JPWO2017154952A1 - 細胞回収が容易な浮遊培養用培地組成物、及び細胞回収方法 - Google Patents
細胞回収が容易な浮遊培養用培地組成物、及び細胞回収方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
[1]脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び二価金属カチオン媒体中でランダムコイル状態を維持し、かつ二価金属イオンを介して架橋できる酸性多糖類又はその塩を含む、細胞又は組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物であって、
培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、0.002〜0.01 (w/v)%、前記酸性多糖類又はその塩の濃度が0.004〜0.1 (w/v)%であり、
脱アシル化ジェランガム又はその塩に対する前記酸性多糖類又はその塩の質量比が、1以上である、
培地組成物。
[2]前記酸性多糖類が、アルギン酸、ペクチン及びペクチン酸からなる群から選択されるいずれかである、[1]記載の培地組成物。
[3]前記酸性多糖類が、アルギン酸である、[2]記載の培地組成物。
[4]さらに、金属カチオンを含有する、[1]〜[3]のいずれか記載の培地組成物。
[5]前記金属カチオンが、カルシウムイオンである、[4]記載の培地組成物。
[6]前記酸性多糖類又はその塩が、高圧蒸気滅菌処理されている、[1]〜[5]のいずれか記載の培地組成物。
[7][1]〜[6]のいずれか記載の培地組成物、及び細胞又は組織を含む、細胞又は組織培養調製物。
[8][1]〜[6]のいずれか記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを含む、細胞又は組織の培養方法。
[9][7]記載の培養調製物から細胞又は組織を単離する方法であって、該培養調製物に対してせん断力を加えることを含む、方法。
[10]ピペッティング又はフィルター濾過により培養調製物に対してせん断力を加える、[9]記載の方法。
[11]培養調製物中にキレート剤を添加することを更に含む、[9]又は[10]記載の方法。
[12]培養調製物に対してせん断力を加えた後で、該培養調製物を遠心分離に付すことを更に含む、[9]〜[11]のいずれか記載の方法。
本発明は、細胞または組織を浮遊させて培養できる培地組成物を提供する。当該培地組成物は、浮遊状態を維持したまま、培養対象の細胞やこれを含む組織を培養することを可能にする。
株式会社キミカ:
キミカアルギンシリーズ IL-2、IL-6、I-1、I-3、I-5、I-8、ULV-L3、ULV-L5、ULV-1、ULV-3、ULV-5、ULV-20、ULV-L3G、IL-6G、I-1G、I-3G、IL-6M、BL-2、BL-6、B-1、B-3、B-5、B-8、SKAT-ONE、SKAT-ULV
アルギテックスシリーズ LL、L、M、H
キッコーマンバイオケミファ株式会社:
ダックアルギン NSPH2R、NSPHR、NSPMR、NSPLR、NSPLLR
三晶株式会社:
スコーギン、サンアルギン
北海道三井化学株式会社:
アルギン酸オリゴ糖 ALGIN
例えば、105〜135℃、0.12〜0.32 MPa、1〜60分であり;
好ましくは、115℃〜130℃、0.17〜0.27 MPa、5〜45分であり;
より好ましくは、118〜123℃(例、121±1℃)、0.19〜0.23 MPa(例、0.21±0.1MPa)、15〜25分(例、20±1分)である。
本発明は、上記本発明の培地組成物中で、細胞又は組織を培養することを含む、細胞又は組織の培養方法を提供する。更に、本発明は、該本発明の培養方法等により得られる、本発明の培地組成物及び、細胞又は組織を含む、培養調製物をも提供する。培養調製物とは、細胞又は組織を培養することにより得られる結果物をいい、細胞又は組織、培地(培地組成物)、場合によっては細胞分泌性成分等が含まれる。
本発明は、上記本発明の培地組成物、及び細胞又は組織を含有する、細胞又は組織の培養調製物から、当該細胞又は組織を効率的に単離する方法を提供する。本発明の単離方法は、該培養調製物に対して、せん断力を加えることを特徴とする。
