KR20210025077A - 줄기세포의 배양용 첨가물 및 배양용 배지, 및 배양 방법 - Google Patents

줄기세포의 배양용 첨가물 및 배양용 배지, 및 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 첨가물, 또는 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 배지로 하여, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 배지에서, 줄기세포의 부유 배양을 행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 줄기세포의 부유 배양에서, 줄기세포의 세포괴 형성률을 향상시키고, 또한 그 형상을 제어하고, 추가로 줄기세포의 증식률 및 미분화 유지율을 향상시킬 수 있다.

Description

줄기세포의 배양용 첨가물 및 배양용 배지, 및 배양 방법
본 발명은, 줄기세포를 배양하기 위한 배지 등에 첨가되는 줄기세포의 배양용 첨가물, 및 줄기세포를 배양하기 위한 배지, 및 줄기세포의 배양 방법에 관한 것이다.
배아 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포를 비롯해, 인간의 줄기세포는, 매트리젤이나, 비트로넥틴, 라미닌 등의 인간형 리컴비넌트의 매트릭스 등을 스케폴드(足場; scaffold) 재료로서 사용한 접착 배양에 의해, 증식 유지되어 왔다.
그러나, 줄기세포를 연구, 생산, 의료 등에 응용하기 위해, 효율적으로 증식시키는 배양 방법이 요구되고 있다. 줄기세포를 대량으로 배양하는 방법으로서는, 상기한 접착 배양이 아닌, 세포괴(細胞塊)의 상태에서 부유 배양하는 수법이 널리 사용되고 있다.
줄기세포를 부유 배양할 때에, 과도한 세포의 응집을 억제하면서, 배양액류에 의한 전단 응력에 의해 세포사가 일어나지 않도록, 개량된 교반자를 갖는 부유 배양 장치나, 배양 용기 자체를 구동시켜 배양액을 유동시키는 배양 장치가 개발되어 있다.
세포괴의 배양에서는, 세포 품질의 담보나 최적인 프로세스 구축을 행하기 위해, 세포괴의 형성률이나 형성을 제어하는 것이 바람직하고, 줄기세포의 경우에는, 배양에 의해서 분화하지 않고, 미분화능이 유지되는 것이 요구된다.
이러한 제어 방법으로서는 배지나 배지 성분, 배양 기재를 사용한 제어를 생각할 수 있고, 대량 배양으로의 스케일 업을 전제로 한 배양 기질이나 배양액의 개발이 행해지고 있다. 예를 들어, 라미닌 단편(LM-E8), 비트로넥틴 단편(VTN-N) 등, 이종(異種) 동물 유래의 성분을 포함하지 않는 (제노프리(xeno-free)) 배양 기질이나, 제노프리, 나아가서는 알부민 비함유 무혈청 배지가 개발되어 있다(비특허문헌 1, 2).
그러나, 특히 대량 부유 배양에 적용 가능하며, 세포의 품질을 저하시키지 않는 제어 방법이 바람직하다.
또한, 최근, 덱스트란황산이 다능성 줄기세포(인간 배아 줄기세포)의 응집을 제어하는 효과를 갖고, 균일하고 작은 세포 응집괴(凝集塊)의 생성을 촉진한 것이 보고되고 있다(비특허문헌 3).
그러나, 비특허문헌 3에는, 4,000kDa 내지 40,000kDa의 고분자량의 덱스트란황산의 상기 효과가 기재되어 있지만, 저분자량의 덱스트란황산이나, 덱스트란황산 이외의 다당류의 효과에 관하여, 아무런 구체적인 언급은 이루어져 있지 않다.
비특허문헌 1: 생물공학 92 (9) 469-472 (2014) 비특허문헌 2: 생물공학 92 (9) 487-490 (2014) 비특허문헌 3: Biotechnology and Bioengineering 2018, 1-6
본 발명은, 상기 상황 하에 이루어졌다.
즉, 본 발명의 목적은, 줄기세포의 부유 배양에서, 줄기세포의 세포괴 형성률을 향상시키고, 또한 그 형상을 제어하고, 추가로 줄기세포의 증식률 및 미분화 유지율을 향상시키기 위해 적합한 배양용 첨가물을 제공하고, 나아가서는 줄기세포를 배양하기 위한 배지, 및 줄기세포의 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 저분자량의 덱스트란황산 등의 황산화다당 등, 고분자량의 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는 첨가물을 줄기세포의 배양용 배지에 첨가하여, 줄기세포의 부유 배양을 행함으로써, 또는, 저분자량의 덱스트란황산 등의 황산화다당 등, 고분자량의 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 배지에서 줄기세포의 부유 배양을 행함으로써, 줄기세포의 증식률 및 생존율을 향상시키고, 또한 세포괴 형성률을 향상시킬 수 있고, 세포괴의 형상도 양호하게 제어할 수 있고, 미분화 유지율을 향상시킬 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는, 줄기세포 배양용 첨가물.
[2] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [1]에 기재된 첨가물.
[3] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 다당류로서, 음전하를 갖는 관능기를 갖는 음이온성의 다당류 또는 그 염인, [1] 또는 [2]에 기재된 첨가물.
[4] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 황산화다당 또는 그 염인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[5] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 헤파린 및 그 염 및 중량 평균 분자량이 5,000 내지 50,000인 덱스트란황산 및 그 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[6] 줄기세포 배양용 배지에 첨가되는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 첨가물.
[7] 배지의 전량에 대하여, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류의 농도가 1μg/mL 내지 1mg/mL가 되도록 첨가되는, [6]에 기재된 첨가물.
[8] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는, 줄기세포 배양용 배지.
[9] 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 배양용인, [8]에 기재된 배지.
[10] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 다당류로서, 음전하를 갖는 관능기를 갖는 음이온성의 다당류 또는 그 염인, [8] 또는 [9]에 기재된 배지.
[11] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 황산화다당 또는 그 염인, [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[12] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 헤파린 및 그 염 및 중량 평균 분자량이 5,000 내지 50,000인 덱스트란황산 및 그 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [8] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[13] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류의 함유량이 1μg/mL 내지 1mg/mL인, [8] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[14] 피더프리 배지인, [8] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 배지.
[15] 무혈청 배지인, [14]에 기재된 배지.
[16] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 배지에서, 줄기세포를 부유 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포의 배양 방법.
[17] 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [16]에 기재된 배양 방법.
[18] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 다당류로서, 음전하를 갖는 관능기를 갖는 음이온성의 다당류 또는 그 염인, [16] 또는 [17]에 기재된 배양 방법.
[19] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 황산화다당 또는 그 염인, [16] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[20] 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 헤파린 및 그 염 및 중량 평균 분자량이 5,000 내지 50,000인 덱스트란황산 및 그 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [16] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[21] 줄기세포의 배양용 배지에서의 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류의 함유량이 1μg/mL 내지 1mg/mL인, [16] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[22] 줄기세포의 배양용 배지가 피더프리 배지인, [16] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 배양 방법.
[23] 줄기세포의 배양용 배지가 무혈청 배지인, [22]에 기재된 배양 방법.
