KR20210124525A - 세포 회수가 용이한 부유 배양용 배양 배지 조성물 및 세포 회수 방법 - Google Patents

세포 회수가 용이한 부유 배양용 배양 배지 조성물 및 세포 회수 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2가 금속 양이온 배지에서 랜덤 코일 상태를 유지하고 2가 금속 이온을 통해 가교결합할 수 있는 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염, 및 산성 다당류 또는 이의 염을 함유하고 세포 또는 조직의 부유 배양을 허용하는 배지 조성물을 제공하고, 여기서, 배지 조성물 중의 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 농도는 0.002 내지 0.01(w/v)%이고, 산성 다당류 또는 이의 염의 농도는 0.004 내지 0.1(w/v)%이고, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염에 대한 산성 다당류 또는 이의 염 의 질량비는 1 이상이다. 또한, 본 발명은 세포 또는 조직을 배양 제제에 전단력을 적용하는 단계를 포함하여, 배지 조성물 및 세포 또는 조직을 함유하는 배양 제제로부터 세포 또는 조직을 단리하는 방법을 제공한다.

Description

세포 회수가 용이한 부유 배양용 배양 배지 조성물 및 세포 회수 방법{CULTURE MEDIUM COMPOSITION FOR SUSPENSION CULTURE ALLOWING EASY CELL RECOVERY, AND CELL RECOVERY METHOD}
본 발명은 용이한 세포 회수를 허용하는 부유 배양 (suspension culture)용 배지 조성물 및 배지 조성물을 함유하는 세포 배양물로부터 세포 회수 방법에 관한 것이다.
탈아실화 젤란 검(deacylated gellan gum; DAG) 등의 다당류는 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 집합하여 수중 3차원 네트워크(무정형 구조)를 형성한다. 3차원 네트워크를 함유하는 액체 배지에서 세포를 배양하면 배지 중의 세포는 3차원 네트워크에 포획되어 가라않지 않는다. 따라서, 세포는 부유되고, 진탕, 회전 조작 등을 요구하지 않는 부유 상태(정치 부유 배양)에서 균일하게 분산된 상태에서 배양될 수 있다. 또한, 액체 배지의 점도를 실질적으로 증가하지 않고 상기 3차원 네트워크를 형성하는 것이 가능하다. 따라서, 3차원 네트워크를 함유하는 배지 조성물은 계대 등에서 조작성도 우수하다(특허 문헌 1). 정치 부유 배양을 가능하게 하는 이 배지 조성물은 다양한 세포의 증식 활성의 촉진 등과 같은 다양한 우수한 특성을 갖는다. 따라서, 재생 의료, 단백질 등의 대량 생산 등과 같은 다양한 기술 분야에의 응용이 기대된다.
WO 제2014/017513호
본 발명자들은, 세포 또는 조직을 탈아실화 젤란 검(DAG)을 함유하고 정치 부유 배양을 허용하는 배지 조성물을 사용하여 배양하고, 상기 세포 또는 조직을 원심분리하여 배양물에서 회수하는 경우, 상기 세포 및 조직은 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하려는 배지 조성물의 효과로 인해 충분히 침전되지 않고, 회수율이 낮게 유지되는 이러한 문제를 주시했다.
본 발명은 용이한 세포 회수를 허용하는 부유 배양용 조성물 및 상기 배지 조성물을 함유하는 세포 배양물로부터 세포를 회수하는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위한 시도에서 집중적인 연구를 수행했다. 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과는 탈아실화 젤란 검이 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 집합하여 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)에 의해 생성된다. 따라서, 그들은 세포 또는 조직이 신속하게 침전될 수 있고, 회수율은 부유 배양 완료 후 세포 또는 조직을 배양물로부터 원심분리로 회수하기 직전에 3차원 네트워크를 파괴하여 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 손실시켜 향상시킬 수 있다고 간주했다. 그들은 다당류로서 탈아실화 젤란 검(DAG)만을 함유하고 정치 부유 배양을 가능하게 하는 배지 조성물에서 세포의 정치 부유 배양 후 피펫팅, 필터 여과 등과 같은 작업에 의해 배지 조성물에 전단력을 적용하여 상기 3차원 네트워크를 파괴하려고 시도했다. 그 결과, 세포 회수율은 충분히 만족스럽지는 않았지만 특정 정도로 향상되었다. 따라서, 그들은 배지 조성물의 성분을 연구하고, 탈아실화 젤란 검 이외에, 특정 농도의 나트륨 알기네이트를 배지에 첨가하면 정치 배양시 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과는 유지되고, 필요에 따라 킬레이트제를 첨가하고, 피펫팅, 필터 여과 등에 의해 전단력을 적용함으로써 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과가 신속하게 사라지는(세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 전단력에 대한 취약성) 우수한 특성을 달성한다는 것을 발견했다. 탈아실화 젤란 검 및 나트륨 알기네이트를 함유하는 배지 조성물을 이용하면, 세포 및 조직의 장기간 정치 부유 배양이 가능했다. 또한, 세포 및 조직은 피펫팅, 필터 여과 등과 같은 비교적 쉬운 조작으로 세포 및 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 신속히 상실시킨 후, 세포 및 조직을 원심분리시킴으로써 높은 수율로 회수할 수 있었다. 탈아실화 젤란 검은 비교적 선형 구조를 갖는 구성 단위를 가지며, 복수의 탈아실화 젤란 검 쇄가 배지 조성물에서 번들화하여 단단하고 안정한 3차원 네트워크를 형성한다. 그 결과, 3차원 네트워크는 피펫팅, 필터 여과 등에 의해 파괴하기 어려워 세포 회수율의 저하를 유발한다. 한편, α1-4 결합된 L-글루쿠론산과 β1-4 결합된 D-만누론산의 두 우론산의 포함으로 인해 비교적 벌키한 구조를 갖는 알긴산이 배지 조성물이 첨가되는 경우, 배지 조성물 중의 탈아실화 젤란 검의 농도는 상대적으로 감소될 수 있을 뿐만 아니라, 탈아실화 젤란 검의 번들화가 억제된다. 이는 또한 피펫팅, 필터 여과 등으로 전단력을 적용하여 3차원 네트워크의 용이한 파괴를 가능하게 하여 가능하게는 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 신속한 상실과 세포 회수율의 향상을 초래한다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 추가로 연구하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 다음을 제공한다.
[1] 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염, 및 2가 금속 양이온 배지에서 랜덤 코일 상태를 유지시키고 2가 금속 이온을 통해 가교결합할 수 있는 산성 다당류 또는 이의 염을 포함하는, 세포 또는 조직의 부유 배양을 허용하는 배지 조성물로서,
상기 배지 조성물 중의 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 농도가 0.002 내지 0.01(w/v)%이고, 상기 산성 다당류 또는 이의 염의 농도가 0.004 내지 0.1(w/v)%이며, 상기 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염에 대한 상기 산성 다당류 또는 이의 염의 질량비가 1 이상인, 배지 조성물.
[2] 항목 [1]에 있어서, 상기 산성 다당류가 알긴산, 펙틴 및 펙틴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 배지 조성물.
[3] 항목 [2]에 있어서, 상기 산성 다당류가 알긴산인, 배지 조성물.
[4] 항목 [1] 내지 [3] 중 어느 한 항목에 있어서, 금속 양이온을 추가로 포함하는, 배지 조성물.
[5] 항목 [4]에 있어서, 상기 금속 양이온이 칼슘 이온인, 배지 조성물.
[6] 항목 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 산성 다당류 또는 이의 염이 고압 증기 멸균 처리되는, 배지 조성물.
[7] 항목 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항목의 배지 조성물 및 세포 또는 조직을 포함하는 세포 또는 조직 배양 제제.
[8] 항목 [1] 내지 [6] 중 어느 한 항목의 배지 조성물에서 세포 또는 조직을 배양하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 배양 방법.
[9] 상기 배양 제제에 전단력을 적용하는 단계를 포함하는, 항목 [7]의 배양 제제로부터 세포 또는 조직을 단리하는 방법.
[10] 항목 [9]에 있어서, 상기 전단력이 피펫팅 또는 필터 여과에 의해 배양 제제에 적용되는, 방법.
[11] 항목 [9] 또는 [10]에 있어서, 상기 배양 제제에 킬레이트제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[12] 항목 [9] 내지 [11] 중 어느 한 항목에서, 상기 배양 제제를 전단력을 적용한 후 원심분리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
본 발명의 배지 조성물은 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 갖고, 필요에 따라 킬레이트제를 첨가하고, 피펫팅, 필터 여과 등에 의해 전단력을 적용함으로써 상기 효과를 신속하게 손실하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 세포 및 조직은 부유 배양될 수 있고(바람직하게는, 정치 부유 배양), 세포 및 조직은 수득된 배양 제제로부터 높은 회수율로 회수될 수 있다. 특히, 세포 및 조직은 수득된 배양 제제의 용적을 유지하면서, 즉 배지 용액, 완충액, 물 등으로 배양 제제를 희석하지 않고 높은 회수율로 회수할 수 있다.
본 발명은 이하 더욱 상세하게 기재된다.
배지 조성물
본 발명은 부유물에서 세포 또는 조직을 배양할 수 있게 하는 배지 조성물을 제공한다. 배지 조성물은 부유 상태를 유지하면서 이를 함유하는 목적하는 세포 또는 조직을 배양할 수 있게 한다.
본 발명의 세포는 동물 또는 식물을 구성하는 가장 기본적인 단위이며, 이의 요소로서 세포막의 내부에 세포질과 각종 세포 소기관을 갖는다. 이 경우에, DNA를 캡슐화하는 핵은 세포 내부에 함유될 수도 있고 함유되지 않을 수도 있다. 예를 들면, 본 발명에서 동물 유래 세포는 정자 및 난자 등의 생식 세포, 생체를 구성하는 체세포, 줄기 세포, 전구 세포, 생체에서 분리된 암 세포, 불멸화 능력을 획득하고 시험관내(세포주)에서 안정하게 유지되는 생체에서 분리된 세포, 생체로부터 분리되어 인위적으로 유전자 변형이 이루어진 세포, 핵이 인위적으로 교환된 생체로부터 분리된 세포 등을 포함한다. 생체를 구성하는 체세포의 예는 섬유아세포, 골수 세포, B 림프구, T 림프구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 대식세포, 단핵구, 뼈 세포, 골수 세포, 원주 상피 세포, 수지상 세포, 케라티노사이트, 지방 세포, 간엽 세포, 상피 세포, 표피 세포, 내피 세포, 혈관 내피 세포, 간세포, 연골 세포, 난구 세포, 신경계 세포, 신경교 세포, 신경 세포, 희소돌기아교세포, 소교 세포, 성상 세포, 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포(예: 평활근 세포 또는 골격근 세포), 췌장 베타 세포, 멜라닌 세포, 조혈 전구 세포 및 단핵 세포 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 체세포는 임의의 조직, 예를 들면, 피부, 신장, 비장, 부신, 간, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 비장, 방광, 전립선, 고환, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액, 심장, 눈, 뇌 또는 신경 조직 등으로부터 채취되는 세포를 포함한다. 줄기 세포는 자신을 복제하는 능력과 다른 여러 계통으로 분화하는 능력을 동시에 갖는 세포이다. 이의 예로는 배아 줄기 세포(ES 세포), 배아 종양 세포, 배아 생식 줄기 세포, 인공 만능 줄기 세포(iPS 세포), 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 생식 줄기 세포, 장 줄기 세포, 암 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 전구 세포는 상기 줄기 세포에서 특정 체세포 또는 생식 세포로 분화하는 과정에 있는 세포이다. 암 세포는 체세포에서 유래되고 무한 증식 능력을 획득한 세포이다. 세포주는 시험관내에서 인공 조작에 의해 무한 증식 능력을 획득한 세포이며, 이의 예로는 CHO(차이니즈 햄스터 난소 세포주), HCT116 , Huh7, HEK293(인간 배아 신장 세포), HeLa(인간 자궁암 세포주), HepG2(인간 간암 세포주), UT7/TPO(인간 백혈병 세포주), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT-29, AE-1, 3D9, Ns0/1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five(등록 상표), Vero 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물 유래 세포는 또한 식물체의 각 조직에서 분리된 세포뿐만 아니라 세포에서 세포벽을 인위적으로 제거함으로써 수득된 원형질체를 포함한다.