例えば、クエン酸又はその塩(例、クエン酸3ナトリウム)の場合、通常、添加直後の終濃度として、0.001 w/v%以上、好ましくは、0.005 w/v%以上である。理論的には、上限値は、クエン酸又はその塩の飽和濃度であるが、濃度が高すぎると細胞又は組織の生存性への影響が懸念されるため、通常、0.2 w/v%以下、より好ましくは0.1 w/v%以下である。
また、EDTA又はその塩(例、EDTA2Na、EDTA3Na、EDTA4Na等のエデト酸ナトリウム塩)の場合、通常、添加直後の終濃度として、0.001w/v%以上、好ましくは、0.005 w/v%以上である。理論的には、上限値は、EDTA又はその塩の飽和濃度であるが、濃度が高すぎると細胞又は組織の生存性への影響が懸念されるため、通常、0.2 w/v%以下、より好ましくは0.1 w/v%以下である。
また、本発明は、上記フィルターを含む、上記本発明の培地組成物、及び細胞又は組織を含有する、細胞又は組織の培養調製物から、当該細胞又は組織を単離するための試薬(キット)をも提供する。
ガラス製培地ビンへ1質量部または2質量部のアルギン酸ナトリウム(ALG)および99質量部または98質量部の精製水を加え、オートクレーブ滅菌処理(121℃、20分)を行う事で、1質量%濃度または2質量%濃度のALG水溶液を作製した。
同様にして1質量%濃度および2質量%濃度の脱アシル化ジェランガム(DAG)(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)水溶液を作製した。
所定量のALG水溶液及びDAG水溶液をマイクロチューブへ分取し、シリンジ針を装着したディスポシリンジを使用して念入りにピペッティング混合して均一化し、多糖混合液を作製した。
(1)ボルテックスミキサーを使用した培地組成物の作製
コニカルチューブ(住友ベークライト 15 mL、50 mL、または225 mL遠沈管)に所定量の培地を分注し、開放したままボルテックスミキサーにより撹拌状態とした。そこへ所定量の多糖混合液を充填したシリンジ針(フチガミ器械 FN5200)を装着したディスポーザブルシリンジ(テルモ テルモシリンジ)から、勢い良く多糖混合液を培地へ加えることにより培地組成物を作製した。
コニカルチューブ(住友ベークライト 50 mL遠沈管)に所定量の培地を分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。所定量の多糖混合液を充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖混合液を容器内へと射出して培地と接触させて培地組成物を作製した。
試験例2にて作製した培地組成物中に、浮遊する細胞を模擬的に再現するためのポリスチレンビーズ(直径500〜600 μm、Polysciences Inc.製)を添加して撹拌し、撹拌停止から10分後に、液中のビーズの分散状態を目視にて確認した。DAG及びALGが二価金属カチオン(Ca2+等)を介して架橋されることにより形成される構造体の十分量が液中に適切に細かく分散している場合、ビーズも液中に分散して浮遊したままになる。一方、当該構造体の分散が十分でないと、それに応じてビーズも沈降する。ビーズの分散状態については、好ましく分散し浮遊した状態を○、分散しているが一部が沈降した状態を△、全てのビーズが沈降した状態を×として表す。
対数増殖期にある正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞(NHDF、倉敷紡績)を1800×104細胞準備し、300×104細胞ずつ分注した。遠心分離(300 x g、3分)を行い上清除去した後、DAG及びALG(合計濃度 0.015(w/v)%)を種々の比で含む培地組成物(表3の実施例C369乃至C373)30mLを加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した(10×104細胞/mL)。24穴細胞培養用プレート(住友ベークライト社製)へ10×104細胞分の細胞懸濁液を1ウェルあたり1 mLずつ加え、37℃、5%炭酸ガス条件下において1週間培養を行った。培養後の細胞懸濁液の細胞濃度をセルカウンター(TC-20、BIO-RAD)を用いて計測した後、同懸濁液を1.5 mLマイクロチューブへ移し、0.2 mLに吸引・吐出容量を設定したマイクロピペット(サーモサイエンティフィック社製、クリップチップ1000 μL)により20回ピペッティングすることにより均一化した。