TW201823449A - 高品質之三維培養用培養基組成物的製造方法，及三維培養用培養基組成物之保存安定性的評估方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供液狀培養基組成物的製造方法，其係包含：將含有下述(i)的特定化合物的第1液體與含有下述(ii)的連結物質的第2液體在25℃以下並高於凝固點的溫度下混合，形成以均勻分散的狀態含有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體的液狀培養基組成物的製程，(i)特定化合物，係具有陰離子性官能基的高分子化合物，可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。

Description

高品質之三維培養用培養基組成物的製造方法，及三維培養用培養基組成物之保存安定性的評估方法

本發明是關於三維培養用培養基組成物的製造方法。又，本發明是關於三維培養用培養基組成物的保存安定性的評估方法。

以脫醯基化結冷膠(DAG)等具有陰離子性官能基的高分子化合物為代表的特定化合物，係經由2價金屬陽離子(例如鈣離子)等進行凝聚，在水中形成分散的三維網格(無定型構造體)。在含有此三維網格液體培養基中培養細胞時，此三維網格發揮做為懸浮細胞的承載物的功能，培養基中的細胞被此三維網格所捕捉而不沉澱之故，不需要振盪、旋轉操作等即可將細胞以均勻分散的懸浮狀態進行培養(懸浮靜置培養)。又，實質上不需要提高 液體培養基的黏度即可形成上述的三維網格之故，含有該三維網格之培養基組成物，在繼代等的操作性也優異(專利文獻1及2)。此可以懸浮靜置培養的培養基組成物，具有促進各種細胞的增殖活性等各式各樣的優異特性，對再生醫療、蛋白質等的大量生產等廣大的技術領域的應用備受期待。

以下，將具有陰離子性官能基的高分子化合物等上述特定的化合物也稱為「特定化合物」，將該特定化合物互相鍵結的2價金屬陽離子等物質也稱為「連結物質」。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2014/017513號

[專利文獻2]美國專利申請公開第2014/0106348 A1號說明書

上述專利文獻1所述的液狀培養基組成物本來所意圖的理想狀態，是特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體在液體培養基中均勻分散的狀態。但是，本案發明者發現：在培養基組成物剛製造之後，構造體雖在培養基組成物中成為均勻分散的良好狀態，但將該液狀培養基組成物長期間以靜置狀態 保存時，構造體的一部分形成固形的凝膠而培養基組成物變成不均勻，有不能維持本來所意圖的均勻分散狀態的情況之新課題。

於是，本案發明者等嘗試解明長期保存時固形凝膠形成的原因，但因評估需要長時間，原因究明很難進行。

本發明的目的是解決上述的問題，提供可抑制在保存時固形凝膠的形成，特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體可長期間維持在液體培養基中均勻分散的狀態之上述培養基組成物的製造的方法。

又，本發明的另一目的，是提供迅速評估以均勻分散的狀態含有特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體之液狀培養基組成物在長期保存時的安定性(亦即液狀培養基組成物不形成固形凝膠、前述構造體維持安定的均勻分散狀態的特性)的方法。

為了解決上述課題，本案發明者等首先從事上述培養基組成物的安定性評估的加速化。其結果，發現若將保存時的溫度升至26℃以上(例如37℃)時，固形凝膠的形成被加速，而可迅速評估上述培養基組成物在長期保存時的安定性。

於是，使用此加速化的評估方法追究在長 期保存時固形凝膠形成的原因時，發現含有特定化合物的液體與含有連結物質的液體(例如液體培養基或其濃縮物)混合時的溫度，影響培養基組成物的保存安定性，藉由將此混合溫度調低，可抑制保存時固形凝膠的形成。再者，藉由不是對含有特定化合物的液體添加含有連結物質的液體、而是對含有連結物質的液體添加含有特定化合物的液體，而成功更加抑制在保存時固形凝膠的形成。根據這些發現再加以檢討，而完成本發明。

本發明的主要構成如下。

[1]一種液狀培養基組成物的製造方法，其係包含：將含有下述(i)的特定化合物的第1液體與含有下述(ii)的連結物質的第2液體在25℃以下凝固點以上的溫度混合，形成以均勻分散的狀態含有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體的液狀培養基組成物的製程，(i)特定化合物，係可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體之具有陰離子性官能基的高分子化合物，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。

[2]如[1]所述的液狀培養基組成物的製造方法，其中，混合溫度是15℃以下凝固點以上。

[3]如[2]所述的液狀培養基組成物的製造方法，其中，混合溫度是4℃以下凝固點以上。

[4]如[1]至[3]中任一項所述的液狀培養基組成物的製造方法，包含對第2液體添加第1液體之步驟。

[5]如[1]至[4]中任一項所述的液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述(i)的特定化合物是脫醯基化結冷膠，第1液體是含有該脫醯基化結冷膠的水溶液，前述(ii)的連結物質是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方，第2液體是含有鈣離子及鎂離子中的一方或雙方的液體培養基或該液體培養基的濃縮液。