본 발명의 조직은 여러 종류의 다른 성질과 기능을 갖는 세포의 특정 방식의 집합인 구조의 단위이며, 동물의 조직의 예로는 상피 조직, 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 등이 포함된다. 식물 조직의 예로는 분열 조직, 표피 조직, 동화 조직, 엽육 조직, 전도성 조직, 기계 조직, 실질 조직, 탈분화된 세포 클러스터(유합 조직) 등이 포함된다.
세포 또는 조직을 배양할 경우, 배양될 세포 또는 조직은 상기 기재된 세포 또는 조직에서 자유롭게 선택되어 배양될 수 있다. 세포 또는 조직은 동물 또는 식물체에서 직접 회수될 수 있다. 세포 또는 조직은 특정 처리를 적용함으로써 동물 또는 식물체에서 유도되거나 성장되거나 형질전환된 후 채취될 수 있다. 이러한 경우, 처리는 생체내 또는 시험관내일 수 있다. 동물의 예로는 어류, 양서류, 파충류, 조류, 범갑각류, 육각류, 포유류 등이 포함된다. 포유류의 예로는 랫트, 마우스, 토끼, 기니피그, 다람쥐, 햄스터, 들쥐, 오리너구리, 돌고래, 고래, 개, 고양이, 염소, 소, 말, 양, 돼지, 코끼리, 코먼 마모셋, 다람쥐 원숭이, 붉은 털 원숭이, 침팬지 및 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 식물은 채취된 세포 또는 조직이 액체 배양물에 적용될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 예를 들면, 생약류(예: 사포닌, 알칼로이드류, 베르베린, 스코폴린, 식물 스테롤 등)를 생산하는 식물(예: 인삼, 페리윙클, 사리풀, 황련, 벨라돈나 등), 화장품 또는 식품의 출발 물질이 되는 염료 또는 다당류(예: 안토시아닌, 잇꽃 염료, 매더 염료, 사프란 염료, 플라본 등)를 생성하는 식물(예: 블루베리, 잇꽃, 매더, 사프란 등) 또는 약제학적 약물 물질을 생산하는 식물 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 세포 또는 조직의 부유는 세포 또는 조직이 배양 용기에 접착하지 않은 상태(비접착성)를 의미한다. 또한, 본 발명에서, 세포 또는 조직을 배양할 때, 액체 배지 조성물 상에 외부 압력 또는 진동 또는 조성물에서 진탕, 회전 작업 등의 부재하에 세포 또는 조직이 액체 배지 조성물에 균일하게 분산되어 부유되는 상태는 "정치 부유"로서 칭명되고, 이러한 상태에서 세포 또는 조직의 배양은 "정치 부유 배양"으로서 칭명된다. "정치 부유"에서, 부유 기간은 5분 이상(예: 적어도 5 내지 60분), 1시간 이상(예: 1시간 내지 24시간), 24시간 이상(예: 1일 내지 21일), 48시간 이상, 7일 이상 등을 포함하지만, 상기 기간은 부유 상태가 유지되는 한 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배지 조성물은 세포 또는 조직을 유지시키거나 배양할 수 있는 온도 범위(예: 0 내지 40℃)에서 적어도 한 지점에서 세포 및/또는 조직의 정치 부유를 허용한다. 본 발명에 사용되는 배지 조성물은 바람직하게는 25 내지 37℃의 온도 범위의 적어도 한 지점에서, 가장 바람직하게는 37℃에서 세포 및/또는 조직의 정치 부유를 허용한다.
정적 부유가 가능한지의 여부는, 예를 들면, 배양되는 세포를 평가되는 배지 조성물에 2 × 104 세포/ml의 농도로 균일하게 분산시키고, 이의 10ml를 15ml 원뿔관에 주입하고, 상기 관을 37℃에서 적어도 5분 이상(예: 1시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 7일 이상) 동안 정치시키고, 세포의 부유 상태가 유지되는지의 여부를 관찰함으로써 평가될 수 있다. 전체 세포 중 70% 이상이 부유 상태로 존재하는 경우, 부유 상태가 유지되었다고 결론 지어진다. 폴리스티렌 비드(크기 500 내지 600㎛, Polysciences Inc. 제조)가 세포 대신에 평가용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 함유한다. 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 함유하는 본 발명의 배지 조성물에는 세포 및 조직의 부유 배양(바람직하게는, 정치 부유 배양)을 가능하게 하는 특성(세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과)이 제공된다.
탈아실화 젤란 검은 1-3 결합된 글루코스, 1-4 결합된 글루쿠론산, 1-4 결합된 글루코스 및 1-4 결합된 람노스의 4분자의 당을 구성 단위로서 함유하는 선형 중합체 다당류이며, 다음 화학식 I(여기서, R1, R2는 각각 수소 원자이고, n은 2 이상의 정수이다)로 표시되는 다당류이다. R1은 글리세릴 그룹을 함유할 수 있고, R2는 아세틸 그룹을 함유할 수 있고, 아세틸 그룹 및 글리세릴 그룹의 함량은 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하이다.
[화학식 I]
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탈아실화 젤란 검은 발효 배지에서 젤란 검 생산 미생물을 배양하고, 진균체 외부 생산된 점막 생성물을 알칼리 처리에 적용하고, 1-3 결합된 글루코스 잔기에 결합된 글리세릴 그룹 및 아세틸 그룹을 탈아실화하여 회수하고, 건조, 분쇄 등의 단계 후 생성물을 분말화함으로써 생성될 수 있다. 정제 방법의 예는 액체-액체 추출, 분별 침전, 결정화, 각종 이온 교환 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 등을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피, 활성탄, 실리카 겔 등을 이용하는 흡착 크로마토그래피 또는 박층 크로마토그래피에 의한 활성 물질의 흡착 및 탈착 처리, 역상 컬럼 등을 이용하는 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하고, 그들을 단독으로 또는 임의의 순서로 조합하여 또는 반복적으로 사용함으로써 불순물을 제거할 수 있고, 화합물을 정제할 수 있다. 젤란 검 생산 미생물의 예로는 스핑고모나스 엘로데아(Sphingomonas elodea) 및 스핑고모나스 엘로데아의 유전자를 변형시켜 수득된 미생물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
탈아실화 젤란 검으로서, 인산화된 것도 또한 사용될 수 있다. 인산화는 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
R1 및/또는 R2의 하이드록실 그룹이 C1-3 알콕시 그룹, C1-3 알킬설포닐 그룹, 글루코스 또는 프럭토스 등의 단당류 잔기, 수크로스, 락토스 등의 올리고당 잔기, 또는 글리신, 아르기닌 등의 아미노산 잔기로 치환되는 화학식 I로 표시되는 화합물의 탈아실화 젤란 검 유도체도 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 탈아실화 젤란 검은 또한 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 등의 가교결합제를 사용하여 가교결합시킬 수 있다.
염의 예로는 리튬, 나트륨, 칼륨과 같은 알칼리 금속 염; 칼슘, 바륨, 마그네슘과 같은 알칼리 토금속 염; 알루미늄, 아연, 구리, 철 등의 염; 암모늄 염; 테트라에틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 메틸트리부틸암모늄, 세틸트리메틸암모늄, 벤질메틸헥실데실암모늄, 콜린 등의 4급 암모늄 염; 피리딘, 트리에틸아민, 디이소프로필아민, 에탄올아민, 디올라민, 트로메타민, 메글루민, 프로카인, 클로로프로카인 등의 유기 아민과의 염; 글리신, 알라닌, 발린 등의 아미노산과의 염 등을 포함한다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 중량 평균 분자량은 바람직하게는 10,000 내지 50,000,000, 보다 바람직하게는 100,000 내지 20,000,000, 더욱 바람직하게는 1,000,000 내지 10,000,000이다. 예를 들면, 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 풀루란에 기초하여 측정할 수 있다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염으로서, 시판되는 제품, 예를 들면, "KELCOGEL(시피 켈코(CP Kelco)의 등록 상표) CG-LA"(제조: 산쇼 캄파니, 리미티드(SANSHO Co., Ltd.)), "KELCOGEL(시피 켈코의 등록 상표)"(제조: 산-에이 젠 에프.에프.아이., 인코포레이티드(San-Ei Gen F.F.I., Inc.)) 등이 사용될 수 있다.
알긴산은 α1-4 결합된 L-글루쿠론산과 β1-4 결합된 D-만누론산의 두 우론산이 직쇄 중합된 구조를 갖는 다당류이다.
알긴산 또는 이의 염은 알긴산의 카복실 그룹의 이온 교환 반응에 의해 다시마 및 미역으로 대표되는 갈조류에서 추출되어 정제될 수 있다. 조류 본체 중 알긴산은 칼슘 이온 등의 다가 양이온과의 불용성 염으로 존재한다. 따라서, 이것은 Na와 이온 교환되어 조류 본체 외부로 추출되는 수용성 나트륨 알기네이트를 수득한다. 또한, 나트륨 알기네이트의 수용액에 산을 첨가하여 불용성 알긴산의 응고 및 침전을 유발하고, 응고되고 침전된 알긴산을 단리시켜 정제된 알긴산을 수득한다.
염의 예는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속 염; 칼슘, 바륨, 마그네슘 등의 알칼리 토금속 염; 알루미늄, 아연, 구리, 철 등의 염; 암모늄 염; 테트라에틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 메틸트리부틸암모늄, 세틸트리메틸암모늄, 벤질메틸헥실데실암모늄, 콜린 등의 4급 암모늄 염; 피리딘, 트리에틸아민, 디이소프로필아민, 에탄올아민, 디올라민, 트로메타민, 메글루민, 프로카인, 클로로프로카인 등과 같은 유기 아민과의 염; 글리신, 알라닌, 발린 등과 같은 아미노산과의 염 등을 포함한다. 본 발명에서, 나트륨 알기네이트가 물에 대한 용해도 관점에서 바람직하게 사용된다.
알긴산 또는 이의 염의 중량 평균 분자량은 바람직하게는 300 내지 50,000,000, 보다 바람직하게는 500 내지 10,000,000, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 5,000,000이다. 예를 들면, 분자량은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 풀루란에 기초하여 측정할 수 있다.
알긴산 또는 이의 염으로서, 시판되는 제품, 예를 들면, 다음 제품이 사용될 수도 있다.
키미카 코포레이션(KIMICA Corporation):
키미카 알긴산 시리즈 IL-2, IL-6, I-1, I-3, I-5 I-8, ULV-L3, ULV-L5, ULV-1, ULV-3, ULV-5 , ULV-20, ULV-L3G, IL-6G I-1G I-3G, IL-6M, BL-2, BL-6, B-1, B-3, B-5, B-8, SKAT-ONE, SKAT-ULV
알기테크 시리즈 LL, L, M, H
키코만 바이오케미파 캄파니(KIMICA Biochemifa Company):
DUCK ALGIN NSPH2R, NSPHR, NSPMR, NSPLR, NSPLLR
산쇼 캄파니, 리미티드(SANSHO Co., Ltd.):
SUKOGIN, SAN-ALGIN
홋카이도 미쓰이 케미칼스, 인코포레이티드(Hokkaido Mitsui Chemicals, Inc.):
알긴산 올리고당 ALGIN
알긴산은 2가 금속 양이온 배지 중에서 랜덤 코일 상태를 유지할 수 있고 2가 금속 이온을 통해 가교결합될 수 있는 산성 다당류이다. 2가 금속 양이온 배지 중에서 랜덤 코일 상태를 유지할 수 있고, 2가 금속 이온을 통해 가교결합될 수 있는 알긴산 이외의 산성 다당류 또는 이의 염이 알긴산 또는 이의 염 대신에 사용되는 경우에도 본 발명의 배지 조성물의 것과 동일한 효과가 제공될 수 있다는 것이 예상된다. 2가 금속 양이온 배지 중에서 랜덤 코일 상태를 유지할 수 있고 2가 금속 이온을 통해 가교결합될 수 있는 산성 다당류로서, 알긴산, 펙틴, 펙틴산 등을 들 수 있다. 2가 금속 양이온으로서, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 바륨 이온, 구리 이온, 철 이온, 아연 이온, 주석 이온, 납 이온 등을 들 수 있다. 본 발명은 2가 금속 양이온 배지 중에서 랜덤 코일 상태를 유지할 수 있고, 2가 금속 이온을 통해 가교결합될 수 있는 알긴산 이외의 산성 다당류 또는 이의 염이 알긴산 또는 이의 염 대신에 사용되는 구현예를 또한 포함한다.
