下，确认到细胞团块形成数提高。此外，在StemFit(注册商标)AK03N培养基中添加0.1mg/mL和1mg/mL各浓度的肝素钠进行搅拌培养的情况下也确认到细胞团块形成率大幅提高。
根据上述结果，可见通过添加约1μg/mL至1mg/mL左右的肝素钠，可获得细胞团块形成率提高效果。
[实施例9]使用含有各种浓度的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基的hiPSC的搅拌培养
在mTeSR1培养基中添加0.1μg/mL～1000μg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)，对hiPSC进行搅拌培养，评价细胞团块形成率提高效果中的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)浓度依赖性。
将1210B2株hiPSC在5mL的生物反应器中接种1×106细胞，以80rpm的搅拌速度进行搅拌培养。培养第2天和第3天进行3.5mL的培养基更换，第4天测定细胞团块形成数，将结果示于图9。
如图9所示，使用添加有10μg/mL～1000μg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基进行搅拌培养的情况下，观察到细胞团块形成数的显著提高。
根据该结果，可见通过按约10μg/mL至1mg/mL左右的浓度添加平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠，可获得细胞团块形成率提高效果。
[实施例10]使用含有肝素钠的培养基的hiPSC的振荡培养
在StemFit(注册商标)AK03N培养基中添加0.1mg/mL的肝素钠，对hiPSC进行振荡培养，评价肝素钠对hiPSC的细胞团块形成和细胞状态产生的效果。
在添加有5mL含有10μM的Rho结合激酶抑制剂(Y－27632)的上述培养基的6孔细胞培养板上，接种1×106细胞的1210B2株hiPSC，以95rpm的振荡速度进行振荡培养。将第1天培养的培养细胞的BZ－X显微镜观察结果示于图10。
如图10所示，未添加肝素钠进行培养的组(Mock)中确认到凝集而成的巨大细胞团块，而添加肝素钠进行培养的组中，细胞团块良好地分散，确认到均匀的细胞团块的形成。
由该结果可见，通过在培养基中添加肝素钠进行hiPSC的振荡培养，能够形成均匀的细胞团块。
[实施例11]使用含有各种浓度的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基的hiPSC的搅拌培养
在StemFit(注册商标)AK03N培养基中添加10μg/mL～1000μg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)，对hiPSC进行搅拌培养，评价细胞团块形成率提高效果的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)浓度依赖性。
将1231A3株和1210B2株各hiPSC分别在5mL的生物反应器中各接种1×106细胞，以80rpm的搅拌速度进行搅拌培养。第2天测定细胞团块形成数，将结果示于图11。
如图11所示，使用1231A3株的情况下，使用添加有10μg/mL～330μg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)的培养基进行搅拌培养时，确认到细胞团块形成数的提高，在10μg/mL～1000μg/mL的浓度下，观察到细胞团块长径的减小。
另一方面，使用1210B2株的情况下，添加有10μg/mL～1000μg/mL的葡聚糖硫酸钠(平均分子量＝5,000)时，观察到细胞团块形成数的提高和细胞团块长径的减小。
根据上述结果，提示下述可能性：通过按约10μg/mL～1mg/mL左右的浓度添加平均分子量为5,000的葡聚糖硫酸钠，不管hiPSC株的种类如何，均可获得细胞团块形成率提高和细胞团块大小的控制效果。
产业可利用性
正如以上详述的那样，根据本发明，能够提供在干细胞的悬浮培养中有用的培养用添加物和培养基。
利用本发明的培养用添加物和培养基，在干细胞的悬浮培养中，能够提高干细胞的增殖率和存活率，能够提高大小和形状受到控制的细胞团块的形成率，进一步能够提高未分化维持率。
进一步，根据本发明，能够提供干细胞的培养方法。
利用本发明的培养方法，能够以高增殖率和存活率进行干细胞的三维培养，能够有效获得大小和形状受到控制的细胞团块。此外，能够获得未分化维持率提高的干细胞培养细胞。
本申请以在日本申请的特愿2018－122532为基础，其内容全部包含在本说明书中。

Claims (23)

1.一种干细胞培养用添加物，其中，含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类。
2.根据权利要求1所述的添加物，其中，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上。
3.根据权利要求1或2所述的添加物，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为作为所述硫酸葡聚糖以外的多糖类的、具有带有负电荷的官能团的阴离子性多糖类或其盐。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的添加物，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为所述硫酸葡聚糖以外的硫酸化多糖或其盐。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的添加物，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为选自由肝素及其盐以及重均分子量为5,000～50,000的硫酸葡聚糖及其盐组成的组的1种或2种以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的添加物，其添加于干细胞培养用培养基。
7.根据权利要求6所述的添加物，其中，相对于培养基的总量，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类以浓度为1μg/mL～1mg/mL的方式进行添加。
8.一种干细胞培养用培养基，其中，含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类。
9.根据权利要求8所述的培养基，其用于选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上的培养。
10.根据权利要求8或9所述的培养基，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为作为所述硫酸葡聚糖以外的多糖类的、具有带有负电荷的官能团的阴离子性多糖类或其盐。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的培养基，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为所述硫酸葡聚糖以外的硫酸化多糖或其盐。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的培养基，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为选自由肝素及其盐以及重均分子量为5,000～50,000的硫酸葡聚糖及其盐组成的组的1种或2种以上。
13.根据权利要求8～12中任一项所述的培养基，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的含量为1μg/mL～1mg/mL。
14.根据权利要求8～13中任一项所述的培养基，其为无饲养层培养基。
15.根据权利要求14所述的培养基，其为无血清培养基。
16.一种干细胞的培养方法，其中，包括用含有分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的干细胞培养用培养基对干细胞进行悬浮培养。
17.根据权利要求16所述的培养方法，其中，干细胞为选自由成体干细胞、胚胎干细胞和人工多能干细胞组成的组的1种或2种以上。
18.根据权利要求16或17所述的培养方法，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为作为所述硫酸葡聚糖以外的多糖类的、具有带有负电荷的官能团的阴离子性多糖类或其盐。
19.根据权利要求16～18中任一项所述的培养方法，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为所述硫酸葡聚糖以外的硫酸化多糖或其盐。
20.根据权利要求16～19中任一项所述的培养方法，其中，分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类为选自由肝素及其盐以及重均分子量为5,000～50,000的硫酸葡聚糖及其盐组成的组的1种或2种以上。
21.根据权利要求16～20中任一项所述的培养方法，其中，干细胞培养用培养基中分子量为4,000kDa～40,000kDa的硫酸葡聚糖以外的多糖类的含量为1μg/mL～1mg/mL。
22.根据权利要求16～21中任一项所述的培养方法，其中，干细胞培养用培养基为无饲养层培养基。
23.根据权利要求22所述的培养方法，其中，干细胞培养用培养基为无血清培养基。
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