[6]如[5]所述的液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述液狀培養基組成物中的脫醯基化結冷膠的濃度是0.001%(w/v)至1.0%(w/v)。

[7]一種液狀培養基組成物的保存安定性的評估方法，該液狀培養基組成物係以均勻分散的狀態含有下述(i)的特定化合物經由下述(ii)的連結物質結合而成的構造體，該評定方法包含：將該培養基組成物在26℃至50℃的溫度保管3小時以上，以及調查保管後的培養基組成物中固形凝膠是否存在。

(i)特定化合物，係可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體之具有陰離子性官能基的高分子化合物，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。

[8]如[7]所述的液狀培養基組成物的保存安定性的評估方法，其中，係以靜止狀態保管前述培養基組成物。

[9]如[7]或[8]所述的液狀培養基組成物的保存安定性的評估方法，其中，前述(i)的特定化合物是脫醯基化結冷膠，前述(ii)的連結物質是鈣離子及鎂離子中的一方或雙 方。

依據本發明的製造方法，則可製造在保存時固形凝膠的形成受抑制之安定的上述培養基組成物。在由本發明的製造方法製造的培養基組成物中，特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體可長時間維持均勻分散的狀態。

依據本發明的評估方法，可迅速評估液狀培養基組成物長期保存時的安定性，該液狀培養基組成物係以均勻分散的狀態含有特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體。

第1圖是概略顯示含有脫醯基化結冷膠的培養基中固形凝膠生成的評定方法的圖。

1.液狀培養基組成物的製造方法

本發明的製造方法，是將含有下述(i)的特定化合物的第1液體與含有下述(ii)的連結物質的第2液體混合製造液狀培養基組成物的方法。

(i)特定化合物，係具有陰離子性官能基的高分子化合物，經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體。

(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。

該製造方法的特徴，是將第1液體與第2液體在25℃以下且高於凝固點的溫度混合。如此，可製造在保存時固形凝膠的形成受抑制的安定的培養基組成物。

首先，詳細說明含有前述(i)的特定化合物的第1液體、含有前述(ii)的連結物質的第2液體、以及由這些液體的混合而形成的液狀培養基組成物(以均勻分散的狀態含有特定化合物經由連結物質結合而成的構造體的液體)。

〔第1液體〕

第1液體含有做為特定化合物的具有陰離子性官能基的高分子化合物，經由2價金屬陽離子結合而可形成將細胞或組織懸浮的構造體。

做為陰離子性的官能基而言，可舉羧基、磺基、磷酸基及這些的鹽，而以羧基或其鹽為佳。在本發明所使用的高分子化合物中，含有由前述陰離子性官能基的群選出的1種或2種以上也可以。

做為本發明所使用的高分子化合物的理想具體例而言，沒有特別的限制，可舉由單醣類(例如丙醣、丁醣、戊醣、己醣、庚醣等)10個以上聚合而成的多醣類，較佳者是具有陰離子性官能基的酸性多醣類。在這裡所說的酸性多醣類，只要其構造中有陰離子性的官能基則沒有特別的限制，例如可舉具有醣醛酸(例如葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多醣類、構造中的一部分有硫酸基或磷酸基的多醣類、或持有該雙方的構造的 多醣類，不只由天然所得的多醣類，也包含由微生物產生的多醣類，由基因工程產生的多醣類，或使用酵素以人工合成的多醣類。更具體而言，可例示玻尿酸、結冷膠、脫醯基化結冷膠(以下有時稱為DAG)，鼠李聚糖膠(rhamsan gum)、代優堂膠(diutan gum)、黃原膠(xanthan gum)、海藻酸、鹿角菜膠、黃原膠(xanthan gum)、刺槐豆膠、己醣醛酸、褐藻糖膠(fucoidan)、果膠、果膠酸、果膠酯酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸類肝素、硫酸角質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)及由這些的鹽所成之群的1種或2種以上所構成的多醣類。多醣類，佳者是玻尿酸、DAG、代優堂膠(diutan gum)、黃原膠、鹿角菜膠或這些的鹽，較佳者是DAG或其鹽。DAG也可使用磷酸化者。該磷酸化可由公知的方法實施。

在這裡所說的鹽，例如可舉鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽，鈣、鋇、鎂等鹼土類金屬的鹽，或鋁、鋅、銅、鐵、銨，有機鹽基及胺基酸等的鹽。