탈아실화 젤란 검 및 알긴산은 호변이성체, 기하 이성체, 호변이성체와 기하 이성체의 혼합물, 또는 환 내 또는 환 외 이성체화에 의해 형성된 이들의 혼합물의 형태로 존재할 수 있다 . 탈아실화 젤란 검 및 알긴산이, 화합물이 이성체화에 의해 형성되는지의 여부와 무관하게 비대칭 중심을 갖는 경우, 이는 분할된 광학 이성체 또는 이들을 임의의 비율로 함유하는 혼합물의 형태로 존재할 수 있다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염은 액체 배지와 혼합될 경우 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 집합시켜 3차원 네트워크(무정형 구조)를 형성한다. 다당류가 금속 양이온을 통해 마이크로겔을 형성하고(예: JP-A-2004-129596), 상기 무정형 구조가 또한 하나의 구현예로서 이러한 마이크로겔도 포함한다는 것이 공지되어 있다. 금속 양이온을 통한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합의 한 구현예는 필름 구조이다. 본 발명의 배지 조성물은 금속 양이온(예: 칼륨 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)를 함유한다. 세포 또는 조직이 본 발명의 배지 조성물에서 배양되는 경우, 배지 조성물에 부유된 세포 또는 조직은 3차원 네트워크에 포획되어 침강물을 형성하지 않는다. 따라서, 세포 또는 조직은 진탕, 회전 조작 등을 필요로 하지 않고 부유된 상태로 균일하게 분산된 상태로 배양될 수 있다(정치 부유 배양). 바람직한 구현예에서 본 발명의 배지 조성물은 상기 3차원 네트워크(무정형 구조)를 균일하게 분산된 상태로 함유한다.
바람직한 구현예에서, 상기 3차원 네트워크(무정형 구조)의 형성은 본 발명의 배지 조성물의 점도를 실질적으로 증가시키지 않는다. "배지 조성물의 점도를 실질적으로 증가시키지 않는"은 배지 조성물의 점도가 8mPa·s를 초과하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 경우에, 액체 배지 조성물의 점도는 37℃에서 8mPa·s 이하, 바람직하게는 4mPa·s 이하, 더욱 바람직하게는 2mPa·s 이하이다.
배지 조성물의 점도는, 예를 들면, 이하 언급된 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다. 구체적으로, 이는 37℃ 조건하에 E형 점도계(제조원: 도키 산교캄파니, 리미티드(Toki Sangyo Co., Ltd.), TV-22형 점도계, 모델: TVE-22L, 콘 로터: 표준 로터 1°34'×R24, 회전 속도 100rpm)를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 "탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염" 이외의 다당류 또는 이의 염을 함유할 수 있다. 다당류는 바람직하게는 음이온성 작용기를 갖는 산성 다당류이다. 산성 다당류는 이의 구조에 음이온성 작용기를 갖는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 우론산(예: 글루쿠론산, 이두론산, 갈락투론산, 만누론산)을 갖는 다당류, 이의 구조의 일부에 황산 그룹 또는 인산 그룹을 갖는 다당류 및 두 구조를 갖는 다당류를 포함하고, 자연적으로 수득된 다당류 뿐만 아니라 미생물에 의해 생성된 다당류, 유전자 공학에 의해 생성된 다당류 및 효소를 이용하여 인공적으로 합성된 다당류도 포함한다. 보다 구체적으로, 이의 예는 히알루론산, 천연 젤란 검, 람산 검, 디우탄 검, 크산탄 검, 카라기난, 크산탄 검, 헥수론산, 후코이단, 펙틴, 펙트산, 펙틴산, 헤파란 설페이트, 헤파린, 헤파리틴 설페이트, 케라토설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 람난 설페이트 및 이의 염을 포함한다.
본 발명의 배지 조성물 중의 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 농도는, 예를 들면, 0.002 내지 0.01(w/v)%, 바람직하게는 0.002 내지 0.009(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.003 내지 0.009(w/v)%이다.
본 발명의 배지 조성물 중의 알긴산 또는 이의 염의 농도는, 예를 들면, 0.004 내지 0.1(w/v)%, 바람직하게는 0.004 내지 0.02(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.004 내지 0.015(w/v )%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 0.015(w/v)%이다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 농도는 세포 또는 조직을 부유시키는 충분한 작용을 보장하기 위해 바람직하게는 0.002(w/v)% 이상, 바람직하게는 0.003(w/v)% 이상이다. 한편, 농도가 너무 높으면 부유 작용이 강해져 세포 회수율 및 배지 자체의 취급성을 저하시킬 수 있다. 따라서, 이는 0.01(w/v)% 이하, 바람직하게는 0.009(w/v)% 이하이다. 알긴산 또는 이의 염의 농도는 전단력에 의해 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 신속한 소실을 제공하는 특성(세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 전단력에 대한 취약성)을 보장하기 위해 0.004(w/v)% 이상, 바람직하게는 0.005(w/v)% 이상이다. 한편, 이 농도가 너무 높으면 겔화가 발생할 수 있다. 이는 0.1(w/v)% 이하, 바람직하게는 0.02(w/v)% 이하, 보다 바람직하게는 0.015(w/v)% 이하이다.
본 발명의 배지 조성물에 함유되는 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 질량비는 전단력에 의해 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 신속하게 손실하는 특성을 달성하기 위해 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 1질량부 당 알긴산 또는 이의 염 1질량부 이상, 바람직하게는 2질량부 이상이다. 하나의 구현예에서, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 1질량부 당, 예를 들면, 1 내지 4질량부, 바람직하게는 1 내지 3질량부, 보다 바람직하게는 1 내지 2질량 부의 알긴산 또는 이의 염이 사용된다.
배지 조성물 중 화합물의 농도는 다음 식으로 계산될 수 있다.
농도[%(W/V)] = 화합물의 중량(g)/배지 조성물의 용적(ml) × 100
상기 함량으로 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 함유하는 본 발명의 배지 조성물은 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 제공한다. 또한, 상기 함량으로 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 함유하는 본 발명의 배지 조성물은 피펫팅, 필터 여과 등과 같은 전단력에 의해 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 신속하게 상실하는 특성(세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 전단력에 대한 취약성)을 갖는다.
본 발명의 배지 조성물은 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)를 함유하고, 이는 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 제공한다. 알긴산 또는 이의 염의 존재로 인해, 3차원 네트워크는 킬레이트제 또는 전단력에 취약하고, 3차원 네트워크는 피펫팅, 필터 여과 등에 의한 전단력에 의해 쉽게 파괴된다. 그 결과, 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과는 신속하게 손실된다. 탈아실화 젤란 검은 비교적 선형 구조를 갖는 구성 단위를 함유한다. 복수의 탈아실화 젤란 검 쇄가 배지 조성물에서 번들화하여 단단하고 안정한 3차원 네트워크를 형성한다. 이 3차원 네트워크는 킬레이트제, 피펫팅, 필터 여과 등에 의해 파괴되기 어렵다. 대조적으로, α1-4 결합된 L-글루쿠론산과 β1-4 결합된 D-만누론산의 두 우론산의 존재로 인해 비교적 벌키한 구조를 갖는 알긴산을 배지 조성물에 첨가하면 탈아실화 젤란 검의 번들화가 억제된다. 그 결과, 3차원 네트워크는 피펫팅, 필터 여과 등에 의한 전단력에 취약해지는 것으로 간주되지만, 이론에 의해 특별히 결부되지 않는다. 따라서, 본 발명은 배지 조성물에 알긴산 또는 이의 염을 첨가하는 단계를 포함하여, 배지 조성물에서 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)의 전단력에 대한 취약성을 촉진시키는 방법으로서 간주될 수 있다.
상술한 바와 같이, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 액체 배지와 혼합할 경우, 그들은 액체 배지에서 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 집합하여 3차원 네트워크(무정형 구조)를 형성한다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물은 금속 양이온, 예를 들면, 2가 금속 양이온(칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온 및 구리 이온 등), 바람직하게는 칼슘 이온을 함유한다. 2종 이상의 금속 양이온, 예를 들면, 칼슘 이온과 마그네슘 이온, 칼슘 이온과 아연 이온, 칼슘 이온과 철 이온, 칼슘 이온과 구리 이온을 조합하여 사용할 수 있다. 당업자는 조합을 적절하게 결정할 수 있다. 본 발명의 배지 조성물 중의 금속 양이온 농도는 0.1mM 내지 300mM, 바람직하게는 0.5mM 내지 100mM이지만, 이에 제한되지 않는다. 금속 양이온은 배지와 혼합될 수 있거나, 염 용액을 별도로 제조하여 배지에 첨가할 수 있다.
피펫팅, 필터 여과 등에 의한 전단력에 의한 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 상실은 가역적 반응이다. 전단력에 의해 파괴된 3차원 네트워크(무정형 구조)의 단편은 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 다시 집합하여 3차원 네트워크(무정형 구조)를 재생한다.
본 발명의 배지 조성물은 세포 또는 조직을 배양하는 데 사용되는 배지(바람직하게는 액체 배지)와 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 혼합함으로써 제조할 수 있다.
동물(예: 포유동물) 유래의 세포 또는 조직을 배양하는 데 사용되는 배지의 예로는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles's Medium; DMEM), hamF12 배지(햄의 영양소 혼합물 F12), DMEM/F12 배지, 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A medium), 이글 MEM 배지(이글 최소 필수 배지; EMEM), αMEM 배지(알파 변형된 이글 최소 필수 배지; αMEM), MEM 배지(최소 필수 배지), RPMI1640 배지, 이스코베 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM), MCDB131 배지, 윌리엄 배지 E, IPL41 배지, 피셔 배지, StemPro34(제조원: 인비트로겐), X-VIVO 10(제조원: 캠브렉스 코포레이션), X-VIVO 15(제조원: 캠브렉스 코포레이션), HPGM(제조원: 캠브렉스 코포레이션), StemSpan H3000(제조원: 스템셀 테크놀로지스), StemSpanSFEM(제조원: 스템셀 테크놀로지스), StemlineII(제조원: 시그마 알드리치), QBSF-60(제조원: 퀄리티바이올로지컬), StemPro hESC SFM(제조원: 인비트로겐), mTeSR1 또는 2 배지(제조원: 스템셀 테크놀로지스), Sf-900II(제조원: 인비 트로겐), Opti-Pro(제조원: 인비트로겐) 등을 포함한다.
세포 또는 조직이 식물로부터 유래되는 경우, 식물 조직의 배양용으로 일반적으로 사용되는 무라시게 스쿠그(MS) 배지, 린즈마이어 스쿠그(LS) 배지, 화이트 배지, 갬보그 B5 배지, 닛체 배지, 헬러 배지, 모렐 배지 등의 기본 배지 또는 이러한 배지 성분이 최적 농도로 변형된 변형 배지(예: 절반 농도의 암모니아 질소 등)에 옥신 및 필요에 따라 사이토키닌 등의 식물 생장 조절 물질(식물 호르몬)을 적당한 농도로 첨가하여 수득된 배지를 배지로 들 수 있다. 이 배지는 필요에 따라 카제인 분해 효소, 옥수수 침지액, 비타민 등으로 추가로 보충될 수 있다. 옥신류의 예로는 3-인돌아세트산(IAA), 3-인돌부티르산(IBA), 1-나프탈렌아세트산(NAA), 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 옥신은 약 0.1 내지 약 10ppm의 농도로 배지에 첨가될 수 있다. 사이토키닌의 예로는 키네틴, 벤질아데닌(BA), 제아틴 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 사이토키닌은 약 0.1 내지 약 10ppm의 농도로 배지에 첨가될 수 있다.