본 발명에 의해, 줄기세포의 부유 배양에 적합한 배양용 첨가물 및 배지, 및 줄기세포의 배양 방법을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의해, 줄기세포의 부유 배양에 있어서, 줄기세포의 증식률 및 생존율을 향상시킬 수 있고, 크기 및 형상이 제어된 세포괴의 형성률을 향상시키고, 추가로 미분화 유지율을 향상시킬 수 있다.
[도 1] 도 1은, 실시예 1의 인간 iPS 세포의 교반 배양에 있어서, 헤파린나트륨 및 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)이 세포괴의 형성 및 세포의 상태에 미치는 효과를 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중 「덱스트란 설페이트(Dextran sulfate)」는 덱스트란황산나트륨을 나타낸다.
[도 2] 도 2는, 실시예 2의 인간 iPS 세포의 교반 계대 배양에서, 계대를 반복했을 때의 헤파린나트륨의 효과를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은, 실시예 3의 인간 iPS 세포의 교반 계대 배양에서, 계대를 반복했을 때의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 효과를 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중 「덱스트란 설페이트(Dextran sulfate)」는 덱스트란황산나트륨을 나타낸다.
[도 4] 도 4는, 실시예 4의 인간 iPS 세포의 교반 배양에서, 각종 헤파린류의 효과를 나타내는 도면이다.
[도 5] 도 5는, 실시예 5의 인간 iPS 세포의 교반 배양에서, 분자량이 다른 덱스트란황산나트륨의 효과를 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중 「덱스트란 설페이트(Dextran sulfate)」는 덱스트란황산나트륨을 나타낸다.
[도 6] 도 6은, 실시예 6의 다양한 줄기세포 배양 배지에서의 인간 iPS 세포의 교반 배양에 있어서, 헤파린나트륨의 효과를 나타내는 도면이다.
[도 7] 도 7은, 실시예 7의 다양한 줄기세포 배양 배지에서의 인간 iPS 세포의 교반 배양에 있어서, 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 효과를 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중 「덱스트란 설페이트(Dextran sulfate)」는 덱스트란황산나트륨을 나타낸다.
[도 8] 도 8은, 실시예 8의 인간 iPS 세포의 교반 배양에 있어서, 세포괴 형성률 향상 효과에서의 헤파린나트륨의 농도 의존성을 나타내는 도면이다.
[도 9] 도 9는, 실시예 9의 인간 iPS 세포의 교반 배양에 있어서, 세포괴 형성률 향상 효과에서의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 농도 의존성을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중 「덱스트란 설페이트(Dextran sulfate)」는 덱스트란황산나트륨을 나타낸다.
[도 10] 도 10은, 실시예 10의 인간 iPS 세포의 진탕 배양에 있어서, 헤파린나트륨이 세포괴의 형성 및 세포의 상태에 미치는 효과를 나타내는 도면이다.
[도 11] 도 11은, 실시예 11의 인간 iPS 세포의 교반 배양에 있어서, 세포괴 형성률 향상 효과에서의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 농도 의존성을 나타내는 도면이다.
본 발명은, 줄기세포의 배양용 배지에 첨가할 수 있는, 줄기세포 배양용 첨가물(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 첨가물」이라고도 함)을 제공한다.
여기에서, 「줄기세포」란, 자기 복제능과, 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 가져, 제한없이 증식할 수 있는 세포를 말한다.
예를 들어, 조혈 줄기세포, 위성 세포, 신경 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 유선 줄기세포, 후점막 줄기세포, 신경관(神經冠) 줄기세포, 간 줄기세포, 췌(膵) 줄기세포, 근 줄기세포, 생식 줄기세포, 장관(腸管) 줄기세포, 모포 줄기세포 등의 성체 줄기세포; 배아 줄기세포(ES 세포), 배아 종양 세포, 배아 생식 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 등의 다능성 줄기세포; 암 줄기세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 첨가물은, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양에 바람직하게 사용되고, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 배양에 보다 바람직하게 사용된다.
본 발명의 첨가물은, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유한다.
본 발명에서, 「분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류」란, 글리코시드 결합에 의해 단당 분자가 복수(2개 이상) 결합한 물질로서, 4,000kDa 내지 40,000kDa의 분자량을 갖는 고분자량의 덱스트란황산 이외의 것을 말하며, 이하, 본 명세서에서, 「본 발명에서의 다당류」와 같이 표기할 수도 있다.
본 발명에서의 다당류를 구성하는 단당으로서는, 에리트룰로오스 등의 케토테트로오스; 에리트로오스, 트레오스 등의 알도테트로오스; 리불로오스, 크실룰로오스 등의 케토펜토오스; 리보오스, 아라비노오스, 크실로오스, 릭소오스 등의 알도펜토오스; 프시코오스(알룰로오스), 프룩토오스, 소르보오스, 타가토오스 등의 케토헥소오스; 알로오스, 알트로오스, 글루코스, 만노오스, 굴로오스, 이도오스, 갈락토오스, 탈로스 등의 알도헥소오스; 세도헵툴로오스 등의 케토헵토오스와 같은 4탄당 내지 7탄당, 디옥시리보오스, 푸코오스, 푸쿨로오스, 람노오스 등의 디옥시당; 아라비논산, 프룩투론산, 타가투론산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 만누론산, 이두론산, 글루론산 등의 우론산; 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 만노사민, N-아세틸만노사민, N-아세틸무라민산, 노이라민산, N-아세틸노이라민산 등의 아미노당 및 그 N-아세틸화물 등이 예시된다.
본 발명에서의 다당류로서, 상기한 단당으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상에 의해 구성되는 호모다당, 헤테로다당, 무코다당 및, 그들의 탈아세틸화물, 황산화물 등의 화학적 수식체 등이 사용된다.
본 발명의 목적에는, 상기 다당류는, 저분자량에서 고분자량까지 다양한 분자량의 것을 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 「분자량」이란, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 분자량이다.
본 발명의 목적에는, 상기 다당류로서, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 중량 평균 분자량이 300 내지 500,000 정도의 것을 사용하는 것이 바람직하고, 1,000 내지 50,000 정도의 것을 사용하는 것이 보다 바람직하고, 4,000 내지 50,000 정도의 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 명세서에서, 상기 중량 평균 분자량을 단순히 「평균 분자량」으로 표기하는 경우가 있다.
다당류의 크기 배제 크로마토그래피는, 다당류의 종류 등에 따라, 일반적으로 사용되는 친수성 폴리머를 담체로 하는 컬럼, 질산나트륨 수용액과 같은 중성염 용리액을 사용한 용리 조건 등에 의해 행할 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 상기 다당류가 후술하는 음이온성의 다당류인 경우, 염의 형태로 사용할 수도 있다. 이러한 염으로서는, 예를 들어, 리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염; 암모늄염; 트리에탄올아민염, 피리디늄염 등의 유기 아민염 등이 예시된다.