這些高分子化合物(多醣類等)的重量平均分子量，佳者是10,000至50,000,000，較佳者是100,000至20,000,000，更佳者是1,000,000至10,000,000。例如，該分子量可由凝膠滲透層析法(GPC)的聚三葡萄糖換算測定。

在本發明中，可將具有上述陰離子性的官能基的多醣類多數種(佳者是2種)組合使用。將具有陰離子性的官能基的多醣類與未具有陰離子性的官能基的多醣 類組合也可以。多醣類組合的種類，只要經由2價金屬陽離子結合而可在液體培養基中形成上述的構造體則沒有特別的限定，佳者是該組合至少含有DAG或其鹽。亦即在合適的多醣類的組合中，包含DAG或其鹽以及DAG或其鹽以外的多醣類(例如黃原膠、海藻酸、鹿角菜膠、代優堂膠、甲基纖維素、刺槐豆膠或這些的鹽)。做為具體的多醣類的組合而言，可舉DAG與鼠李聚糖膠、DAG與代優堂膠、DAG與黃原膠、DAG與鹿角菜膠、DAG與黃原膠、DAG與刺槐豆膠、DAG與κ-鹿角菜膠、DAG與海藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，但不限定於這些。

脫醯基化結冷膠是以1-3結合的葡萄糖、1-4結合的葡萄糖醛酸、1-4結合的葡萄糖及1-4結合的鼠李糖等4分子的醣做為構成單元的直鏈狀高分子多醣類，以下的通式(I)中，R₁、R₂均為氫原子，n是以2以上的整數代表的多醣類。但是，R₁含有甘油基、R₂含有乙醯基也可以，但乙醯基及甘油基的含有量，佳者是10%以下，較佳者是1%以下。

特定化合物是由化學合成法所得者也可以，但該特定化合物是天然物時，由含有該化合物的各種 植物、各種動物、各種微生物使用慣用技術萃取及分離精製而得者也可以。例如，結冷膠可用發酵培養基培養生產微生物，在菌體外生產的黏膜物經過通常的精製方法回收，經乾燥、粉碎等製程後，使具成為粉末狀而製成。又，脫醯基化結冷膠之情況時，回收黏膜物時實施鹼處理，將結合在1-3結合的葡萄糖殘基的甘油基及乙醯基脫醯基化之後回收即可。結冷膠的生產微生物的例子而言，並不限定於這種，但可舉Sphingomonas elodea及改變該微生物的遺傳基因的微生物。

脫醯基化結冷膠的情況時，可使用市售品，例如三晶股份公司製「KELCOGEL(CP‧Kelco公司的登錄商標)CG-LA」、三榮源F‧F‧I股份公司製「Kelcogel(CP‧Kelco公司的登錄商標)」等。又，做為原生型結冷膠，可使用三榮源F‧F‧I股份公司製「Kelcogel(CP‧Kelco公司的登錄商標)HT」等。

第1液體通常是特定化合物的溶液。用於該溶液的溶媒，只要能溶解特定化合物，則沒有特別的限定，通常是水或親水性溶媒，佳者是水。亦即理想的方式中，第1液體是特定化合物的水溶液。

第1液體中所含有的特定化合物的濃度，只要與第2液體混合時，在混合液中，特定化合物經由2價金屬陽離子結合而形成可將細胞或組織懸浮的構造體，並且該構造體在混合液中均勻分散，再者，最後所得的液狀培養基組成物藉由含有該構造體而可將細胞或組織懸浮 培養，則無特別的限定。如以下詳述，由可將細胞或組織懸浮培養的培養基組成物中特定化合物的濃度、以及第1液體的體積對最終產物所得的培養基組成物的體積比率，可算出第1液體中特定化合物的濃度。例如，將體積V₁的第1液體與體積V₂的第2液體混合，最後得到體積V₁+V₂的液狀培養基組成物時，要使該液狀培養基組成物中特定化合物的濃度成為C%(w/v)的話，將第1液體中特定化合物的濃度設定為C×(V₁+V₂)/V₁%(w/v)即可。

第1液體中的2價金屬陽離子濃度，必需低於第1液體中的特定化合物形成構造體的濃度。做為2價金屬陽離子而言，可舉鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。特別是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方(以下，也表示為「鈣離子及/或鎂離子」)對DAG等特定化合物的構造體形成有貢獻。