당업자는 상기 목적에 따라 상기한 배지에 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인, 염소, 각종 아미노산, 각종 비타민, 항생제, 혈청, 지방산, 당 등을 자유롭게 첨가할 수 있다. 동물 유래 세포 및/또는 조직의 배양을 위해, 당업자는 또한 상기 목적에 따라 한 종류 이상의 다른 화학적 성분 및 생체 물질을 조합하여 첨가할 수 있다. 동물 유래 세포 및/또는 조직용 배지에 첨가되는 성분의 예는 소 태아 혈청, 인간 혈청, 말 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 에탄올아민, 아셀렌산나트륨, 모노티오글리세롤, 2-머캅토에탄올, 소 혈청 알부민, 나트륨 피루베이트, 폴리에틸렌 글리콜, 각종 비타민, 각종 아미노산, 한천, 아가로스, 콜라겐, 메틸셀룰로스, 각종 사이토카인, 각종 호르몬, 각종 성장 인자, 각종 세포외 매트릭스, 각종 세포 접착 분자 등을 포함한다. 배지에 첨가되는 사이토카인의 예는 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-9(IL-9), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-11(IL-11), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-14(IL-14), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-18(IL-18), 인터류킨-21(IL-21), 인터페론-α(IFN-α), 인터페론-β(IFN-β), 인터페론-γ(IFN-γ), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 단구 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 줄기 세포 인자(SCF), flk2/flt3 리간드(FL), 백혈병 세포 억제 인자(LIF), 온코스타틴 M(OM), 에리트로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
배지에 첨가되는 호르몬의 예로는 멜라토닌, 세로토닌, 티록신, 트리요오도 티로닌, 에피네프린, 노르에피네프린, 도파민, 항뮐러관 호르몬, 아디포넥틴, 부 신피질 자극 호르몬, 안지오텐시노겐 및 안지오텐신, 항이뇨 호르몬, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 에리트로포이에틴, 난포 자극 호르몬, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 생식샘 자극 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 인간 융모성 생식샘 자극 호르몬, 인간 태반 락토겐, 성장 호르몬, 인히빈, 인슐린, 인슐린형 성장 인자, 렙틴, 황체 형성 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, 프로락틴, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬, 코르티솔, 알도스테론, 테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 안드로 스테네디온, 디하이드로테스토스테론, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 프로게스테론, 칼시트리올, 칼시디올, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 프로스타사이클린, 트롬복산, 프로락틴 방출 호르몬, 리포트로핀, 뇌 나트륨 이뇨 펩티드, 신경 펩티드 Y, 히스타민, 엔도텔린, 췌장 폴리펩티드, 렌닌 및 엔케팔린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
배지에 첨가되는 성장 인자의 예는 형질전환 성장 인자-α(TGF-α), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 대식세포 염증 단백질-1α(MIP-1α), 상피 세포 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9(FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), 신경 세포 증식 인자(NGF), 간세포 성장 인자(HGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 프로테아제 넥신 I, 프로테아제 넥신 II, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 콜린성 분화 인자(CDF), 케모카인, 노치 리간드(델타1 등), Wnt 단백질, 안지오포이에틴형 단백질 2, 3, 5 또는 7(Angpt2, 3, 5, 7), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-1(IGFBP), 플레이오트로핀(Pleiotrophin) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 유전자 재조합 기술에 의해 인공적으로 변경된 아미노산 서열을 갖는 이러한 사이토카인 및 성장 인자를 또한 첨가할 수 있다. 이의 예는 IL-6/가용성 IL-6 수용체 복합체 또는 Hyper IL-6(IL-6 및 가용성 IL-6 수용체의 융합 단백질) 등을 포함한다.
각종 세포외 매트릭스 및 각종 세포 접착 분자의 예는 콜라겐 I 내지 XIX, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌-1 내지 12, 니토겐, 테나신, 트롬보스폰딘, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 오스테오폰틴, 피브리노겐, 각종 엘라스틴, 각종 프로테오글리칸, 각종 카드헤린, 데스모코린, 데스모글레인, 각종 인테그린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 면역글로불린 슈퍼패밀리, 마트리겔, 폴리-D-라이신, 폴리-L-라이신, 키틴, 키토산, 세파로스, 히알루론산, 알기네이트 겔, 각종 하이드로겔, 이의 절단 단편 등을 포함한다.
배지에 첨가되는 항생제의 예는 설폰아미드, 페니실린, 펜에티실린, 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 나프실린, 암피실린, 페니실린, 아목시실린, 시클라실린, 카베니실린, 티카실린, 피페라실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 메실리남, 안디노실린, 세팔로스포린 및 이의 유도체, 옥솔린산, 아미플록사신, 테마플록사신, 날리딕스산, 피로미드산, 시프로플록사신, 시녹사신, 노르플록사신, 퍼플록사신, 로삭사신, 오플록사신, 에녹사신, 피페미드산, 설박탐, 클라불란산, β-브로모페니실란산, β-클로로페니실란산, 6-아세틸메틸렌-페니실란산, 세폭사졸, 설탐피실린, 아디노시린 및 설박탐 포름알데히드 후드레이트 에스테르, 타조박탐, 아즈트레오남, 설파제틴, 이소설파제틴, 노르카디신, m-카복시페닐, 페닐아세트아미도포스폰산 메틸, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린 및 미노사이클린을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 배지(바람직하게는 액체 배지)는 금속 양이온, 예를 들면, 2가 금속 양이온(칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온 및 구리 이온 등), 바람직하게는 칼슘 이온을 함유한다. 이는 액체 배지와 혼합시 액체 배지에서 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 3차원 네트워크(무정형 구조)를 형성하는 것을 목적으로 한다. 배지 중 금속 양이온(바람직하게는 칼슘 이온)의 농도는 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 상기 금속 양이온을 통해 집합시키고 3차원 네트워크(무정형 구조)를 형성하기에 충분한 농도이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 이는 0.1mM 내지 300mM, 바람직하게는 0.5mM 내지 100mM이다. 금속 양이온을 함유하는 배지와 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 혼합할 수 있고, 또는 금속 양이온을 함유하지 않는 배지와 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 혼합하고, 그 후에 별도로 제조된 금속 양이온의 수용액을 혼합물에 첨가할 수 있다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 상기 배지에 첨가하는 경우에, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 먼저 적절한 용매(배지 첨가제임)에 용해시키거나 분산시킨다. 그 후에, 배지 조성물 중의 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 최종 농도가 위에 상세히 기재된 농도에 속하도록 배지 첨가제를 배지에 첨가한다. 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염을 함유하는 배지 첨가제와 알긴산 또는 이의 염을 함유하는 배지 첨가제를 별도로 제조할 수 있고, 각각을 배지에 첨가할 수 있거나, 또는 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염, 및 알긴산 또는 이의 염을 모두 함유하는 배지 첨가제(즉, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 혼합물)를 제조하여 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 모두 함유하는 배지 첨가제(즉, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 혼합물)를 제조하여, 배지에 첨가할 수 있다.
여기서, 배지 첨가제의 제조에 사용되는 적절한 용매의 예로는 물, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 각종 알콜(예: 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜 등) 등과 같은 수성 용매를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이 경우에, 배지 첨가제 중의 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 농도는 바람직하게는, 예를 들면, 위에 상세히 기재된 배지 조성물의 최종 농도의 약 10배 내지 500배, 바람직하게는 약 25배 내지 100배 농도이다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염은 필요에 따라 멸균될 수 있다. 멸균 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 방사선 멸균, 에틸렌 옥사이드 가스 멸균, 고압 증기 멸균(오토클레이브 멸균), 필터 멸균 등을 들 수 있다. 필터 멸균(이후, 종종 여과 멸균이라고도 함)이 수행될 경우, 필터 부분의 재료는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 유리 섬유, 나일론, PES(폴리에테르설폰), 친수성 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드), 셀룰로스 혼합 에스테르, 셀룰로스아세테이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 등을 들 수 있다. 필터의 기공 크기는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.1㎛ 내지 10㎛, 보다 바람직하게는 0.1㎛ 내지 1㎛, 가장 바람직하게는 0.1㎛ 내지 0.5㎛이다. 이러한 멸균 처리는 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염이 고체 상태로 존재하거나 용액 상태로 존재하는지의 여부와 관계없이 적용될 수 있다.
고압 증기 멸균 처리 온도는 일반적으로 105 내지 135℃, 바람직하게는 115℃ 내지 130℃, 보다 바람직하게는 118 내지 123℃(예: 121±1℃)이다. 멸균 처리 압력은 일반적으로 0.12 내지 0.32MPa, 바람직하게는 0.17 내지 0.27MPa, 보다 바람직하게는 0.19 내지 0.23MPa(예: 0.21±0.1MPa)이다. 멸균 처리 시간은 일반적으로 1 내지 60분, 바람직하게는 5 내지 45분, 보다 바람직하게는 15 내지 25분(예: 20±1분)이다.
고압 증기 멸균 처리 조건의 조합은, 예를 들면, 105 내지 135℃, 0.12 내지 0.32MPa, 1 내지 60분; 바람직하게는 115℃ 내지 130℃, 0.17 내지 0.27MPa, 5 내지 45분; 보다 바람직하게는 118 내지 123℃(예: 121±1℃), 0.19 내지 0.23MPa(예: 0.21±0.1MPa), 15 내지 25분(예: 20±1분)이다.
상기 제조에서 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 용액 또는 분산액을 액체 배지에 첨가함으로써, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염은 액체 배지에서 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 집합하고, 이에 의해 3차원 네트워크(무정형 구조)가 형성되고, 본 발명의 배지 조성물을 수득할 수 있다. 배지는 일반적으로 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합를 생성하여 3차원 네트워크(무정형 구조)를 형성하기에 충분한 농도로 금속 양이온(예: 칼슘 이온)을 함유한다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물은 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염 또는 이의 분산액을 액체 배지에 간단히 첨가하여 수득할 수 있다. 또는, 배지를 본 발명의 배지 첨가제(탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 용액 또는 분산액)에 첨가할 수 있다. 또한, 본 발명의 배지 조성물은 또한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염 및 배지 성분(분말 배지 및 농축 배지)를 수성 용매(예: 이온 교환 수, 초순수 등을 포함하는 물)에서 혼합함으로써 제조할 수 있다. 혼합의 구현예의 예로는 (1) 액체 배지와 배지 첨가제(용액)를 혼합하는 단계, (2) 액체 배지에 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 고체(분말 등)를 첨가하는 단계, (3) 배지 첨가제(용액)와 분말 배지를 혼합하는 단계, (4) 분말 배지와 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 고체(분말 등)를 수성 용매와 혼합하는 단계 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 배지 조성물에서 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 분포가 불균일하게 되는 것을 방지하기 위해, (1)의 구현예가 바람직하다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 용매(예: 물, 액체 배지 등의 수성 용매)에 용해시키거나 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염, 및 분말 배지를 용매에 용해시킬 때, 혼합물을 가열하여 용해를 촉진시킬 수 있다. 가열 온도의 예는 80℃ 내지 130℃, 바람직하게는 가열 멸균이 수행되는 100℃ 내지 125℃(예: 121℃)를 포함한다. 가열 후, 수득된 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 용액을 실온으로 냉각시킨다. 상기 용액에 상기 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 첨가함으로써(예를 들면, 상기 용액을 액체 배지에 첨가함으로써), 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염이 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 집합하여 3차원 네트워크(무정형 구조)을 형성하고, 본 발명의 배지 조성물을 수득할 수 있다. 또는, 3차원 네트워크(무정형 구조)는 또한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 가열하면서(예: 80℃ 내지 130℃, 바람직하게는 100℃ 내지 125℃(예: 121℃)) 상기 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 함유하는 용매(예: 물, 액체 배지 등의 수성 용매)에 용해시키고, 수득된 용액을 실온으로 냉각시킴으로써 형성될 수 있다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염은 비교적 선형 구조를 갖는 구성 단위를 갖고, 용매(예: 물)에 첨가될 때 복수의 당 쇄가 번들화되고, 용이하게 용해되지 않는다. 그러나, 알긴산 또는 이의 염을 첨가하면, α1-4 결합된 L-글루쿠론산과 β1-4 결합된 D-만누론산의 두 우론산을 포함하는 비교적 벌키한 구조로 인해 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 번들화가 억제되고, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염은 비교적 쉽게 용해된다. 따라서, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염은 가열하지 않고 비교적 저온(예: 0 내지 37℃, 바람직하게는 10 내지 30℃)에서 용매(예: 물, 액체 배지 등과 같은 수성 용매)에 용해시킬 수 있다.