본 발명의 목적에는, 음전하를 갖는 관능기를 갖는 음이온성의 다당류가 바람직하게 사용되며, 예를 들어, 히알루론산, 폴리갈락투론산, 펙틴, 알긴산 등, 분자 내에 카복실산을 갖는 우론산을 구성 단위로서 함유하는 다당류; 카라기난, 후코이단, 헤파린, 헤파란황산, 덱스트란황산(분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 것을 제외함), 데르마탄황산, 케라탄황산, 콘드로이틴황산(콘드로이틴4-황산, 콘드로이틴6-황산 등) 등의 황산화다당이 바람직한 다당으로서 예시된다.
그 중에서도, 황산화다당이 보다 바람직하게 사용되고, 황산화도가 높은 헤파린, 덱스트란황산(분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 것을 제외함), 콘드로이틴황산 등이 더욱 바람직하게 사용된다. 황산화다당으로서는, 전(全) 수산기의 황산화도가 10% 내지 90% 정도의 것이 바람직하게 사용되고, 20% 내지 80% 정도의 것이 보다 바람직하게 사용된다.
또한, 덱스트란황산은, 글루코오스만으로 구성되고, α-1,6-결합을 많이 포함하는 다당류가 황산화된 것이다.
본 발명에서는, 4,000kDa 내지 40,000kDa의 분자량을 갖는 고분자량의 것 이외의 덱스트란황산이 사용되며, 바람직하게는, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 중량 평균 분자량이 1,000 내지 50,000 정도의 것이 사용되고, 보다 바람직하게는 상기 중량 평균 분자량이 4,000 내지 50,000 정도의 것이 사용된다.
본 발명의 첨가물에는, 상기 본 발명에서의 다당류는 1종을 선택하여 사용해도 좋고, 2종 이상을 선택하고, 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 배양용 첨가물에 있어서의 본 발명에서의 다당류의 함유량은, 배지에 첨가했을 때의 배지 조성물 중에 있어서의 본 발명에서의 다당류의 함유량이, 후술하는 함유량의 범위 내가 되도록 설정된다.
또한, 줄기세포의 배양에서의 세포괴 형성 촉진 효과 등의 관점에서는, 상기 본 발명에서의 다당류의 특히 바람직한 예로서, 헤파린 및 그 염, 및, 평균 분자량(크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 중량 평균 분자량)이 5,000 내지 50,000 정도의 덱스트란황산 및 그 염을 들 수 있다.
따라서, 본 발명의 특히 바람직한 형태에서는, 상기 본 발명에서의 다당류로서, 헤파린 및 그 염, 및, 평균 분자량이 5,000 내지 50,000 정도의 덱스트란황산 및 그 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 사용된다.
본 발명에서는, 상기한 본 발명에서의 다당류를 그대로 배양용 첨가물로 해도 좋고, 또한, 물 등의 용매에 용해 혹은 분산하여, 수용액, 분산액 등의 액상의 배양용 첨가물로 해도 좋고, 혹은 부형제, 결합제 등의 일반적으로 제제화에 사용되는 성분과 혼합하여, 분말상, 과립상, 정제상 등의 고형상의 배양용 첨가물로 해도 좋다.
또한, 상기한 본 발명에서의 다당류를, 탄수화물, 무기염 등의 이하에 서술하는 배지 성분의 일부와 혼합하여, 배양용 첨가물로서 조제해도 좋다.
줄기세포의 배양용 배지로의 첨가가 간편하고, 배지와의 혼화도 용이하다는 관점에서, 본 발명의 첨가물은, 바람직하게는 액상, 분말상, 과립상, 정제상 등의 형태로 제공된다.
본 발명의 첨가물은, 멸균 처리하여 조제하는 것이 바람직하다. 멸균 처리 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 121℃에서 20분간의 오토클레이브 멸균, 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스 멸균, 필터 여과 멸균 등을 들 수 있으며, 본 발명의 첨가물의 형태 등에 따라, 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 첨가물은, 후술하는 줄기세포의 배양용 배지의 성분에 첨가되어, 줄기세포의 배양용 배지의 조제에 사용되거나, 또는 후술하는 줄기세포의 배양용 배지에 첨가되어 사용된다.
본 발명의 첨가물을 배양용 배지에 첨가하여 줄기세포를 부유 배양한 경우, 줄기세포의 증식률 및 생존율이 향상되고, 크기 및 형상이 제어된 세포괴를 효율적으로 형성시킬 수 있고, 추가로 줄기세포의 미분화 유지율이 향상된다.
여기서, 「세포괴」란, 세포끼리가 집합하거나 또는 응집화한 구상(球狀)의 세포 집합체를 말하며, 「스페로이드」라고도 한다. 「크기 및 형상이 제어된 세포괴를 효율적으로 형성시킨다」란, 작은 구상의 균일한 세포괴가 고밀도로 형성되는 것을 말한다.
본 발명은 또한, 줄기세포의 배양용 배지(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 배지」라고도 함)를 제공한다.
본 발명의 배지는, 줄기세포의 배양에 통상 사용되는 배지 성분과 함께, 본 발명에서의 다당류를 함유한다.
본 발명의 배지에는, 본 발명에서의 다당류는 1종을 단독으로, 또는 2종 이상을 조합하여 함유시킬 수 있다.
본 발명의 배지에 함유되는 본 발명에서의 다당류는, 상기한 본 발명의 첨가물로서 조제된 상태에서, 상기 배지 성분과 함께 함유되어도 좋고, 또는 배지 성분에 직접 첨가되어도 좋다.
본 발명의 배지에 있어서의 상기한 본 발명에서의 다당류의 함유량은, 배양시에서의 종농도로서, 통상 1μg/mL 내지 1mg/mL이며, 바람직하게는 10μg/mL 내지 1mg/mL이며, 보다 바람직하게는 20μg/mL 내지 250μg/mL이다.
본 발명의 배지에 함유시킬 수 있는 배지 성분으로서는, 줄기세포의 배양에 통상 사용되는 배지 성분을 들 수 있으며, 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 스쿠로오스, 말토오스 등의 당; 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민, 글루타민산 등의 아미노산; 알부민, 트랜스페린 등의 단백질 및 펩타이드; 혈청; 비타민 A, 비타민 B군(티아민, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발라민, 비오틴, 엽산, 판토텐산, 니코틴아미드 등), 비타민 C, 비타민 E 등의 비타민; 올레산, 아라키돈산, 리놀산 등의 지방산, 콜레스테롤 등의 지질; 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘, 인산2수소나트륨 등의 무기염; 아연, 구리, 셀렌 등의 미량 원소; N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES)), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신(N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine(Tricine)) 등의 완충제; 암포테리신 B, 카나마이신, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항생물질; Type I 콜라겐, Type II 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신 등의 세포 접착 인자 및 세포 외 매트릭스 성분; 인터류킨, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 간세포 증식 인자(HGF), 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-α, 트랜스포밍 증식 인자(TGF)-β, 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 액티빈 A 등의 사이토카인 및 증식 인자; 덱사메타손, 하이드로코르티손, 에스트라디올, 프로게스테론, 글루카곤, 인슐린 등의 호르몬 등을 들 수 있고, 배양하는 줄기세포의 종류에 따라 적절한 성분을 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 혈청에는 미지의 인자나 프리온, 바이러스 등이 포함될 가능성이 있기 때문에, 본 발명의 배지는, 배지 성분으로서 혈청을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 배지가, 인간의 줄기세포의 배양용 배지로서 조제되는 경우에는, 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는, 배지 성분으로서, 기존의 줄기세포 배양용 배지를 사용할 수 있으며, 시판의 배지를 사용할 수도 있다.