在第1液體中，也可以含有特定化合物、溶媒以外的因子。該因子而言，可舉生理上可容許的緩衝劑、鹽、等張劑，但不限定於這些。

第1液體的調製，可將特定化合物添加於上述溶媒(例如水)，在該特定化合物可溶解的溫度(例如，60℃以上、80℃以上、90℃以上)攪拌，溶解至成為透明的狀態為止而實施。使用去2價金屬陽離子處理的特定化合物(DAG等)，則不需要加熱而可溶解於水，所以溶解操作容易。必要時，將所得的特定化合物的溶液加以去2價金屬陽離子處理，使溶液中的2價金屬陽離子濃度低於構造 體形成濃度。有必要時，在溶媒中預先添加特定化合物以外的因子也可以，在所得的特定化合物的溶液添加特定化合物以外的因子也可以。第1液體以經滅菌處理為佳。做為滅菌處理的方法而言，可舉高壓釜滅菌、過濾滅菌等但不限定於這些。

〔第2液體〕

第2液體含有2價金屬陽離子做為連結物質。做為2價金屬陽離子而言，可舉鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。2價金屬陽離子的種類，只要第1液體中所含的特定化合物經由該2價金屬陽離子結合而形成可將細胞或組織懸浮的構造體則沒有特別的限定，佳者是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方，較佳者是鈣離子。

第2液體通常是連結物質(即，2價金屬陽離子)的溶液。用於該溶液的溶媒是，只要能溶解連結物質則沒有特別的限定，通常是水或親水性溶媒，佳者是水。即，理想的方式中第2液體是連結物質(即，2價金屬陽離子)的水溶液。

在第2液體中，含有充分量的2價金屬陽離子，係在將第1液體與第2液體混合時，最後所得的液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子濃度達到可充分使第1液體中的特定化合物形成構造體之量。

第2液體中的2價金屬陽離子濃度，可由最後所得的液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子濃度與第1液體與第2液體的混合比算出。

在第2液體中，含有連結物質(即，2價金屬陽離子)及溶媒以外的因子也可以。做為該因子而言，可舉適合於培養目的細胞(例如哺乳動物的多能性幹細胞)的培養基構成成分。做為該培養基構成成分而言，可舉緩衝劑(碳酸緩衝劑、磷酸緩衝劑，HEPES等)、無機鹽(NaCl等)、各種胺基酸、各種維生素(膽鹼、葉酸等)、醣類(葡萄糖等)、抗氧化劑(硫代甘油等)、丙酮酸、脂肪酸、血清、抗生物質、胰島素、運鐵蛋白(transferrin)、乳鐵蛋白(lactoferrin)、膽固醇，各種細胞介素(例如培養哺乳動物的多能性幹細胞時，bFGF、LIF等未分化維持因子)、各種激素、各種增殖因子、各種細胞外基質等，但不限定於這些。第2液體以經滅菌處理為佳。做為滅菌處理的方法而言，可舉高壓釜滅菌、過濾滅菌等但不限定於這些。

理想的方式中，第2液體是含有構造體形成濃度的2價金屬陽離子(佳者是鈣離子及/或鎂離子)的液體培養基，或該液體培養基的濃縮液。

依據本發明，則即使第1液體的特定化合物濃度高(即，縱使第1液體所含的溶媒(水)的量少)，也能將第1液體與第2液體良好混合。因此，第1液體的特定化合物濃度高、第1液體少量時，可以忽視由第1液體對第2液體(液體培養基)的稀釋，所以第2液體可以不是濃縮液、是不需要稀釋而可直接使用的液體培養基。

另一方面，第1液體的特定化合物的濃度比較低時(即，第1液體所含的溶媒(水)的量比較多時)，第1液體與 第2液體有容易混合良好的傾向，構造體可分散良好。因此，第1液體的特定化合物濃度低時(溶媒(水)的量對第2液體而言不能忽視時)，第2液體(液體培養基)是以考慮被第1液體所稀釋而在混合後成為良好的液體培養基的濃縮液為佳。

第2液體除了2價金屬陽離子(佳者是，鈣離子及/或鎂離子)及水之外，尚含有適合於培養目的細胞的培養基構成成分。一般所使用的細胞培養用液體培養基中的鈣離子濃度的範圍是0.1至2.0mM左右，鎂離子濃度是0.1至1.0mM左右，對於DAG等特定化合物的構造體形成是充分的。在第2液體中的2價金屬陽離子(佳者是，鈣離子及/或鎂離子)的濃度，可考慮與第1液體的混合比，以使最後所得的液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子濃度成為構造體形成濃度之方式進行調整。對於其他的連結物質也是同樣。又，在第2液體中的，適合於培養目的細胞的培養基構成成分的濃度，可考慮與第1液體的混合比，以使最後所得的液狀培養基組成物中的培養基構成成分的濃度成為適合於培養目的細胞的濃度範圍內之方式進行調整。例如，將體積V₁的第1液體與體積V₂的第2液體混合，最後得到體積V₁+V₂的液狀培養基組成物時，要使該液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子的濃度成為Ci時，將第2液體中的2價金屬陽離子的濃度調整為Ci×(V₁+V₂)/V₂即可。對於其他的連結物質也是同樣。同樣將體積V₁的第1液體與體積V₂的第2液體混合，最後得體積V₁+V₂的 液狀培養基組成物時，要使該液狀培養基組成物中的培養基構成成分的濃度成為Cm時，將第2液體中的培養基構成成分的濃度調整為Cm×(V₁+V₂)/V₂即可。