본 발명의 배지 조성물의 생산 방법의 예는 이하 제시되고, 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 이온 교환 수 또는 초순수에 첨가한다. 이어서, 그들을 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 용해시킬 수 있는 온도(예: 5 내지 60℃, 바람직하게는 5 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 10 내지 30℃)에서 교반하여 투명한 상태로 용해시킨다.
용해시킨 후, 혼합물을 필요에 따라 교반하면서 냉각시키고, 멸균시킨다(예: 121℃에서 20분 동안 오토클레이브 멸균, 필터 여과). 상기한 멸균된 수용액을 교반하면서(예: 호모믹서 등) 정치 배양에 사용되는 소정의 배지에 첨가하여 당해 용액을 배지와 균일하게 혼합한다. 수용액과 배지의 혼합 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 피펫팅 등의 수동 혼합, 또는 자기 교반기, 기계적 교반기, 호모믹서 및 균질화기와 같은 장비를 이용한 혼합일 수 있다.
액체 배지에서 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 균일한 분산을 위해, 예를 들면, 액체 배지를 원뿔 관에 위치시키고, 와동 등에 의해 교반을 유지시키고, 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 수용액을 주사기 바늘을 장착한 주사기를 사용하여 액체 배지로 격렬하게 플러슁한다. 배지 제조 키트(닛산 케미칼 인더스트리즈 FCeMTM-시리즈 제조 키트)를 이용하여, 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)가 균일하게 분산된 본 발명의 배지 조성물을 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 혼합 후 필터를 통해 여과할 수 있다. 여과 처리에 사용되는 필터의 기공 크기는 5㎛ 내지 100㎛, 바람직하게는 5㎛ 내지 70㎛, 보다 바람직하게는 10㎛ 내지 70㎛이다.
세포 또는 조직의 배양 방법
본 발명은 상기한 본 발명의 배지 조성물에서 세포 또는 조직을 배양하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 배양 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 배양 방법 등에 의해 수득되는 본 발명의 배지 조성물 및 세포 또는 조직을 함유하는 배양 제제를 제공한다. 배양 제제는 세포 또는 조직을 배양하여 수득되는 생성되는 생성물을 의미하고, 세포 또는 조직, 배지(배지 조성물) 및, 일부 경우에, 세포 분비 성분 등을 함유한다.
본 발명의 배지 조성물은 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)를 함유한다. 세포 또는 조직이 본 발명의 배지 조성물에서 배양되는 경우, 배지 조성물에 부유된 세포 또는 조직은 3차원 네트워크에 포획되어 침강물을 형성하지 않는다. 따라서, 세포 또는 조직은 진탕, 회전 조작 등을 필요로 하지 않고 부유된 상태로 균일하게 분산된 채로 배양할 수 있다(정치 부유 배양). 따라서, 본 발명의 배양 방법은 세포 또는 조직의 부유 배양 방법(바람직하게는, 정치 부유 배양)일 수 있다.
상술한 바와 같이, 피펫팅, 필터 여과 등에 의한 전단력에 의해 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 상실은 가역적 반응이다. 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)가, 세포 또는 조직이 본 발명의 배지 조성물 중에 부유되는 부유 배양 개시시에 피펫팅, 필터 여과 등에 의한 전단력에 의해 파괴된 경우에도, 배양물을 정치시키면, 파괴된 3차원 네트워크(무정형 구조)의 단편은 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통해 다시 집합하여 3차원 네트워크(무정형 구조)를 재생하여 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 다시 제공한다. 따라서, 분산된 세포 또는 조직을 연속적으로 정치 부유 배양시킬 수 있다.
정치 부유 배양에서 세포 또는 조직의 부유 기간은 5분 이상(예: 적어도 5 내지 60분), 1시간 이상(예: 1시간 내지 24시간), 24시간 이상(예: 1일 내지 21일), 48시간 이상, 7일 이상 등이다. 이들 기간은 부유 상태가 유지되는 한 제한되지 않는다.
세포 또는 조직을 본 발명의 배지 조성물에서 배양할 때, 별도로 제조된 세포 또는 조직을 본 발명의 배양 조성물에 첨가하고, 혼합하여 균일한 분산액을 수득한다. 이 경우에, 혼합 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 피펫팅 등을 사용하는 수동 혼합, 교반기, 와동 믹서, 마이크로플레이트 믹서, 진탕기 등의 장비를 이용하는 혼합을 들 수 있다. 혼합 후, 배양 배지는 정치시킬 수 있거나, 배양 배지는 필요에 따라 회전시키거나, 진탕시키거나 교반할 수 있다. 회전 속도 및 빈도는 당업자의 목적에 따라 적합하게 설정할 수 있다.
정치 배양 기간 동안 배지 조성물의 교환이 필요할 때, 세포 또는 조직 및 배지 조성물은 원심분리 또는 여과 처리로 분리하고, 세포 또는 조직을 회수하고, 본 발명의 새로운 배지 조성물을 회수된 세포 또는 조직에 첨가할 수 있다. 또는, 세포 또는 조직을 원심분리 또는 여과 처리로 적절하게 농축시키고, 새로운 배지 조성물을 농축된 액체에 첨가할 수 있다. 예를 들면, 비제한적으로, 원심분리의 중력 가속도(G)는 10G 내지 400G이고, 여과 처리에 사용되는 필터의 기공 크기는 10㎛ 내지 100㎛이다. 또한, 표면 상에서 목적 세포에 특이적으로 결합하는 항체로 코팅된 자성 미립자를 사용하여, 배양된 세포 및/또는 조직을 자기력에 의해 분리할 수 있다. 이러한 자성 미립자의 예로는 다이나비드(제조원: 베리타스 리미티드), MACS 마이크로비드(제조원: 밀테니 바이오테크), BioMag(제조원: 테크노 케미컬스 코포레이션) 등을 포함한다. 세포 또는 조직은 세포 또는 조직을 회수하기 위한 후술하는 본 발명의 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 이외에, 알긴산 또는 이의 염을 함유하는 본 발명의 배지 조성물은 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 제공하고, 필요에 따라, 킬레이트제를 첨가하고 피펫팅, 필터 여과 등에 의해 전단력을 적용함으로써 상기 효과를 신속하게 상실하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 세포 및 조직을 부유 배양할 수 있고(바람직하게는 정치 부유 배양), 세포는 수득된 배양 제제로부터 원심분리 조작에 의해 높은 수율로 회수되고, 세포의 손실을 억제하면서 높은 효율로 계대시킬 수 있다.
세포 또는 조직이 배양되는 온도는 동물 세포의 경우 일반적으로 25 내지 39℃, 바람직하게는 33 내지 39℃이다. CO2 농도는 배양 대기에서 일반적으로 4 내지 10용적%이며, 4 내지 6용적%가 바람직하다. 배양 기간은 일반적으로 배양 목적에 따라 자유롭게 설정될 수 있는 3 내지 35일이다. 식물 세포의 배양 온도는 일반적으로 20 내지 30℃이고, 빛이 필요한 경우, 그들은 조도 2000 내지 8000럭스의 조도 조건하에 배양할 수 있다. 배양 기간은 일반적으로 배양 목적에 따라 자유롭게 설정될 수 있는 3 내지 70일이다.
본 발명의 배양 방법에서, 세포 및 조직 배양에 일반적으로 사용되는 배양 도구, 예를 들면, 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 테플론(등록 상표) 백, 접시, 샬레, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 병 등이 사용될 수 있다.
세포 및/또는 조직은 또한 기계적인 통제하에 폐쇄 환경에서 pH, 온도, 산소 농도 등을 제어하면서 세포 접종, 배지 교환, 세포 이미지 포획, 및 배양 세포의 회수를 자동적으로 실행하고 고밀도로 배양할 수 있는 생물 반응기 및 자동 배양 장치를 사용하여 배양할 수 있다. 이러한 장치를 이용하는 배양 도중에 새로운 배지를 공급하고 필요한 물질을 세포 및/또는 조직에 공급하는 방법으로서, 공급-배치 배양, 연속 배양 및 관류 배양이 이용 가능하고, 모든 이러한 방법이 본 발명의 배양 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에서 배양되는 세포 또는 조직의 형태 및 상태는 당업자가 자유롭게 선택할 수 있다. 이의 특이한 바람직한 예는, 특별히 제한되지는 않지만, 세포 또는 조직이 배지 조성물에 단독으로 분산된 상태, 세포 또는 조직이 담체 표면에 접착된 상태, 세포 또는 조직이 담체 내부에 매립된 상태, 복수 개의 세포가 집합하여 세포 응집체(구)를 형성하는 상태, 또는 2종 이상의 세포가 집합하여 세포 응집체(구)를 형성하는 상태 등을 포함한다. 이러한 상태 중에서, 세포 응집체(구)를 형성하는 상태는, 생체내 환경에서의 것들과 가까운 세포-세포 상호작용 및 세포 구조가 재작제되고, 장기간 배양이 세포 기능을 유지하면서 수행될 수 있고, 또한 세포의 회수가 비교적 용이하기 때문에, 본 발명의 배양 방법으로 배양되는 바람직한 상태로서 언급될 수 있다.
세포 및/또는 조직을 표면에 지지하는 담체로서, 다양한 중합체로 구성된 미세담체, 유리 비드, 세라믹 비드 등을 들 수 있다. 담체의 직경은 수십 ㎛ 내지 수백 ㎛, 보다 바람직하게는 100㎛ 내지 200㎛이고, 이의 비중은 바람직하게는 1에 가깝고, 보다 바람직하게는 0.9 내지 1.2, 특히 바람직하게는 약 1.0이다. 세포 또는 조직을 표면에 지지하는 담체는 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 진탕 등의 작업이 없는 경우에도 균일하게 분산할 수 있게 한다. 그 결과, 목적 세포 또는 조직은 세포 기능의 손실없이 배양할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 배양된 세포 또는 조직은 세포 또는 조직이 배양 후 담체에 의해 지지되는 동안 원심분리 및 여과 처리를 수행함으로써 채취될 수 있다. 본 방법에 의해 배양된 세포 또는 조직은 각종 킬레이트제, 열처리 또는 효소를 이용하여 담체로부터 제거함으로써 채취될 수 있다.
세포 또는 조직을 담체 내부에 매립시킬 경우, 각종 중합체로 구성된 재료를 담체로서 선택할 수 있다. 본 발명의 배지 조성물을 사용하면 내부에 매립된 세포 또는 조직을 갖는 담체가 교반 등의 작업 없이도 균일하게 분산되게 한다. 그 결과, 목적 세포 또는 조직은 세포 기능의 손실없이 배양할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은 세포 및/또는 조직이 배양 후 담체에 매립되는 동안 원심분리 및 여과 처리를 수행하여 채취할 수 있다. 본 방법에 의해 배양된 세포 또는 조직은 각종 킬레이트제, 열 또는 효소 등을 사용하는 처리로 담체를 분해하여 그들을 분산시킴으로써 채취할 수 있다.