이러한 배지로서는, STEMPRO(등록 상표) hESC SFM 배지(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)사), mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), TeSR2 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), TeSR-E8 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사), Essencial 8 배지(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)사), HEScGRO(상표) Serum-Free Medium for hES cells(밀리포어(Millipore)사), PluriSTEM(상표) Human ES/iPS Medium(이엠디 밀리포어(EMD Millipore)사), NutriStem(등록 상표) hESC XF 배지(바이올로지컬 인더스트리즈 이스라엘 베이트-헤메크 리미티드(Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.), NutriStem(상표) XF/FF Culture Medium(스템젠트(Stemgent)사), AF NutriStem(등록 상표) hESC XF 배지(바이올로지컬 인터스트리즈 이스라엘 베이트-헤메크 리미티드(Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.), S-medium(DS 파머 바이오 메디컬 가부시키가이샤), StemFit(등록 상표) AK03 배지(아지노모토 가부시키가이샤), hESF9 배지, hESF-FX 배지, CDM 배지, DEF-CS 500 제노프리 3D 스페로이드 배양 배지(셀라티스(Cellartis)사), StemFlex 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사) 등을 들 수 있다.
본 발명의 목적에는, 피더프리의 줄기세포 배양용 배지를 사용하는 것이 바람직하고, 또한 무혈청 배지를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 또한, 인간의 줄기세포의 배양용 배지에 사용하기 위해서는, 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는 것(제노프리 배지)이 바람직하다.
줄기세포의 부유 배양에 사용한다는 관점에서는, 본 발명의 배지는, 용액, 분산액 등의 액상의 형태로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지는, 공지의 조성에 따라, 상기한 배지 성분으로부터 적절히 선택되는 성분을, 본 발명에서의 다당류와 함께 물 등의 용매에 첨가하여, 용해 또는 분산하여 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는, 각 사·각 기관으로부터 제공되고 있는 상기한 줄기세포 배양용 배지에, 본 발명에서의 다당류를 첨가하여 용해 또는 분산하여 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 배지는, 사용시의 농도보다도 농축된 상태, 동결 건조된 분말상의 상태로 조제하여, 사용시에 물 등의 용매로 희석하거나, 또는 물 등의 용매에 용해 또는 분산하여 사용하는 형태로 할 수도 있다.
본 발명의 배지는, 상기한 바와 같은 멸균 처리를 실시하여 조제되는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지를 사용하여 줄기세포를 부유 배양함으로써, 고증식률 및 생존율로 줄기세포의 3차원 배양이 가능해져, 크기 및 형상이 제어된 세포괴를 효율적으로 형성시킬 수 있다. 또한, 줄기세포의 미분화 유지율을 향상시킬 수 있다.
추가로, 본 발명은, 줄기세포의 배양 방법(이하, 본 명세서에서 「본 발명의 배양 방법」이라고도 칭함)을 제공한다.
본 발명의 배양 방법은, 본 발명에서의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 배지에서, 줄기세포를 부유 배양하는 것을 포함한다.
「본 발명에서의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 배지」에 대해서는 상기한 바와 같고, 본 발명에서, 줄기세포의 배양용 배지에 함유되는 본 발명에서의 다당류는, 상기한 본 발명의 첨가물로서 조제되어 첨가된 것이라도 좋고, 본 발명에서의 다당류 자체가 직접 첨가된 것이라도 좋다.
또한, 본 발명에 있어서는, 본 발명에서의 다당류는, 배양시에서의 종농도로서, 통상 1μg/mL 내지 1mg/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가되고, 10μg/mL 내지 1mg/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가되는 것이 바람직하고, 20μg/mL 내지 250μg/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가되는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 배양 방법에서, 줄기세포의 배양은, 통상의 부유 배양 방법에 따라 행할 수 있다. 즉, 배양 스케일에 따라 적절히 세포 배양용 플레이트, 세포 배양 플라스크, 바이오리액터 등의 배양 기구 또는 배양 장치를 사용하여, 상기한 본 발명의 배지 또는 본 발명의 첨가물을 첨가한 줄기세포 배양용 배지에 줄기세포를 파종하여, 통상 25℃ 내지 39℃, 바람직하게는 33℃ 내지 39℃에서, 통상 4체적% 내지 10체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 6체적%의 이산화탄소 존재 하, 또는 통상 1체적% 내지 25체적%, 바람직하게는 4체적% 내지 20체적%의 산소 존재 하에서, 통상 1일간 내지 30일간, 바람직하게는 3일간 내지 14일간 배양을 행한다. 또한, 2 내지 3일간마다 배지 교환을 행한다.
배지 교환은, 원심 분리나 여과에 의해 줄기세포와 배지를 분리한 후, 새로운 배지를 줄기세포에 첨가하면 된다. 혹은, 원심 분리나 여과를 행함으로써 줄기세포를 적절히 농축한 후, 새로운 배지를 이 농축액에 첨가하면 된다.
상기 원심 분리시의 중력 가속도(G)는, 통상 50G 내지 1,000G, 바람직하게는, 100G 내지 500G이며, 여과에 사용하는 필터의 세공(細孔)의 크기는, 통상 10μm 내지 200μm이다.
크기가 제어된 세포괴를 효율적으로 얻기 위해서는, 줄기세포의 배양은, 교반 또는 진탕을 행하여 실시하는 것이 바람직하다.
교반은, 통상 10rpm 내지 2,000rpm, 바람직하게는 40rpm 내지 1,000rpm의 교반 속도로 행한다.
또한, 진탕은, 통상 10rpm 내지 500rpm, 바람직하게는 50rpm 내지 250rpm의 진탕 속도로 행한다.
배양된 줄기세포는, 원심 분리 또는 필터를 사용한 여과에 의해 회수할 수 있다.
원심 분리는, 50G 내지 1,000G, 바람직하게는 100G 내지 500G로 1분간 내지 10분간 정도 행한다.
또한, 여과는, 10μm 내지 200μm 정도의 세공을 갖는 필터를 사용하여 행할 수 있다.
배양된 줄기세포는, STEM-CELLBANKER(니혼 젠야쿠 코교 가부시키가이샤) 등의 동결 보호제를 함유하는 동결용 배지를 사용하여, 액체 질소 중에서 보존하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 방법에 의해, 고증식률 및 생존율로 줄기세포의 3차원 배양을 행할 수 있고, 크기 및 형상이 제어된 세포괴를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한, 미분화 유지율이 향상된 줄기세포의 배양 세포를 얻을 수 있다.
실시예
이하, 본 발명에 대하여, 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.