在本方式中，由本發明的製造方法，藉由將第1液體與第2液體混合，可得到以均勻分散的狀態含有第1液體所含有的特定化合物經由第2液體所含有的連結物質結合而成的構造體之目的液狀培養基組成物。

在第2液體中，不含上述的細胞培養用培養基構成成分的一部分或全部也可以。此時，在本發明的製造方法中，將第1液體與第2液體混合，獲得以均勻分散的狀態含有第1液體所含有的特定化合物經由第2液體所含有的連結物質結合而成的構造體的混合液，在該混合液中添加上述細胞培養用液體培養基構成成分的一部分或全部，可得目的之液狀培養基組成物。

第1液體與第2液體的體積混合比，相對於第1液體的體積100，第2液體的體積例如是10至9900，佳者是100至4900。

合適的方式中，由本發明的製造方法製造的液狀培養基組成物中含有的特定化合物的90莫耳%以上(佳者是95莫耳%以上，較佳者是99%以上，最佳者是100%)來自於第1液體，該培養基組成物中含有的2價金屬陽離子的90莫耳%以上(佳者是95莫耳%以上，較佳者是99%以上，最佳者是100%)來自於第2液體。

〔液狀培養基組成物〕

本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物，含有第1液體所含有的特定化合物經由第2液體所含有的連結物質(即，2價金屬陽離子)結合而成的構造體，且該構造體均勻分散在該培養基組成物中，所以使用該培養基組成物，可在維持懸浮狀態下培養細胞或組織。

成為培養對象的細胞或組織所由來的生物種類，沒有特別的限定，不只是動物(昆蟲、魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等)，也包含植物。

在一方式中，成為培養對象的細胞，是立足地依賴性的細胞。使用本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物，則可以不使用做為立足地的承載物而在維持懸浮狀態下培養立足地依賴性的細胞。

在本發明中，細胞及/或組織的懸浮，意指細胞及/或組織可接觸培養容器底面但不附著的狀態(非黏著)之謂。再者，在本發明中，使細胞及/或組織增殖、分化或維持時，對液體的培養基組成物不需要有外部的壓力或振動、或該組成物中的振盪、旋轉操作等，而細胞及/或組織在該液狀培養基組成物中均勻分散並且是在懸浮狀態的狀態稱為「懸浮靜置」，在該狀態下培養細胞及/或組織稱為「懸浮靜置培養」。又，在「懸浮靜置」中可以使其懸浮的期間而言，包括5分鐘以上、1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上等，但只要保持懸浮狀態則不受限於這些期間。

本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物，在細胞或組織的維持或培養可能的溫度範圍(例如，0至40℃)的至少1點，細胞及/或組織可以懸浮靜置。本發明所得的液狀培養基組成物，佳者是在25至37℃的溫度範圍的至少1點，最佳者是在37℃，細胞及/或組織可以懸浮靜置。

是否可以懸浮靜置，例如，將培養對象的細胞以2×10⁴cells/mL的濃度，在評估對象的培養基組成物中均勻分散，在15mL三角管中注入10mL，在4℃至10℃左右的溫度下靜置至少5分鐘以上(例如1小時以上，24小時以上，48小時以上，7日以上)，可由觀察是否維持該細胞的懸浮狀態進行評估。全細胞中的70%以上呈懸浮狀態的情況時，可結論為維持懸浮狀態。以聚苯乙烯珠(Size 500-600μm，Polysciences Inc.製)代替細胞進行評估也可以。

理想的方式中，本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物，由於含有上述構造體，其黏度實質上沒有提高。「實質上沒有提高液體的黏度」意指液體的黏度不超過8mPa‧s之意。此時該液體的黏度(即，本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物的黏度)，37℃時是在8mPa‧s以下，佳者是4mPa‧s以下，較佳者是2mPa‧s以下。含有構造體的液體的黏度是，在37℃條件下可使用E型黏度計(東機產業股份公司製，TV-22型黏度計，機種：TVE-22L，圓錐形轉子：標準轉子1°34’×R24，旋轉數 100rpm)測定。