세포 응집체(구)를 형성하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 이의 예는 세포 비접착성 표면을 갖는 용기를 이용하는 방법, 행잉 드롭 법, 선회 배양법, 3차원 스캐폴드 법, 원심분리법, 전기장 또는 자기장에 의한 응집을 이용한 방법 등을 포함한다. 더욱이, 구는 또한 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 목적 세포는 본 발명의 배지 조성물에 단일 세포 상태로 균일하게 분산시키고, 배양하고, 3일 내지 10일 동안 정치시켜 증식시키고, 이에 의해 세포의 구를 제조할 수 있다. 구는 본 발명의 배지 조성물에서 연속 정치 부유 배양에 의해 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 동안 증식 능력을 유지시킬 수 있다. 정치 부유 배양 동안 기계적 분할 또는 단일 세포 형성 처리 및 응고를 규칙적으로 추가로 실시함으로써, 증식 능력은 실질적으로 무한정 유지될 수 있다. 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 진탕 등의 작업 없이도 배지 중 균일한 분산액이 제공될 수 있다. 그 결과, 목적 세포는 세포 기능의 손실 없이 구로서 배양될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 세포 또는 조직을 부유시키는 효과를 제공한다. 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 단층 배양과 비교하여 소정의 용적당 보다 증가된 양의 세포 또는 조직을 배양할 수 있다. 회전 또는 진탕 작업을 수반하는 종래의 부유 배양 방법에서, 세포 또는 조직의 증식율 및 회수율은 낮아질 수 있거나, 전단력이 세포 또는 조직에 작용하기 때문에 세포의 기능은 손상될 수 있다. 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 세포 또는 조직이 진탕 등의 작업 없이 배지 조성물에 균일하게 분산될 수 있고, 목적 세포 및/또는 조직은 세포 기능의 손실 없이 다량으로 쉽게 수득할 수 있다. 또한, 세포 또는 조직을 종래의 겔 배지에서 부유 배양하면 세포 또는 조직의 관찰 및 회수가 종종 곤란하고, 이의 기능은 종종 회수 동안 손상된다. 그러나, 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 세포 또는 조직을 부유 배양하고 이의 기능을 손상시키지 않고 관찰하고 회수할 수 있다. 또한, 통상적인 겔 배지는 종종 배지의 교환을 어렵게 하는 고점도를 나타낸다. 그러나, 본 발명의 배지 조성물이 저점도를 갖기 때문에, 피펫, 펌프 등을 이용하여 쉽게 교환할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 이외에 소정량의 알긴산 또는 이의 염을 함유한다. 알긴산 또는 이의 염은 탈아실화 젤란 검의 번들화를 억제한다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 알긴산 또는 이의 염을 포함하지 않고 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염을 함유하는 부유 배양용 대조군 배지 조성물을 사용한 경우와 비교하여, 정치 배양 동안 세포 또는 조직을 부유시키는 동등한 특성이 유지되고, 그 특성은 필요에 따라 킬레이트제를 첨가하여 전단력을 적용하는 작업에 의해 신속하게 손실되고, 원심분리 작업에 의한 세포 회수율은 비약적으로 증가하고, 따라서 계대 동안 세포의 손실이 최소화될 수 있다.
세포 또는 조직은 본 발명의 배양 방법을 사용하여 효율적으로 증식시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 배지 조성물은 세포 연구용 시약으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포 및 조직의 분화와 증식을 조절하는 인자가 설명되는 경우, 세포 및 목적인자를 공배양하고, 세포의 수 및 종류, 및 세포 표면 분화 마커 또는 발현된 유전자의 변화를 분석한다. 이 경우에, 본 발명의 배지 조성물을 이용하면 분석 표적 세포의 수가 효율적으로 증폭될뿐만 아니라 또한 효율적으로 회수될 수 있다.
세포 또는 조직의 단리 방법
본 발명은 상기한 본 발명의 배지 조성물 및 세포 또는 조직을 함유하는 세포 또는 조직의 배양 제제로부터 세포 또는 조직을 효율적으로 단리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 단리 방법은 배양 제제에 전단력을 특징적으로 적용한다.
상술한 바와 같이, 3차원 네트워크(무정형 구조)는 본 발명의 배지 조성물에서 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된다. 세포 또는 조직이 본 발명의 배지 조성물에서 배양되는 경우, 배지 조성물에 부유된 세포 또는 조직은 3차원 네트워크에 포획되어 침강물을 형성하지 않는다. 따라서, 세포 또는 조직은 진탕, 회전 조작 등을 필요로 하지 않고 부유된 상태로 균일하게 분산된 채로 배양될 수 있다(정치 부유 배양). 한편, 알긴산 또는 이의 염을 함유하는 3차원 네트워크는 전단력에 취약하고, 킬레이트제가 필요에 따라 본 발명의 배지 조성물 및 세포 또는 조직을 함유하는 세포 또는 조직의 배양 제제에 첨가되고, 3차원 네트워크를 파괴하기에 충분한 전단력이 이에 적용되는 경우, 3차원 네트워크를 기반으로 하는 세포 또는 조직을 부유시키는 특성이 신속하게 손실되고, 세포 또는 조직은 중력으로 인해 쉽게 침강물을 형성한다. 이러한 상태에서 배양 제제가 원심분리되면, 이에 함유된 세포 또는 조직은 쉽게 침강물을 형성하고, 세포 또는 조직은 상청액에서 배지 조성물을 제거하여 단리시킬 수 있다.
　배양 제제에 전단력을 적용하는 작업은 금속 양이온(예: 칼슘 이온 등과 같은 2가 금속 양이온)을 통한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염의 집합에 의해 형성된 3차원 네트워크(무정형 구조)가 파괴될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 피펫팅, 필터 여과, 교반, 초음파 처리 등을 들 수 있다.
배양 제제에 충분한 전단력을 적용하기 위해, 피펫팅은 바람직하게는 비교적 얇은 팁을 갖는 피펫(팁의 내경은, 예를 들면, 5mm 이하, 바람직하게는 0.1 내지 3.0mm, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2.0mm이다)을 사용하여 수행된다.
배양 제제를 전체로 신속하게 교반하기 위해, 예를 들면, 배양 제제의 용적의 1% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상, 더욱 더 바람직하게는 50% 이상을 한 번의 작업으로 흡입 및 방출하는 것이 바람직하다.
배양 제제에 충분한 전단력을 적용하기 위해, 예를 들면, 1ml/초 이상, 바람직하게는 2 내지 20ml/초, 보다 바람직하게는 5 내지 10ml/초의 유속으로 흡입 및/또는 방출 작업을 수행하는 것이 바람직하다.
피펫팅의 횟수는 상기 3차원 네트워크를 파괴하는 데 충분하다면 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, 피펫팅은 1회 이상, 바람직하게는 3회 이상, 보다 바람직하게는 5회 이상 연속 수행된다. 피펫팅 횟수가 많을수록, 상기 3차원 네트워크가 보다 확실하게 파괴되고, 더 높은 수치가 바람직하다. 이의 이론적인 상한치는 없다. 그러나, 피펫팅의 횟수가 너무 많으면 세포 또는 조직의 생존율은 감소한다. 따라서, 횟수는 바람직하게는 일반적으로 50회 이하, 바람직하게는 20회 이하, 보다 바람직하게는 15회 이하로 설정된다. 피펫팅의 횟수는 일반적으로 1 내지 50회, 바람직하게는 3 내지 20회, 보다 바람직하게는 5 내지 15회이다.
필터의 미세한 기공의 크기(기공 크기)는 상기 3차원 네트워크를 파괴할 수 있는 범위내이면 특별히 제한되지 않는다. 이는 일반적으로 500㎛ 이하, 바람직하게는 200㎛ 이하, 보다 바람직하게는 100㎛ 이하이다. 기공 크기가 작을수록, 더 강한 전단력이 배양 제제에 작용하고 더 확실하게 상기 3차원 네트워크가 파괴된다. 그것이 너무 작으면, 배지 조성물은 필터를 쉽게 통과할 수 없다. 따라서, 필터의 미세한 기공의 크기(기공 크기)는 일반적으로 5㎛ 이상, 바람직하게는 10㎛ 이상, 보다 바람직하게는 20㎛ 이상, 더욱 바람직하게는 40㎛ 이상이다.
필터의 기공 직경은 바람직하게는 배양 제제에서 세포 또는 조직이 통과할 수 있게 하는 것이다. 여기서, "세포 또는 조직이 통과할 수 있게 하는 크기"는 생존을 유지하면서 세포 또는 조직이 통과할 수 있게 하는 크기를 의미한다. 예를 들면, "세포 또는 조직이 통과할 수 있게 하는 크기"는 필터의 기공 직경이 배양되는 세포 또는 조직의 직경보다 큰 경우뿐만 아니라 배양 제제 중의 세포 응집체, 구 또는 조직이 그 직경보다 더 작은 기공 직경을 갖는 필터를 통과함으로써 생존을 유지하면서 복수의 세포, 세포 응집체, 구 또는 조직으로 분할되는 구현예도 포함한다. 세포의 크기는 세포의 종류에 의존하기 때문에 일률적으로 규정할 수 없지만, 약 7.5 내지 20㎛의 직경을 갖는 일반적인 세포는 단일 세포 상태에서 20㎛ 이상, 바람직하게는 40㎛의 기공 직경을 갖는 필터를 양호한 생존성을 유지하면서 쉽게 통과할 수 있다. 따라서, 세포 또는 조직의 양호한 생존성을 유지하면서 상기 3차원 네트워크를 효율적으로 파괴하기 위해, 필터의 기공 크기는, 예를 들면, 20 내지 200㎛, 바람직하게는 40 내지 100㎛이다.
필터 재료의 예는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드(나일론), 폴리설폰, 폴리프로필렌, 아크릴, 폴리락트산, 셀룰로스 혼합 에스테르, 폴리카보네이트, 폴리에스테르, 유리 등을 포함하지만, 이에 특별히 제한되지 않는다. 극성, 대전 성, 친수성 등의 특성은 재료에 따라 다르지만, 이러한 특성과 회수율의 상관성은 약하고, 사용되는 재료와 무관하게 양호한 회수율이 기대된다. 폴리아미드(나일론), 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 유리 등이 용이한 이용 가능성 등의 관점에서 바람직하다.
이러한 필터로서, 시판되는 제품이 사용될 수 있고, 이의 구체적인 예는 Partec에 의해 제조된 CellTrics 필터(상표): 기공 직경 5㎛(모델 번호 06-04-004-2323), 10㎛(모델 번호 06-04-004-2324), 20㎛(모델 번호 06-04-004-2325), 30㎛(모델 번호 06-04-004-2326), 50㎛(모델 번호 06-04-004-2327), 100㎛(모델 번호 06-04-004-2328) 및 150㎛(모델 번호 06-04-004-2329), 벡톤 딕킨슨 앤드 캄파니에 의해 제조된 Cell Strainer(상표): 기공 직경 40㎛(모델 번호 352340), 70㎛(모델 번호 352350) 및 100㎛(모델 번호 352360), AS ONE에 의해 제조된 Filcon S(상표): 기공 직경 20㎛(모델 번호 2-7211-01), 30㎛(모델 번호 2-7211-02), 50㎛(모델 번호 2-7211-03), 70㎛(모델 번호 2-7211-04), 100㎛(모델 번호 2-7211-05) 및 200㎛(모델 번호 2-7211-06) 등을 포함한다.
필터를 통한 통과 횟수는 1회일 수 있지만, 필요에 따라 여러 번 필터를 통해 통과시켜 세포 또는 조직의 회수율을 향상시킬 수 있다. 필터를 통한 통과 횟수는 일반적으로 1 내지 10회이다.
필터를 통해 여러 번 통과시키기 위해, 세포 또는 조직의 배양 제제를 단일 필터를 통해 통과시키는 단계 및 통과된 부유물을 채취하는 단계를 포함하는 작업을 여러 번 수행할 수 있고, 또는 세포 또는 조직의 배양 제제를 함께 적층된 복수의 필터 멤브레인(예: 3 내지 5개의 필터 멤브레인)을 함유하는 다중 필터를 통해 통과시킬 수 있다. 다중 적층 필터의 사용이 작업 효율성의 관점에서 유리하다. 필터를 통해 여러 번 통과시키기 위해, 동일한 기공 직경을 갖는 복수의 필터를 사용할 수 있거나, 상이한 기공 직경을 갖는 복수의 필터를 조합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는, 동일한 기공 직경(예: 40 내지 100㎛)을 갖는 복수의 필터(예: 3 내지 5개 필터)를 적층시켜 사용한다.