이하의 실시예에서, 다음에 나타내는 줄기세포 배양용 배지와, 본 발명에서의 다당류로서 하기의 다당류를 사용하여, 줄기세포로서 미분화의 인간 iPS 세포(hiPSC)를 사용하여, 다음과 같이 교반에 의한 부유 배양 및 진탕에 의한 부유 배양을 행했다.
(1) 줄기세포 배양용 배지로서는, StemFit(등록 상표) AK03N 배지(아지노모토 가부시키가이샤), Essential 8 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, A1517001), mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)사, 85850), DEF-CS 500 제노프리 3D 스페로이드 배양 배지(셀라티스(Cellartis)사, Y30047), 및 StemFlex 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, A3349401)를 사용했다.
(2) 본 발명에서의 다당류로서는, 헤파린나트륨(Heparin sodium)(나카라이 테스크 가부시키가이샤, 17513-54), 헤파린리튬(Heparin lithium)(나카라이테스크 가부시키가이샤, 02869-74), 헤파린암모늄(Heparin ammonium)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich사), H6279), 크렉산(에녹사파린나트륨)(사노피 가부시키가이샤)(평균 분자량=4,500의 저분자량 헤파린나트륨), 헤파란황산(heparan sulfate)(국제공개 제2017/115675호에 기재된 방법에 따라 제조함), 및 덱스트란황산나트륨(Sodium dextran sulfate)(와코 쥰야쿠 코교 가부시키가이샤, 191-08365)(평균 분자량=5,000), 덱스트란황산나트륨(MP 바이오메디컬즈(MP BIOMEDICALS), 0216011090)(분자량 36,000 내지 50,000)을 사용했다.
(3) 미분화 hiPSC로서는, 1210B2주 및 1231A3주(Nakagawa, M. et al., Sci. Rep. 4, 3594, 2014 참조)의 hiPS 세포를 사용했다.
(4) 교반에 의한 부유 세포 배양은, 배양 기재로서, 싱글 유스 바이오리액터 30mL 용량(에이블 가부시키가이샤(ABLE Corporation), BWV-S03A)과 5mL 용량(에이블 가부시키가이샤(ABLE Corporation), S-1467)을 사용하여 행했다.
30mL 스케일의 부유 배양에는, 30mL 용량의 바이오리액터에, 10μM의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)(후지필름 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤, 034-24024)를 함유하는 배지 30mL를 첨가하고, 5mL 스케일의 부유 배양에는, 5mL 용량의 바이오리액터에 10μM의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)를 함유하는 배지 5mL를 첨가하여, 싱글 셀화(single cell化)한 hiPSC를 첨가하여, 37℃, 5체적% 이산화탄소의 조건 하에서, 각 실시예에 기재된 회전수로 교반 배양을 행했다.
2일째 이후에는 배지 교환을 행했다. 배지 교환은, 각 실시예에 기재된 양의 배지 상청을 발취하여, 500G, 5min 원심 분리하여, 상청을 제거 후, 동량(同量)의 새로운 배지를 첨가하여, 펠렛을 현탁 후 바이오리액터에 첨가하여 행했다.
진탕에 의한 부유 배양은, 6웰의 세포 배양용 플레이트(그레이너 바이오-원 인터내셔널(Greiner Bio-One International)사, 657160)에 10μM의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)를 함유하는 배지 5mL를 첨가하여, 싱글 셀화한 hiPSC를 1x106세포 첨가하여, 37℃, 5체적% 이산화탄소의 조건 하에서 95rpm으로 수평 진탕을 행하여 실시했다.
또한, 하기의 각 실시예에서, 배양된 줄기세포에서의 세포괴 수와 장경(長徑)의 측정, 세포 수 및 생존율의 측정, 및 세포의 미분화 유지율의 측정은, 이하와 같이 행했다.
(1) 세포괴 수와 장경의 측정
세포괴를 포함하는 배지 상청을 24웰 플레이트에 500μL 분취(分取)했다. 세포괴를 진탕하여 분산시킨 후, BZ-X 형광 현미경(가부시키가이샤 키엔스(Keyence))으로 웰 전체를 촬영했다. 촬영한 화상에 대하여 매크로 셀 카운트를 행함으로써, 세포괴의 개수와 장경의 평균을 구했다.
(2) 세포 수 및 생존율의 측정
세포괴를 포함하는 배지 상청을 전량 회수하여, 500G, 5min 원심 분리했다. 상청을 제거 후, 10회 탭핑을 행하여, 1mL의 세포 분리/분산 용액(Accumax(밀리포어(Millipore)사, SCR006)을 첨가하여, 세포괴 펠렛을 현탁했다. 실온에서 5min 인큐베이션한 후, 피펫팅에 의해 세포괴를 재현탁했다. 다시 실온에서 5min 인큐베이션한 후, 피펫팅에 의해 세포괴를 싱글 셀화했다. 4mL의 배지를 첨가하여, 500G, 5min 원심 분리했다. 상청을 제거 후, 10회 탭핑을 행함으로써 펠렛을 파쇄하여, 1mL의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)를 함유하는 배지를 첨가하여 피펫팅함으로써 세포를 재현탁했다. 세포 현탁액을 40μm의 셀 스트레이너(BD Falcon(코닝사), 2-1919-02)에 통과시키고, 추가로 4mL의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)를 함유하는 배지로 셀 스트레이너를 프리워시(prewash)했다. 회수한 세포 현탁액을 생사 세포 오토 애널라이저 Vi-CELL XR(벡크만쿨터 가부시키가이샤)로 분석함으로써, 세포 수와 생존율의 측정을 행했다.
(3) 세포의 미분화 유지율의 측정
배양 후 싱글 셀화된 세포를, 세포 고정화/세포 투과화 용액(BD Cytofix/Cytoperm(상표) Kit(비 디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 554714))에 의해 고정화했다. 구체적으로는, 200μL의 Cytofix/Cytoperm을 첨가하여, 얼음 위에서 20분 정치함으로써 hiPSC의 고정을 행했다.
이어서, 1mL의 BD Perm/Wash buffer(상표)(비 디 바이오사이언스(BD Biosciences)사, 554723)를 첨가하여, 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행하여, 상청을 제거했다. 다음으로, 적당량의 BD Perm/Wash buffer(상표)에 현탁하고, 이중 염색용 샘플, 단염색용 샘플, 이소타입 대조(isotype control)용 샘플, 비염색용 샘플로 나누어 각각 원침관에 분주(分注)하고, 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행하여, 상청을 제거했다.
이중 염색 및 단염색은, 1:5(5배) 희석한 Alexa Fluor(등록 상표) 488 mouse anti-oct3/4(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사, 560253) 및 1:10(10배) 희석한 Alexa Fluor(등록 상표) 647 mouse anti-SSEA-4(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사, 560796) 모두, 혹은 한쪽을 BD Perm/Wash buffer(상표)에 첨가한 용액을 100μL 첨가하여, 실온, 차광 하에서 20min 인큐베이션함으로써 행했다.
이소타입 대조(Isotype control)용 샘플에는 1:20(20배) 희석한 Alexa Fluor(등록 상표) 488 Mouse IgG1 κ Isotype Control(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사, 557721) 또는 1:20(20배) 희석한 Alexa Fluor(등록 상표) 647 Mouse IgG3, κ Isotype Control(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사, 560803)을 첨가한 BD Perm/Wash buffer(상표)를 100μL 첨가하여, 마찬가지로 실온, 차광 하에서 20min 인큐베이션했다.