本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物中的特定化合物的濃度，與特定化合物的種類有關聯，特定化合物在液狀培養基組成物中形成上述的構造體(佳者是實質上不提高該液體培養基的黏度)，在可將細胞及/或組織均勻懸浮(佳者是懸浮靜置)的範圍內，可適宜設定。例如，DAG的情況時為0.001%至1.0%(w/v)，佳者是0.003%至0.5%(w/v)，較佳者是0.005%至0.3%(w/v)，更佳者是0.01%至0.05%(w/v)，最佳者是，0.01%至0.03%(w/v)。黃原膠的情況時為0.001%至5.0%(w/v)，佳者是0.01%至1.0%(w/v)，較佳者是0.05%至0.5%(w/v)，最佳者是，0.1%至0.2%(w/v)。κ-鹿角菜膠及刺槐豆膠混合系的情況時，兩化合物的總和為0.001%至5.0%(w/v)，佳者是0.005%至1.0%(w/v)，較佳者是0.01%至0.1%(w/v)，最佳者是0.03%至0.05%(w/v)。原生型結冷膠的情況時為0.05%至1.0%(w/v)，佳者是0.05%至0.1%(w/v)。

做為特定化合物而將上述多醣類多數種(佳者是2種)組合使用時，該多醣類的濃度，是在該多醣類的組合將上述的構造體在液狀培養基組成物中形成(佳者是實質上不提高該液體培養基的黏度)，可將細胞及/或組織均勻懸浮(佳者是懸浮靜置)的範圍內，可適宜設定。例如，使用DAG或其鹽與DAG或其鹽以外的多醣類組合時，做為DAG或其鹽的濃度可例示0.005至0.02%(w/v)，佳者是0.01至0.02%(w/v)，做為DAG或其鹽以外的多醣類的濃 度而言，可例示0.0001至0.4%(w/v)，佳者是0.005至0.4%(w/v)，較佳者是0.1至0.4%(w/v)。做為具體的濃度範圍的組合而言，可例示下述者。

DAG或其鹽：0.005至0.02%(佳者是0.01至0.02%)(w/v)

DAG以外的多醣類

黃原膠：0.1至0.4%(w/v)

海藻酸鈉：0.0001至0.4%(w/v)(佳者是0.1至0.4%(w/v))

原生結冷膠：0.0001至0.4%(w/v)

刺槐豆膠：0.1至0.4%(w/v)

甲基纖維素：0.1至0.4%(w/v)(佳者是0.2至0.4%(w/v))

鹿角菜膠：0.05至0.1%(w/v)

代優堂膠(diutan gum)：0.05至0.1%(w/v)

在一方式中，將脫醯基化結冷膠或其鹽與在二價金屬陽離子媒體中維持無規線團狀態並可經由二價金屬離子進行橋聯的酸性多醣類或其鹽組合，做為特定化合物使用。該酸性多醣類之佳者由海藻酸、果膠及果膠酸所成之群選出的任一種，較佳者是海藻酸。做為鹽而言，可舉鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽；鈣、鋇、鎂等鹼土類金屬的鹽；鋁、鋅、銅、鐵等的鹽；銨鹽等，佳者是鈉鹽。做為該酸性多醣類或其鹽而言，可合適使用海藻酸鈉。本方式中，本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物中的脫醯基化結冷膠或其鹽的濃度，例如是0.002至0.01(w/v)%，佳者是0.002至0.009(w/v)%，較佳者是0.003至0.009 (w/v)%，前述酸性多醣類或其鹽(例如海藻酸鈉)的濃度，例如是0.004至0.1(w/v)%，佳者是0.004至0.02(w/v)%，較佳者是0.004至0.015(w/v)%，更佳者是0.005至0.015(w/v)%。

又該濃度可由以下的式算出。

濃度[%(w/v)]=特定化合物的重量(g)/培養基組成物的體積(mL)×100

在理想的方式中，做為特定化合物使用DAG或其鹽，做為連結物質使用鈣離子。第1液體是DAG或其鹽的水溶液。第2液體是含有鈣離子的液體培養基的濃縮液。第1液體與第2液體的體積混合比如上述，相對於第1液體的體積(V₁)100，第2液體的體積(V₂)是10至9900，佳者是100至4900。做為混合的結果所得的液狀培養基組成物中的DAG濃度，佳者是0.01%至0.05%(w/v)，最佳者是0.01%至0.03%(w/v)。做為混合的結果所得的液狀培養基組成物中的鈣離子濃度，是DAG形成構造體的濃度，通常是0.1至2.0mM左右。做為混合的結果所得的液狀培養基組成物中的培養基構成成分的濃度，是在適合培養目的細胞(例如哺乳動物細胞)的濃度範圍內。

第1液體中的DAG濃度，是對做為上述混合的結果所得的液狀培養基組成物中的DAG濃度，乘以(V₁+V₂)/V₁(即，110/100至10000/100，佳者是200/100至5000/100)所得的濃度。