교반 작업의 예는 와동, 반동에 의한 혼합, 자기 교반기, 패들 등을 포함한다. 와동 속도는, 예를 들면, 200 내지 3,000rpm이다.
전단력이 배양 제제에 적용되는 경우, 필요에 따라 킬레이트제를 상기 배양 제제에 첨가할 수 있다. 킬레이트제를 첨가함으로써, 금속 양이온(바람직하게는 칼슘 이온, 마그네슘 이온 등의 2가 금속 양이온)은 배지 조성물에 함유된 상기 3차원 네트워크에서 제거되고, 3차원 네트워크 중의 금속 양이온을 통한 다당류(탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염) 서로 간의 결합이 느슨해지고, 3차원 네트워크가 부분적으로 파괴되고, 이로 인해 세포 또는 조직의 회수율이 향상될 것으로 기대된다.
킬레이트제는 칼슘 이온, 마그네슘 이온 등의 2가 금속 양이온(바람직하게는 칼슘 이온)과 복합체를 형성할 수 있는 화합물이면 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 시트르산 또는 이의 염(예: 삼나트륨 시트레이트); EDTA 또는 이의 염(예: EDTA2Na, EDTA3Na, EDTA4Na 등의 나트륨 에데테이트); HEDTA3Na 등의 하이드록시 에틸에틸렌디아민 트리아세트산의 염; EGTA 또는 이의 염; 펜테테이트(디에틸렌트리아민 펜타아세트산의 염); 피트산; 에티드론산 등의 포스폰산 및 나트륨 염을 포함하는 이의 염; 나트륨 옥살레이트; 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산 등과 같은 폴리아미노산; 폴리인산나트륨; 메타인산나트륨; 인산; 알라닌; 디하이드록시에틸글리신; 글루콘산; 아스코르브산; 석신산; 타르타르산 등을 포함한다. 세포 또는 조직의 회수율을 향상시키기 위해, 시트르산 또는 이의 염(예: 삼나트륨 시트레이트) 또는 EDTA 또는 이의 염(예: EDTA2Na, EDTA3Na, EDTA4Na 등과 같은 나트륨 에데테이트)이 바람직하다. 2종 이상의 킬레이트제가 혼합물로 사용될 수도 있다. 킬레이트제의 조합은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 시트르산 또는 이의 염(예: 삼나트륨 시트레이트) 및 EDTA 또는 이의 염(예: EDTA2Na, EDTA3Na, EDTA4Na 등과 같은 나트륨 에데테이트)의 조합을 들 수 있다.
킬레이트제의 첨가량은 3차원 네트워크 중의 금속 양이온을 통한 다당류(탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염) 서로간의 결합을 느슨하게 할 수 있는 양이다.
예를 들면, 시트르산 또는 이의 염(예: 삼나트륨 시트레이트)의 경우, 이는 일반적으로 첨가 직후의 최종 농도로서 0.001w/v% 이상, 바람직하게는 0.005w/v% 이상이다. 이론적으로, 상한치는 시트르산 또는 이의 염의 포화 농도이다. 농도가 너무 높으면, 세포 또는 조직의 생존에 미치는 영향이 우려된다. 따라서, 이는 일반적으로 0.2w/v% 이하, 보다 바람직하게는 0.1w/v% 이하이다.
EDTA 또는 이의 염(예: EDTA2Na, EDTA3Na, EDTA4Na 등과 같은 나트륨 에데테이트)의 경우, 일반적으로 첨가 직후의 최종 농도는 0.001w/v% 이상, 바람직하게는 0.005w/v% 이상이다. 이론적으로, 상한치는 EDTA 또는 이의 염의 포화 농도이다. 농도가 너무 높으면, 세포 또는 조직의 생존에 미치는 영향이 우려된다. 따라서, 이는 일반적으로 0.2w/v% 이하, 더욱 바람직하게는 0.1w/v% 이하이다.
상기 배양 제제에 킬레이트제를 첨가한 후, 수득된 혼합물은 바람직하게는 킬레이트제가 균일해지도록 상기 배양 제제에 전단력을 적용하는 작업으로 충분히 교반시킨다.
상기 전처리 단계 후, 세포 또는 조직을 함유하는 생성되는 혼합물을 원심 분리시켜 세포 또는 조직을 침전시키고, 세포 또는 조직 이외의 분획(예: 상청액 중 본 발명의 배지 조성물)을 제거하고, 이에 의해 세포 및/또는 조직이 세포 또는 조직의 배양 제제로부터 최종적으로 단리될 수 있다. 원심분리로 세포 또는 조직을 침전시키는 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 적절한 조건은 세포 또는 조직의 종류에 따라 당업자에 의해 설정될 수 있다. 일반적으로, 세포 또는 조직을 침전시키고, 약 10 내지 400G의 원심력으로 원심분리에 의해 상청액으로부터 분리할 수 있다.
상술한 바와 같이, 피펫팅, 필터 여과 등에 의한 전단력에 의해 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과의 상실은 가역 반응이다. 따라서, 상기한 전처리 공정 후 및 3차원 네트워크(무정형 구조체)의 재생 전에 원심분리를 수행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 원심분리는 상기 전처리 단계 완료 후 60분 이내, 바람직하게는 30분 이내, 보다 바람직하게는 10분 이내에 개시한다.
세포 또는 조직을 단리하기 위한 시약(키트)
발명은 또한 상기 필터를 함유하는, 상기 본 발명의 배지 조성물 및 세포 또는 조직을 함유하는 세포 또는 조직의 배양 제제로부터 세포 또는 조직을 단리하기 위한 시약(키트)을 제공한다.
본 발명의 시약은 상기한 킬레이트제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 시약을 사용함으로써, 세포 또는 조직은 상기한 본 발명의 단리 방법을 수행하여 상기 본 발명의 배지 조성물 및 세포 또는 조직을 함유하는 세포 또는 조직의 배양 제제로부터 쉽게 단리시킬 수 있다. 각 용어의 정의는 상기한 "세포 또는 조직을 단리시키는 방법"에 기재된 바와 같다.
본 발명의 시약은 상기 본 발명의 배지 조성물을 제조하기 위한 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 조합하여 추가로 함유할 수 있다. 이러한 구현예에서 본 발명의 시약을 사용함으로써, 사용자는 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염을 사용하여 상기 본 발명의 배지 조성물을 제조하고, 목적하는 세포 또는 조직을 배지 조성물에서 부유 배양하고, 상기 본 발명의 단리 방법에 의해 수득된 세포 또는 조직의 배양 제제로부터 세포 또는 조직을 단리시킬 수 있다.
탈아실화 젤란 검 또는 이의 염 및 알긴산 또는 이의 염은 본 발명의 시약에 단리된 화합물 또는 수용액으로 함유될 수 있거나, 본 발명의 시약에 상기 본 발명의 배지 조성물의 구현예로 함유될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 배지 조성물의 실시예를 구체적으로 기재함으로써 하기에서 더욱 상세히 설명되지만, 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
[실시예]
[실험예 1] 다당류 혼합물의 생산
1질량부 또는 2질량부의 나트륨 알기네이트(ALG) 및 99질량부 또는 98질량부의 정제수를 유리 배지 병에 첨가하고, 혼합물을 오토클레이브 멸균 처리(121℃, 20분)하여 1질량% 또는 2질량% 농도의 ALG 수용액을 수득하였다.
동일한 방식으로, 1질량% 농도 및 2질량% 농도의 탈아실화 젤란 검(DAG)(KELCOGEL CG-LA, 산쇼 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨) 수용액을 생성시켰다.
　소정량의 ALG 수용액 및 DAG 수용액을 마이크로튜브로 분액화하고, 피펫팅으로 조심스럽게 혼합하고, 주사기 바늘을 장착한 1회용 주사기를 사용하여 균일화하여 다당류 혼합물을 수득하였다.
[실험예 2] 배지 조성물의 생산
(1) 와동 믹서를 사용하여 배지 조성물의 생산
소정량의 배지를 원뿔 관(스미토모 베이크라이트 캄파니, 리미티드, 15mL, 50mL 또는 225mL 원심분리 관)에 분배하고, 그들을 개방 정치시키면서 와동 믹서로 교반하에 유지시켰다. 배지에 주사기 바늘(후치가미 기카이, FN5200)이 장착된 1회용 주사기(TERUMO CORPORATION TERUMO 주사기)로 소정량의 다당류 혼합물을 격렬하게 첨가하고, 다당류 혼합물을 충전시킴으로써 배지 조성물이 생성되었다.
(2) 배지 생산 키트(닛산 케미칼 인더스트리즈, FCeMTM-시리즈 제조 키트)를 사용하여 배지 조성물의 생산
원뿔 관(스미토모 베이크라이트 캄파니, 리미티드 50mL 원심분리 관)에 소정량의 배지를 분배하고, 키트의 구성인 어댑터 캡을 설치했다. 소정량의 다당류 혼합물이 충전된 1회용 주사기의 팁을 어댑터 캡의 원통형 부분에 끼워 넣어 연결부를 확립했다. 주사기의 플런저를 수동으로 가압하여 주사기 내의 다당류 혼합물을 용기로 격렬하게 주입하여 배지와 접촉되도록 함으로써 배지 조성물이 생성되었다.
[실험예 3] 부유 작용의 확인
실험예 2에서 생성된 배지 조성물에 부유하는 세포를 모의적으로 재생하기 위한 폴리스티렌 비드(직경 500 내지 600㎛, 폴리사이언시즈 인코포레이티드에 의해 제조됨)를 첨가하고, 혼합물을 교반시켰다. 교반 정지 10분 후, 액체에서 비드의 분산 상태를 육안 관찰로 확인했다. 2가 금속 양이온(Ca2+ 등)을 통해 DAG 및 ALG를 가교결합시킴으로써 형성되는 구조의 충분한 양을 액체에 적절하게 미세하게 분산시키는 경우, 비드도 또한 액체에 분산시키고 부유시킨다. 한편, 구조가 충분히 분산되지 않으면, 비드는 또한 따라서 침강물을 형성한다. 비드의 분산 상태는, 비드가 바람직하게 분산되어 부유되면 ○, 비드가 침강물의 부분적 형성과 함께 분산되면 △, 모든 비드가 침강물을 형성하면 ×로 나타낸다.
(1) DAG 및 ALG(1:1)을 이용하는 부유 작용
Figure pat00002
(2) DAG 및 ALG(0.5:1)를 사용하는 부유 작용
Figure pat00003
[실험예 4] 피펫팅에 의한 세포 회수
대수 증식기에 있는 정상적인 인간 신생아 포피 피부 섬유아세포(NHDF, 쿠라보 인더스트리즈 리미티드)(1800 × 104 세포)를 제조하고, 300 × 104 세포씩 분배했다. 원심분리(300 x g, 3분) 후, 상청액을 제거하고, DAG 및 ALG(총 농도 0.015(w/v)%)를 다양한 비율로 함유하는 배지 조성물(표 3의 예 C369 내지 C373)을 30mL씩 첨가하고, 혼합물을 완만하게 교반하여 세포 부유물을 생성시켰다(10 × 104 세포/mL). 24-웰 세포 배양 플레이트(스미토모 베이클라이트 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨)에 1개 웰당 1mL씩 세포 부유물(10 × 104 세포)을 첨가하고, 세포를 37℃, 5% 이산화탄산 가스 조건하에 1주 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 부유물의 세포 농도를 세포 계수기(TC-20, BIO-RAD)로 측정하고, 부유물을 1.5mL 마이크로튜브로 옮기고, 흡입/방출 용적 0.2mL로 설정된 마이크로피펫(써모 사이언티픽에 의해 제조됨, 클립 칩 1000μL)을 사용하여 20회 피펫팅으로 균일화했다. 그 이후, 원심분리(300 x g, 3분)를 수행하고, 상청액(1.1mL)을 제거했다. 세포를 10% 소 태아 혈청 함유 DMEM-LG(0.9mL)를 첨가하여 다시 부유시키고, 세포에 함유된 ATP의 양을 CellTiter-Glo(프로메가 코포레이션)를 사용하여 플레이트 판도기(테칸 제팬 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨)에 의해 정량화했다. 세포 회수 작업 전 배양된 세포의 부유물을 측정하여 수득된 RLU 값을 기준(세포 회수율 100%)으로 하여, 부유 억제제를 첨가하는 세포 회수 작업으로 수득된 RLU 값을 비교하여 세포 회수율을 계산했다. 상기 시험을 각각 3회 수행하고, 이의 평균은 표에 제시한다.