상기의 각 반응 후, 500μL의 BD Perm/Wash buffer(상표)를 첨가하여 5,000rpm, 2min 원심 분리하여, 상청을 제거했다. 각 샘플에 Focusing fluid(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, 4488621)를 1mL 첨가하여, 다시 5,000rpm, 2min 원심 분리를 행한 후에 200μL의 Focusing fluid(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사, 4488621)에 현탁했다. 조제한 샘플은 Attune NxT Flow Cytometer(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)사)로 해석을 실시했다. Alexa Fluor(등록 상표) 488 색소는 BL1, Alexa Fluor(등록 상표) 647 색소는 RL1로 검출을 행했다.
세포의 미분화 유지율은, 배양된 세포에서의 Oct3/4/SSEA4 양성률에 의해 나타낼 수 있다.
[실시예 1] 헤파린나트륨 및 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 각각 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 교반 배양
StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 0.25mg/mL의 헤파린나트륨 및 0.1mg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 각각 첨가하고, hiPSC를 교반 부유 배양하여, 헤파린나트륨 및 평균 분자량이 5,000인 덱스트란황산나트륨이 hiPSC의 세포괴의 형성 및 세포의 상태에 미치는 효과를 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 30mL의 바이오리액터에 2x106세포 파종하여, 55rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 2일째 및 3일째에 21mL의 배지 교환을 행했다.
4일째에 세포괴의 형성 수, 세포괴의 평균 장경, 증식률, 세포 생존율, 미분화 유지율을 상기한 방법으로 측정하여, 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1에 나타내어지는 바와 같이, 헤파린나트륨 또는 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가한 배지에서 배양을 행하면, 어느 것도 첨가하지 않은 경우(Mock)에 비해 세포괴의 형성 수가 약 2배로 향상되고, 세포괴의 장경은 감소하는 것이 확인되었다. 또한, 세포의 증식률, 생존율, 미분화 유지율은 모두 향상되었다.
이러한 결과로부터, 헤파린나트륨 또는 평균 분자량이 5,000인 덱스트란황산나트륨을 배지에 첨가하여 hiPSC의 교반 배양을 행함으로써, 작은 세포괴를 다량으로 형성시키는 것이 가능하며, 생존율 및 미분화 유지율이 높은 iPS 세포를 효율적으로 증식시키는 것이 가능한 것이 밝혀졌다.
[실시예 2] 헤파린나트륨을 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 교반 계대 배양
StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 0.1mg/mL의 헤파린나트륨을 첨가하고, hiPSC 4계대 동안 교반 배양하여, 계대를 반복했을 때의 헤파린나트륨의 효과를 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 30mL의 바이오리액터에 6x106세포 파종하여, 120rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 2일째 내지 5일째, 9일째 내지 11일째, 15일째 내지 17일째, 21일째에는 21mL의 배지 교환을 행하고, 6일째, 12일째, 18일째, 22일째에 30mL 전량의 배지 교환을 행했다. 7일째, 13일째, 19일째, 23일째에 세포괴를 파쇄하여, 세포괴의 형성 수, 세포괴의 평균 장경, 세포 증식률(누적 증식률), 세포 생존율, 미분화 유지율을 측정했다. 또한, 7일째, 13일째에는, 회수하여 싱글 셀화한 세포를 6x106세포, 19일째에는 3x107세포를 새로운 바이오리액터에 계대 파종했다.
각 계대시에서의 세포괴 수, 세포 증식률, 세포 생존율, 미분화 유지율을 도 2에 나타냈다.
도 2로부터 분명한 바와 같이, 헤파린나트륨을 첨가한 배지에서 배양을 행하면, 헤파린나트륨을 첨가하지 않은 배지(Mock)에 비해, 어느 계대에서도 세포괴의 형성 수, 세포의 증식률, 생존율, 미분화 유지율이 모두 향상되었다.
이러한 결과로부터, 헤파린나트륨을 배지에 첨가하여 hiPSC의 교반 배양을 행함으로써, 계속적으로 작은 세포괴를 다량으로 형성시키고, 또한 생존율 및 미분화 유지율이 높은 iPS 세포를 효율적으로 증식시키는 것이 가능한 것이 밝혀졌다.
[실시예 3] 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 교반 계대 배양
StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 0.1mg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가하고, hiPSC를 3계대 동안 교반 배양하여, 계대를 반복했을 때의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 효과를 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 30mL의 바이오리액터에 6x106세포 파종하여, 8일간은 55rpm으로, 그 후 6일간은 120rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 2일째 내지 3일째, 6일째 내지 7일째, 10일째 내지 12일째에는 21mL의 배지 교환을 행하고, 13일째, 22일째에 30mL 전량의 배지 교환을 행했다. 4일째, 8일째, 14일째에 세포괴를 파쇄하고, 세포괴의 형성 수, 세포괴의 평균 장경, 세포 증식률, 세포 생존율, 미분화 유지율을 측정했다. 또한, 4일째, 8일째에는, 회수하여 싱글 셀화한 세포 6x106세포를 새로운 바이오리액터에 계대 파종했다.
계대시에서의 세포괴 수, 세포 증식률, 세포 생존율, 미분화 유지율을 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타내어지는 바와 같이, 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가한 배지에서 배양을 행하면, 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가하지 않은 Mock에 비해, 세포 증식률에는 차가 보이지 않았지만, 어느 계대에서도 세포괴의 형성 수, 세포의 생존율, 미분화 유지율이 모두 향상되었다.
이러한 결과로부터, 평균 분자량이 5,000인 덱스트란황산나트륨을 배지에 첨가하여 hiPSC의 교반 배양을 행함으로써, 지속적으로 작은 세포괴를 다량으로 형성시키고, 또한 생존율 및 미분화 유지율이 높은 iPS 세포를 효율적으로 증식시키는 것이 가능한 것이 밝혀졌다.
[실시예 4] 각종 헤파린류를 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 교반 배양
StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 0.25mg/mL의 헤파린나트륨(Na), 헤파린리튬(Li), 헤파린암모늄(NH4), 헤파란황산 및 50U/mL의 크렉산(에녹사파린나트륨)(저분자량 헤파린; 평균 분자량=4,500)을 각각 첨가하고, hiPSC를 교반 배양하여, 각종 헤파린류의 효과를 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1x106세포 파종하여, 120rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 배양 2일째 이후 매일 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 헤파린Na 및 헤파린Li를 각각 첨가한 배지를 사용한 배양에서는 3일째에, 그 이외의 헤파린류를 첨가한 배지를 사용한 배양에서는 4일째에 세포괴의 형성 수를 측정하여, 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타내어지는 바와 같이, 각 헤파린염, 저분자량 헤파린 및 헤파란황산의 각각을 첨가한 배지를 사용하여 교반 배양을 행한 경우, 상기 중 어느 것도 첨가하지 않은 Mock에 비해, 세포괴의 형성 수가 향상했다.