第2液體中的鈣離子濃度，是對做為上述的混合的結 果所得的液狀培養基組成物中的鈣離子濃度，乘以(V₁+V₂)/V₂(即，110/10至10000/9900，佳者是200/100至5000/4900)所得的濃度。

第2液體中的培養基構成成分的濃度，是對做為上述的混合的結果所得的液狀培養基組成物中的培養基構成成分的濃度，乘以(V₁+V₂)/V₂(即，110/10至10000/9900，佳者是200/100至5000/4900)所得的濃度。

在該液狀培養基組成物中，由於含有均勻分散的DAG經由鈣離子結合而成的構造體，實質上不提高黏度，而可將細胞及/或組織均勻懸浮(佳者是懸浮靜置)。

使用由本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物，則不需要使用有引起細胞或組織的障礙或機能喪失的危險性的振盪或旋轉等操作而可將細胞及/或組織以懸浮狀態培養。再者，使用該培養基組成物，則在培養時，容易更新培養基，並且也可容易回收培養的細胞及/或組織。使用該培養基組成物，則以往需要在培養皿上以單層、黏著在細胞容器的狀態培養的細胞，可以在懸浮狀態培養，所以可以將黏著性的細胞不損失其機能而有效率的大量調製。

第1液體與第2液體的混合液，其本身是製造目的之培養基組成物也可以，在該混合液再添加添加物而成為製造目的之培養基組成物者也可以。

其次，詳細說明本發明的製造方法。

本發明的製造方法的特徴，是將第1液體與第2液體在25℃以下並高於凝固點的溫度混合。如此在低溫將兩液 混合，可製造在保存時固形凝膠的形成受抑制，安定培養基組成物。在本發明的製造方法中的混合溫度(即，第1液體與第2液體混合後的混合液溫度)越低，越能強力抑制固形凝膠的形成而為理想。混合溫度通常是25℃以下，佳者是，24℃以下，23℃以下，22℃以下，21℃以下，20℃以下，19℃以下，18℃以下，17℃以下，16℃以下，15℃以下，14℃以下，13℃以下，12℃以下，11℃以下，10℃以下，9℃以下，8℃以下，7℃以下，6℃以下，5℃以下或4℃以下。為迴避凍結，混合溫度是高於第1液體與第2液體的混合液(即，液狀培養基組成物)的凝固點的溫度，佳者是0℃以上。因此，在一方式中，混合溫度是0至25℃，佳者是0至24℃，0至23℃，0至22℃，0至21℃，0至20℃，0至19℃，0至18℃，0至17℃，0至16℃，0至15℃，0至14℃，0至13℃，0至12℃，0至11℃，0至10℃，0至9℃，0至8℃，0至7℃，0至6℃，0至5℃或0至4℃。

例如，將第1液體及第2液體分別預先冷卻至目的之混合溫度，再將這些混合而可達成上述混合溫度。使用適當的恆溫裝置(例如冷卻裝置)，將混合前的第1液體及第2液體、以及混合液的溫度，維持在目的之混合溫度也可以。或將混合操作本身在可以維持目的之混合溫度的恆溫室內實施也可以。

將第1液體與第2液體混合的順序，沒有特別限定，對第1液體添加第2液體也可以，對第2液體 添加第1液體也可以，但對第2液體添加第1液體，可更有效抑制在保存時固形凝膠的形成。例如，將第1液體與第2液體中任何一方的液體(佳者是第2液體)先放入於容器，其次將另一方的液體(佳者是第1液體)注入於容器內，而將兩者混合。

在以適當的方法攪拌下，將第1液體與第2液體混合，使第1液體與第2液體迅速混合，使特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體不會只在局部形成而在液體培養基中均勻分散為佳。做為攪拌的方法而言，可舉吸管吸取法、漩渦攪拌器、反轉混合等的手動攪拌，使用電磁攪拌器、機械攪拌器、均質混合器、均質器等的機器攪拌等，但不限定於這些。

例如，將調整在25℃以下並高於凝固點的溫度的第2液體先收容於容器，將其攪拌同時將調整在25℃以下並高於凝固點的溫度的第1液體注入於容器內，在25℃以下並高於凝固點的溫度，混合第1液體與第2液體。使用適當的恆溫裝置(例如冷卻裝置)將容器內的混合液的溫度，維持在25℃以下並高於凝固點的溫度也可以。

上述的混合操作的結果，可得到含有均勻分散的經由特定化合物連結物質結合而成的構造體之液狀培養基組成物。在由本發明的製造方法製造的培養基組成物中，可以長期間維持特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體在液體培養基中均勻分散的狀態，所以在保存時固形凝膠的形成受到抑制。理 想的方式中，將由本發明的製造方法製造的培養基組成物，在37℃以靜止狀態保管3小時的情況時，在該培養基組成物內不會形成固形的凝膠。其結果，例如，由本發明的製造方法製成的培養基組成物，藉由前述構造體，可以長期間維持實質上不提高黏度的狀態，因此在維持繼代等的優異操作性下，可在長期間將細胞懸浮靜置培養。