예 C369 C370 C371 C372 C373
배지 중 농도 % ALG 0.01 0.0105 0.011 0.0115 0.012
DAG 0.005 0.0045 0.004 0.0035 0.003
세포 회수율 % 69.6 57.1 79.4 86.3 99.4
[실험예 5] 피펫팅 횟수의 연구
대수 증식기에 있는 정상적인 인간 신생아 포피 피부 섬유아세포(NHDF, 쿠라보 인더스트리즈 리미티드)(1440 × 104 세포)를 제조하고, 표 3의 예 C371의 배지 조성물(48mL)에 부유시키고, 24-웰 배양 플레이트(스미토모 베이클라이트 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨)에 30 × 104 세포(1mL)씩 분배하고, 37℃, 5% 이산화탄소 가스 조건하에 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 부유물의 세포 농도를 세포 계수기(TC-20, BIO-RAD)로 측정하고, 부유물을 1.5mL 마이크로튜브에 옮기고, 흡입/방출 용적 0.2mL로 설정된 마이크로피펫(써모 사이언티픽에 의해 제조됨, 클립 칩 1000μL)을 사용하여 소정의 횟수로 피펫팅했다. 그 이후, 원심분리(300 x g, 3분)를 수행하고, 상청액(1.1mL)을 제거했다. 세포를 10% 소 태아 혈청 함유 DMEM-LG(0.9mL)를 첨가하여 다시 부유시키고, 세포에 함유된 ATP 양을 CellTiter-Glo(프로메가 코포레이션)를 이용하여 플레이트 판독기(테칸 제팬 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨)로 정량화하고, 세포 회수율을 계산했다. 상기 시험은 각각 5회 실시하고, 이의 평균은 표에 제시한다.
피펫팅 횟수 3 5 10 15 20
세포 회수율 % 44.2 69.9 70.6 68.3 75.9
[실험예 6] 킬레이트제의 첨가
대수 증식기에 있는 정상적인 인간 신생아 포피 피부 섬유아세포(NHDF, 쿠라보 인더스트리즈 리미티드)(450 × 104 세포)를 제조하고, 표 3의 예 C371의 배지 조성물(15mL)에 부유시키고, 30 × 104 세포(1mL)씩 24웰 세포 배양 플레이트(스미토모 베이클라이트 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨)에 분배하고, 37℃, 5% 이산화탄소 가스 조건에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 세포 부유물의 세포 농도를 세포 계수기(TC-20, BIO-RAD)를 이용하여 측정하고, 부유물을 1.5mL 마이크로튜브에 옮기고, 소정량의 킬레이트제(EDTA-2Na 0.033(w/v)% 및 나트륨 시트레이트 0.007(w/v)%의 혼합 수용액)(0 내지 0.1mL)를 첨가하고, 흡입/방출 용적 0.2mL로 설정된 마이크로피펫(써모 사이언티픽에 의해 제조됨, 클립 칩 1000μL)을 사용하여 0회 또는 10회 피펫팅했다. 그 이후, 원심분리(300 x g, 3분)를 수행하고, 상청액(1.1mL)을 제거했다. 세포를 10% 소 태아 혈청 함유 DMEM-LG(0.9mL)를 첨가하여 다시 부유시키고, 세포에 함유된 ATP 양을 CellTiter-Glo(프로메가 코포레이션)를 이용하여 플레이트 판독기(테칸 제팬 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨)로 정량화하고, 세포 회수율을 계산했다. 상기 시험은 각각 3회 수행하고, 이의 평균은 표에 나타낸다.
피펫팅의 횟수 0 10 10 10
킬레이트제 첨가량 mL 0 0 0.05 0.1
세포 회수율 % 6.1 91.3 89.1 89.6
[실험예 7] Jurkat 세포의 증식
　대수 증식기에 있는 정상적인 인간 T-세포 백혈병 유래 세포(Jurkat E6.1, DS 파마 바이오메디칼 캄파니, 리미티드)(240 × 104 세포)를 제조하고, 40 × 104 세포씩 원심분리(300 x g, 3분)하고, 상청액을 제거했다. DAG 및 ALG(질량비 1:0.5)를 다양한 농도로 함유하는 배지 조성물(표 6의 예 DHb020 내지 DHb023) 및 DAG를 함유하고 ALG를 함유하지 않는 배지 조성물(표 6의 비교 예 DHb024)을 8mL씩 첨가하고, 혼합물을 완만하게 교반하여 세포 부유물을 제조하였다(5 × 104 세포/mL). 96-웰 U-기저 세포 배양 플레이트(스미토모 베이클라이트 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨, MS-309UR)에 세포 부유물(0.5 × 104 세포)을 1개 웰당 0.1mL씩 첨가하고, 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 가스 조건하에서 1일 또는 4일간 배양하였다. 세포에 함유된 ATP의 양으로서 배양 전후의 세포 수를 사용하여, 그들을 CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 검정(프로메가 KK, G7571)을 이용하여 플레이트 판독기(테칸 제팬 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨, 무한 M200PRO)에 의해 비교했다. 상기 시험은 각각 4회 실시하고, 이의 평균을 표에 나타낸다.
배지 중 농도 % RLU
DAG ALG 배양 전 배양 1일 배양 4일
비교 예 DHb024 0.020 0 156639 318811 1755495
예 DHb020 0.0037 0.0073 169680 351910 2068701
DHb021 0.0047 0.0093 177597 362442 2107969
DHb022 0.0057 0.0113 171730 313565 1973738
DHb023 0.0067 0.0133 191724 332460 2016689
평가 결과, 본 발명의 배지 조성물이 사용되는 경우에도 비교 예와 동등한 세포 증식성이 달성되었다.
[실험예 8] A549 세포 증식
대수 증식기에 있는 인간 폐포 기저 상피 선암 세포(A549, DS 파마 바이오메디칼 캄파니, 리미티드)(86.4 × 104 세포)를 제조하고, 원심분리(300 x g, 3분)하고, 상청액을 제거했다. DAG 및 ALG(질량비 1:0.5)를 다양한 농도로 함유하는 배지 조성물(표 7의 예 E041 및 예 E045, E047, E048) 및 DAG를 함유하고 ALG를 함유하지 않는 배지 조성물(표 7의 비교 예 FP001)을 8mL씩 첨가하고, 혼합물을 완만하개 교반하여 세포 부유물을 제조하였다(5 × 104 세포/mL). 96-웰 U-기저 세포 배양 플레이트(스미토모 베이클라이트 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨, MS-309UR)에 세포 부유물(0.5 × 104 세포)을 1개 웰당 0.1mL씩 첨가하고, 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 가스 조건하에서 1일 또는 4일간 배양하였다. 세포에 함유된 ATP의 양으로서 배양 전후의 세포 수를 사용하여, 그들을 CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 검정(프로메가 KK, G7571)을 이용하여 플레이트 판독기(테칸 제팬 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨, 무한 M200PRO)에 의해 비교했다. 상기 시험은 각각 6회 실시하고, 이의 평균을 표에 나타낸다.
배지 중 농도 % RLU
DAG ALG 배양 전 배양 1일 배양 4일 배양 7일
비교예 E049 0.015 0 100639 114674 593527 1706412
예 E045 0.002 0.004 109473 127249 676181 1689925
E041 0.003 0.006 99532 121673 595366 1738593
E047 0.004 0.008 101544 118188 570577 1662464
E048 0.005 0.010 102446 120400 584303 1659677
평가 결과, 본 발명의 배지 조성물이 사용되는 경우에도 비교 예와 동등한 세포 증식성이 달성되었다.
[실험예 9] 10mL 규모의 세포 회수
표 7의 예 E041의 배지 조성물(200mL)에서 10 × 104 세포/mL로 A549 세포를 접종하고, 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 가스 조건하에서 2일 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 부유물을 10mL씩 분액화하고, 킬레이트제(EDTA-2Na 0.033(w/v)% 및 나트륨 시트레이트 0.007(w/v)%의 혼합 수용액)(1mL)를 첨가했다. 혼합물을 세포 스트레이너(40㎛, 70㎛, 100㎛, Falcon(R) 세포 스트레이너)를 통해 즉시 통과시키고, 다양한 조건하(50×g, 100×g, 300×g, g: 중력 가속도)에 원심분리했다(3분). 세포에 함유된 ATP의 양으로서 세포 회수 작업 전후의 상기 세포 수를 사용하여, 그들을 CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 검정(프로메가 KK, G7571)을 이용하여 플레이트 판독기(테칸 비교했다.제팬 캄파니, 리미티드에 의해 제조됨, 무한 M200PRO)에 의해
중력 가속도 세포 회수율 %
50 100 300
세포 스트레이너 미세 기공 크기
 40 ㎛ 73.3 92.7 96.2
70 ㎛ - - 98.6
100 ㎛ - - 96.4
평가 결과, 본 발명의 배지 조성물은 또한 피펫팅 작업 대신 메시(세포 스트레이너)를 통해 통과시킴으로써 높은 세포 회수율을 달성할 수 있음을 나타냈다.
본 발명의 배지 조성물은 세포 또는 조직의 부유 상태를 유지하는 효과를 제공하고, 필요에 따라 킬레이트제를 첨가하고, 피펫팅, 필터 여과 등에 의한 전단력을 적용함으로써 이 효과를 신속하게 상실하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물을 이용하여, 세포 및 조직을 부유 배양시킬 수 있고(바람직하게는, 정치 부유 배양), 세포 및 조직을 수득된 배양 제제로부터 높은 회수율로 회수할 수 있다.
특허, 특허 출원 및 과학 문헌을 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 공보에 개시된 내용은 그들이 본원에 개시된 정도로 그 전체가 참고로 포함된다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제2016-046365호(출원일: 2016년 3월 9일)에 기초하며, 이의 내용은 본원에 완전하게 포함된다.

Claims (12)

  1. 탈아실화 젤란 검(deacylated gellan gum) 또는 이의 염, 및 2가 금속 양이온 배지에서 랜덤 코일 상태를 유지시키고 2가 금속 이온을 통해 가교결합할 수 있는 산성 다당류 또는 이의 염을 포함하는, 세포 또는 조직의 부유 배양을 가능하게 하는 배지 조성물로서,
    배지 조성물 중의 상기 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염의 농도가 0.002 내지 0.01(w/v)%이고, 상기 산성 다당류 또는 이의 염의 농도가 0.004 내지 0.1(w/v)%이며, 상기 탈아실화 젤란 검 또는 이의 염에 대한 상기 산성 다당류 또는 이의 염의 질량비가 1 이상인, 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산성 다당류가 알긴산, 펙틴 및 펙틴산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 배지 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 산성 다당류가 알긴산인, 배지 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 양이온을 추가로 포함하는, 배지 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 금속 양이온이 칼슘 이온인, 배지 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 다당류 또는 이의 염이 고압 증기 멸균 처리되는, 배지 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 배지 조성물, 및 세포 또는 조직을 포함하는 세포 또는 조직 배양 제제.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 세포 또는 조직을 배양하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 배양 방법.
  9. 상기 배양 제제에 전단력을 적용하는 단계를 포함하는, 제7항의 배양 제제로부터 세포 또는 조직을 단리하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 전단력이 피펫팅 또는 필터 여과에 의해 상기 배양 제제에 적용되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 배양 제제에 킬레이트제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 제제를 전단력을 적용한 후 원심분리시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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