이러한 결과로부터, 카운터 양이온의 종류, 분자량 또는 황산화도가 다른 헤파린류가, 모두 세포괴를 다량으로 형성시키는 효과를 갖는 것이 밝혀졌다.
[실시예 5] 분자량이 다른 덱스트란황산나트륨을 사용한 hiPSC의 교반 배양
StemFit(등록 상표) AK03N 배지에, 평균 분자량이 5,000의 덱스트란황산나트륨 및 분자량이 36,000 내지 50,000의 덱스트란황산나트륨을 각각 0.1mg/mL 첨가하고, hiPSC를 교반 배양하여, 분자량이 다른 덱스트란황산나트륨의 효과를 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1x106세포 파종하여, 120rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행하고, 4일째에 세포괴의 형성 수를 측정하고, 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타내어지는 바와 같이, 어느 분자량의 덱스트란황산나트륨을 첨가 한 경우도, 덱스트란황산나트륨을 첨가하지 않은 Mock에 비해, 세포괴의 형성 수가 향상했지만, 평균 분자량이 5,000의 덱스트란황산나트륨을 첨가한 경우의 쪽이, 높은 세포괴의 형성 촉진 효과를 나타냈다.
[실시예 6] 헤파린나트륨을 함유하는 각종 배지를 사용한 hiPSC의 교반 배양
StemFlex 배지, DEF-CS 500 제노프리 3D 스페로이드 배양 배지, Essential 8 배지, mTeSR1 배지의 각각에 0.25mg/mL의 헤파린나트륨을 첨가하고, hiPSC를 교반 배양하여, 상기 각 배지를 사용한 교반 배양에서의 헤파린나트륨의 효과를 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 30mL의 바이오리액터에 6x106세포 파종하여, 55rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 배양 2일째 이후 매일 21mL의 배지 교환을 행하고, DEF-CS 500 제노프리 3D 스페로이드 배양 배지를 사용한 실험에서는 6일째에, 그 이외의 실험에서는 5일째에 세포괴의 형성 수, 세포괴의 장경 및 세포 증식률을 측정하고, 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타내어지는 바와 같이, 어느 배지를 사용한 경우에도, 헤파린나트륨을 첨가한 경우에서, 헤파린나트륨을 첨가하지 않은 경우에 비해 세포괴의 형성 수의 향상, 및 세포괴의 장경의 감소가 관찰되었다. 또한, mTeSR1 배지와 Essential 8 배지를 사용한 배양에 있어서, 헤파린나트륨의 첨가에 의해, 세포 증식률의 현저한 향상이 관찰되었다.
이러한 결과로부터, 배양에 사용하는 배지의 종류에 관계없이, 헤파린염이 세포괴의 형성률을 향상시키고, 또한 세포의 크기를 제어하고, 증식을 촉진시키는 효과를 갖는 것이 밝혀졌다.
[실시예 7] 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 함유하는 각종 배지를 사용한 hiPSC의 교반 배양
Essential 8 배지 및 mTeSR1 배지의 각각에 0.1mg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가하고, hiPSC를 교반 배양하여, 상기 각 배지를 사용한 배양에서의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 효과를 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1x106세포 파종하여, 80rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 배양 2일째 이후 매일 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 4일째에 세포괴의 형성 수 및 세포 증식률을 측정하고, 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타내어지는 바와 같이, 어느 배지에 있어서도, 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가하여 배양한 경우에 세포괴의 형성 수가 향상되고, 세포 증식률이 크게 향상되는 것이 확인되었다.
이러한 결과로부터, 사용하는 배지의 종류에 관계없이, 평균 분자량이 5,000인 덱스트란황산나트륨이 세포괴의 형성 및 증식을 촉진시키는 것이 밝혀졌다.
[실시예 8] 다양한 농도의 헤파린나트륨을 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 교반 배양
mTeSR1 배지에 0.25μg/mL 내지 250μg/mL의 헤파린나트륨을 첨가하고, hiPSC를 교반 배양하여, 세포괴 형성율 향상 효과에서의 헤파린나트륨의 농도 의존성을 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1x106세포 파종하여, 80rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 배양 2일째 내지 3일째에 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 4일째에 세포괴의 형성 수를 측정했다.
또한, StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 0.1mg/mL 및 1mg/mL의 각 농도의 헤파린나트륨을 첨가하고, hiPSC를 교반 배양했다.
1210B2주의 인간 hiPSC를 30mL의 바이오리액터에 6x106세포 파종하여, 120rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 배양 2일째 내지 4일째에는 21mL, 5일째에는 30mL의 배지 교환을 행하고, 6일째에 세포괴의 형성 수를 측정했다.
상기 각각에서, 세포괴 수를 측정한 결과를 도 8에 나타냈다.
도 8에 나타내어지는 바와 같이, mTeSR1 배지에 2.5μg/mL 내지 250μg/mL의 헤파린나트륨을 첨가한 배지를 사용하여 배양한 경우에, 세포괴의 형성 수가 향상하는 것이 확인되었다. 또한, StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 0.1mg/mL 및 1mg/mL의 각 농도의 헤파린나트륨을 첨가하여 교반 배양한 경우에도, 세포괴의 형성률은 큰 폭으로 향상되는 것이 확인되었다.
상기의 결과로부터, 약 1μg/mL에서 1mg/mL 정도의 헤파린나트륨을 첨가함으로써, 세포괴의 형성률의 향상 효과가 얻어지는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 9] 다양한 농도의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 교반 배양
mTeSR1 배지에 0.1μg/mL 내지 1000μg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가하고, hiPSC를 교반 배양하여, 세포괴 형성률 향상 효과에서의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 농도 의존성을 평가했다.
1210B2주의 hiPSC를 5mL의 바이오리액터에 1x106세포 파종하여, 80rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 배양 2일째와 3일째에 3.5mL의 배지 교환을 행하고, 4일째에 세포괴의 형성 수를 측정하고, 결과를 도 9에 나타냈다.
도 9에 나타내어지는 바와 같이, 10μg/mL 내지 1000μg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가한 배지를 사용하여 교반 배양한 경우에, 현저한 세포괴의 형성 수의 향상이 관찰되었다.
이 결과로부터, 평균 분자량이 5,000인 덱스트란황산나트륨을 약 10μg/mL에서 1mg/mL 정도의 농도로 첨가함으로써, 세포괴의 형성률 향상 효과가 얻어지는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 10] 헤파린나트륨을 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 진탕 배양
StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 0.1mg/mL의 헤파린나트륨을 첨가하고, hiPSC를 진탕 배양하여, 헤파린나트륨이 hiPSC의 세포괴의 형성 및 세포의 상태에 미치는 효과를 평가했다.
10μM의 Rho 결합 키나아제 저해제(Y-27632)를 함유하는 상기 배지 5mL를 첨가한 6-웰 세포 배양용 플레이트에 1210B2주의 hiPSC를 1x106세포 파종하여, 95rpm의 진탕 속도로 진탕 배양을 행했다. 배양 1일째의 배양 세포의 BZ-X 현미경에 의한 관찰 결과를 도 10에 나타냈다.