その後遠心分離(300 x g、3分)を行い、上清液1.1 mLを除去して10%ウシ胎児血清含有DMEM-LGを0.9mL添加して再懸濁させた後、細胞中に含まれるATP量をCellTiter-Glo(プロメガ社)を用いてプレートリーダー(テカン社製)により定量した。細胞回収操作前の培養後細胞懸濁液を測定して得られたRLU値を基準(細胞回収率100%)として、浮遊阻害剤を添加して細胞回収操作をした際に得られるRLU値を比較して細胞回収率を算出した。以上の試験は全て3回実施し、その平均値を表に記した。
対数増殖期にある正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞(NHDF、倉敷紡績)を1440×104細胞準備し、表3の実施例C371の培地組成物48mLへ懸濁させ、30×104細胞(1 mL)ずつ24穴細胞培養用プレート(住友ベークライト社製)へ分注し、37℃、5%炭酸ガス条件下において3日間培養を行った。培養後の細胞懸濁液の細胞濃度をセルカウンター(TC-20、BIO-RAD)を用いて計測した後、同懸濁液を1.5 mLマイクロチューブへ移し、0.2mLに吸引・吐出容量を設定したマイクロピペット(サーモサイエンティフィック社製、クリップチップ1000μL)により所定回数ピペッティングした。その後遠心分離(300 x g、3分)を行い、上清液1.1mLを除去して10%ウシ胎児血清含有DMEM-LGを0.9 mL添加して再懸濁させた後、細胞中に含まれるATP量をCellTiter-Glo(プロメガ社)を用いてプレートリーダー(テカン社製)により定量し、細胞回収率を算出した。以上の試験は全て5回実施し、その平均値を表に記した。
対数増殖期にある正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞(NHDF、倉敷紡績)を450×104細胞準備して表3の実施例C371の培地組成物15 mLへ懸濁させ、30×104細胞(1 mL)ずつ24穴細胞培養用プレート(住友ベークライト社製)へ分注し、37℃、5%炭酸ガス条件下において3日間培養を行った。培養後の細胞懸濁液の細胞濃度をセルカウンター(TC-20、BIO-RAD)を用いて計測した後、同懸濁液を1.5 mLマイクロチューブへ移し、所定量のキレート剤(EDTA-2Na 0.033 (w/v)%とクエン酸ナトリウム 0.007(w/v)%の混合水溶液)0乃至0.1 mLを加えて、0.2 mLに吸引・吐出容量を設定したマイクロピペット(サーモサイエンティフィック社製、クリップチップ1000 μL)により0または10回ピペッティングした。その後遠心分離(300 x g、3分)を行い、上清液1.1 mLを除去して10%ウシ胎児血清含有DMEM-LGを0.9 mL添加して再懸濁させた後、細胞中に含まれるATP量をCellTiter-Glo(プロメガ社)を用いてプレートリーダー(テカン社製)により定量し、細胞回収率を算出した。以上の試験は全て3回実施し、その平均値を表に記した。
対数増殖期にあるヒトT細胞性白血病由来細胞(Jurkat E6.1、DSファーマバイオメディカル株式会社)を240×104細胞準備し、40×104細胞ずつ遠心分離(300 x g、3分)を行い上清除去した後、DAG及びALG(質量比 1:0.5)を種々の濃度で含む培地組成物(表6の実施例DHb020乃至DHb023)、及びDAGを含みALGを含まない培地組成物(表6の比較例DHb024)を8mL加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した(5×104細胞/mL)。96穴U底細胞培養用プレート(住友ベークライト社製、MS-309UR)へ0.5×104細胞分の細胞懸濁液を1ウェルあたり0.1mLずつ加え、37℃、5%炭酸ガス条件下において1又は4日間培養を行った。培養前後の細胞数を細胞中に含まれるATP量としてCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega社、G7571)を用いてプレートリーダー(テカン社製、infiniteM200PRO)により比較した。以上の試験は全て4回実施し、その平均値を表に記した。