도 10에 나타내어지는 바와 같이, 헤파린나트륨을 첨가하지 않고 배양한 군(Mock)에서는 응집된 거대한 세포괴가 확인되는 반면, 헤파린나트륨을 첨가하여 배양한 군에서는 세포괴가 양호하게 분산되어, 균일한 세포괴의 형성이 확인되었다.
이 결과로부터, 헤파린나트륨을 배지에 첨가하여 hiPSC의 진탕 배양을 행함으로써, 균일한 세포괴를 형성시키는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다.
[실시예 11] 다양한 농도의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 함유하는 배지를 사용한 hiPSC의 교반 배양
StemFit(등록 상표) AK03N 배지에 10μg/mL 내지 1000μg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가하고, hiPSC를 교반 배양하여, 세포괴 형성률 향상 효과에서의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)의 농도 의존성을 평가했다.
1231A3주 및 1210B2주의 각 hiPSC를, 각각 5mL의 바이오리액터에 1x106세포씩 파종하여, 80rpm의 교반 속도로 교반 배양을 행했다. 2일째에 세포괴의 형성 수를 측정하고, 결과를 도 11에 나타냈다.
도 11에 나타내어지는 바와 같이, 1231A3주를 사용한 경우에는, 10μg/mL 내지 330μg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가한 배지를 사용하여 교반 배양한 경우에, 세포괴의 형성 수의 향상이 확인되고, 10μg/mL 내지 1000μg/mL의 농도에서, 세포괴 장경의 감소가 관찰되었다.
한편, 1210B2주를 사용한 경우에는, 10μg/mL 내지 1000μg/mL의 덱스트란황산나트륨(평균 분자량=5,000)을 첨가한 경우에, 세포괴의 형성 수의 향상 및 세포괴 장경의 감소가 관찰되었다.
상기의 결과로부터, 평균 분자량이 5,000인 덱스트란황산나트륨을 약 10μg/mL 내지 1mg/mL 정도의 농도로 첨가함으로써, hiPSC주의 종류에 관계없이 세포괴의 형성률 향상, 및 세포괴의 크기의 제어 효과가 얻어질 가능성이 시사되었다.
[산업상 이용 가능성]
이상, 상술한 바와 같이, 본 발명에 의해, 줄기세포의 부유 배양에 유용한 배양용 첨가물 및 배지를 제공할 수 있다.
본 발명의 배양용 첨가물 및 배지에 의해, 줄기세포의 부유 배양에 있어서, 줄기세포의 증식률 및 생존율을 향상시킬 수 있고, 크기 및 형상이 제어된 세포괴의 형성률을 향상시키고, 또한 미분화 유지율을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의해, 줄기세포의 배양 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 배양 방법에 의해, 고증식률 및 생존율로 줄기세포의 3차원 배양을 행할 수 있고, 크기 및 형상이 제어된 세포괴를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한, 미분화 유지율이 향상된 줄기세포의 배양 세포를 얻을 수 있다.
본원은, 일본에서 출원된 특허출원 2018-122532를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (23)

  1. 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는, 줄기세포 배양용 첨가물.
  2. 제1항에 있어서, 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 첨가물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 다당류로서, 음전하를 갖는 관능기를 갖는 음이온성의 다당류 또는 그 염인, 첨가물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 황산화다당 또는 그 염인, 첨가물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 헤파린 및 그 염 및 중량 평균 분자량이 5,000 내지 50,000인 덱스트란황산 및 그 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 첨가물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포 배양용 배지에 첨가되는, 첨가물.
  7. 제6항에 있어서, 배지의 전량에 대하여, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류의 농도가 1μg/mL 내지 1mg/mL가 되도록 첨가되는, 첨가물.
  8. 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는, 줄기세포 배양용 배지.
  9. 제8항에 있어서, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 배양용인, 배지.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 다당류로서, 음전하를 갖는 관능기를 갖는 음이온성의 다당류 또는 그 염인, 배지.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 황산화다당 또는 그 염인, 배지.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 헤파린 및 그 염 및 중량 평균 분자량이 5,000 내지 50,000인 덱스트란황산 및 그 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배지.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류의 함유량이 1μg/mL 내지 1mg/mL인, 배지.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 피더프리 배지인, 배지.
  15. 제14항에 있어서, 무혈청 배지인, 배지.
  16. 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류를 함유하는 줄기세포의 배양용 배지에서, 줄기세포를 부유 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포의 배양 방법.
  17. 제16항에 있어서, 줄기세포가, 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배양 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 다당류로서, 음전하를 갖는 관능기를 갖는 음이온성의 다당류 또는 그 염인, 배양 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 상기 덱스트란황산 이외의 황산화다당 또는 그 염인, 배양 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류가, 헤파린 및 그 염 및 중량 평균 분자량이 5,000 내지 50,000인 덱스트란황산 및 그 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 배양 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포의 배양용 배지에서의 분자량이 4,000kDa 내지 40,000kDa인 덱스트란황산 이외의 다당류의 함유량이 1μg/mL 내지 1mg/mL인, 배양 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포의 배양용 배지가 피더프리 배지인, 배양 방법.
  23. 제22항에 있어서, 줄기세포의 배양용 배지가 무혈청 배지인, 배양 방법.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2022172959A1 (ja) * 2021-02-09 2022-08-18 株式会社彩 細胞処理剤
CN113801837A (zh) * 2021-09-13 2021-12-17 河南茵特赛尔生物技术有限公司 一种干细胞培养基及其制备方法
WO2024089212A1 (en) * 2022-10-26 2024-05-02 Societe Des Produits Nestle S.A. Processes for cell expansion

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001035968A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Children's Medical Center Corporation Methods for inducing chondrogenesis and producing de novo cartilage in vitro
GB0613756D0 (en) * 2006-07-12 2006-08-23 Univ Sheffield Cell culture medium
JP2011514169A (ja) * 2008-03-17 2011-05-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞培養のためのマイクロキャリア
WO2013147264A1 (ja) * 2012-03-30 2013-10-03 味の素株式会社 硫酸化化合物を含む幹細胞増殖用培地
SG11201505965TA (en) * 2013-01-31 2015-09-29 Ajinomoto Kk Culture method for stable undifferentiated proliferation of pluripotent stem cells
WO2015042356A1 (en) * 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
JP6422221B2 (ja) * 2014-03-04 2018-11-14 旭化成株式会社 多能性幹細胞からなる細胞塊製造方法
ES2947291T3 (es) 2015-12-28 2023-08-04 Ajinomoto Kk Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina
JP6792777B2 (ja) * 2016-02-22 2020-12-02 凸版印刷株式会社 スフェロイド形成促進方法
JP2018122532A (ja) 2017-02-01 2018-08-09 京セラドキュメントソリューションズ株式会社 画像形成装置及び画像形成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허문헌 1: 생물공학 92 (9) 469-472 (2014)
비특허문헌 2: 생물공학 92 (9) 487-490 (2014)
비특허문헌 3: Biotechnology and Bioengineering 2018, 1-6

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