対数増殖期にあるヒト肺胞基底上皮腺癌細胞(A549、DSファーマバイオメディカル株式会社)を86.4×104細胞準備し、遠心分離(300 x g、3分)を行い上清除去した後、DAG及びALG(質量比 1:0.5)を種々の濃度で含む培地組成物(表7の実施例E041及び実施例E045、E047、E048)、及びDAGを含みALGを含まない培地組成物(表7の比較例FP001)を8 mLを加えて緩やかに撹拌し細胞懸濁液を作製した(5×104細胞/mL)。96穴U底細胞培養用プレート(住友ベークライト社製、MS-309UR)へ0.5×104細胞分の細胞懸濁液を1ウェルあたり0.1 mLずつ加え、37℃、5%炭酸ガス条件下において1又は4日間培養を行った。培養前後の細胞数を細胞中に含まれるATP量としてCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega社、G7571)を用いてプレートリーダー(テカン社製、infiniteM200PRO)により比較した。以上の試験は全て6回実施し、その平均値を表に記した。
表7の実施例E041の培地組成物200 mLへ10×104細胞/mLとなるようにA549細胞を播種し、37℃、5%炭酸ガス条件下において二日間培養した。培養後、細胞懸濁液を10mLずつ分取し、キレート剤(EDTA-2Na 0.033 (w/v)%とクエン酸ナトリウム 0.007(w/v)%の混合水溶液)を1mL添加し、直ちにセルストレーナー(40μm、70μm、100μm、Falcon(R) セルストレーナー)を通して種々条件にて遠心分離(3分間)を行った(50×g、100×g、300×g、g:gravity 重力加速度)。前述の細胞回収操作前後の細胞数を細胞中に含まれるATP量としてCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega社、G7571)を用いてプレートリーダー(テカン社製、infiniteM200PRO)により比較した。
Claims (12)
- 脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び二価金属カチオン媒体中でランダムコイル状態を維持し、かつ二価金属イオンを介して架橋できる酸性多糖類又はその塩を含む、細胞又は組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物であって、
培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、0.002〜0.01 (w/v)%、前記酸性多糖類又はその塩の濃度が0.004〜0.1 (w/v)%であり、
脱アシル化ジェランガム又はその塩に対する前記酸性多糖類又はその塩の質量比が、1以上である、
培地組成物。 - 前記酸性多糖類が、アルギン酸、ペクチン及びペクチン酸からなる群から選択されるいずれかである、請求項1記載の培地組成物。
- 前記酸性多糖類が、アルギン酸である、請求項2記載の培地組成物。
- さらに、金属カチオンを含有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の培地組成物。
- 前記金属カチオンが、カルシウムイオンである、請求項4記載の培地組成物。
- 前記酸性多糖類又はその塩が、高圧蒸気滅菌処理されている、請求項1〜5のいずれか1項記載の培地組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の培地組成物、及び細胞又は組織を含む、細胞又は組織培養調製物。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを含む、細胞又は組織の培養方法。
- 請求項7記載の培養調製物から細胞又は組織を単離する方法であって、該培養調製物に対してせん断力を加えることを含む、方法。
- ピペッティング又はフィルター濾過により培養調製物に対してせん断力を加える、請求項9記載の方法。
- 培養調製物中にキレート剤を添加することを更に含む、請求項9又は10記載の方法。
- 培養調製物に対してせん断力を加えた後で、該培養調製物を遠心分離に付すことを更に含む、請求項9〜11のいずれか1項記載の方法。
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