2.液狀培養基組成物的保存安定性的評估方法

本發明提供液狀培養基組成物的保存安定性的評估方法，前述液狀培養基組成物係以均勻分散的狀態含有前述(i)的特定化合物經由前述(ii)的連結物質結合而成的構造體，前述評估方法係包含將該培養基組成物在26℃至50℃的溫度保管3小時以上，以及調查在保管後的培養基組成物中有無固形凝膠存在。

本說明書中，以均勻分散的狀態含有特定化合物經由連結物質結合而成的構造體的液狀培養基組成物的保存安定性，意指在保存該液狀培養基組成物時，不會形成固形凝膠而安定的維持前述構造體的均勻分散狀態的該液狀培養基組成物的特性。

本項中各用語的定義，如無特別註明，與上述的「1.液狀培養基組成物的製造方法」項中所述的各用語的定義相同。

本發明的評估方法中，供進行評定的以均勻分散的狀態含有前述(i)的特定化合物經由前述(ii)的連 結物質結合而成的構造體的液狀培養基組成物的方式，如無特別註明，則與上述的「1.液狀培養基組成物的製造方法」項中所述的方式相同。

本發明的評估方法中，供評估的液狀培養基組成物的製造的方法，不限於前述本發明的製造方法。例如，將前述第1液體與前述第2液體在高於25℃的溫度混合所得的以均勻分散的狀態含有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體的液狀培養基組成物，也可供本發明的評估方法。以均勻分散的狀態含有前述(i)的特定化合物經由前述(ii)的連結物質結合而成的構造體的液狀培養基組成物，也可用WO2014/017513、US2014/0106348 A1等所述的方法製造。

在一方式中，供本發明的評估方法評估的液狀培養基組成物不含細胞或組織。

本發明的評估方法的特徴，是將評估對象的液狀培養基組成物，在26℃至50℃的溫度保管。由將保管溫度設定為26℃以上，固形凝膠的形成被加速，將前述液狀培養基組成物的長期保存時的安定性，可在短期間評估。在高於50℃的保管溫度下，固形凝膠的形成也被加速，但培養基組成物中所含的前述構造體以外的成分有變性的顧慮，所以將保管溫度設定在50℃以下為佳。在本發明的評估方法中，前述液狀培養基組成物的保管溫度之佳者是30℃至42℃，較佳者是35℃至39℃，更佳者是36℃至38℃(例如37℃)。

液狀培養基組成物的保管期間通常是3小時以上。保管期間越長，越可評估較長期的保存安定性，例如，可設定保管期間為6小時以上，12小時以上，24小時以上，2日以上，7日以上，14日以上，28日以上等。理論上，沒有保管期間的上限值。但是，由為了要縮短評估所需的期間的觀點，在一方式中，將保管期間設定為未達60日，未達28日，未達14日，未達7日，未達2日，未達24小時，未達12小時，或未達6小時等較佳。

在評估時，將評估對象的液狀培養基組成物收容於適當的容器，在全部保管期間可維持所希望的保管溫度的適當恆溫裝置內保管。做為容器而言，可舉在細胞的培養上一般所使用的培養皿、燒瓶、培養袋、微盤，及液體培養基的保存上一般所使用的瓶等，但不限定於這些。做為容器的材質而言，可舉玻璃、塑膠等，但不限定於這些。如搖動液狀培養基組成物，則固形凝膠的形成受到阻礙，所以佳者是將液狀培養基組成物以靜止狀態保管。

其次，調查保管後的培養基組成物中是否有固形凝膠存在。固形凝膠的存在通常以目視辨認。例如，將收容液狀培養基組成物的保管後的容器傾斜或反轉，調查這時在液面及與容器的境界面有無浮上來的固形凝膠存在。如亂動容器，則一度形成的固形凝膠崩壞，或前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體由固形凝膠遊離而再度在培養基組成物中分散，忽略固形凝膠存在的危險性高，所以盡可能避免與有無固形凝膠存在的評估無 關係的容器移動為佳。理想的方式中，將收容於適當的容器內的評估對象的液狀培養基組成物，在維持所希望溫度的恆溫裝置內，以靜止狀態保管所定的期間，保管製程完成後，將在該靜止狀態的容器傾斜或反轉，調查培養基組成物中固形凝膠的存在。

其結果，如在培養基組成物中沒有看到固形凝膠的存在時，比可看到固形凝膠的存在時，評估對象的液狀培養基組成物是保存安定性優異，長期間保存也不容易形成固形凝膠，可判斷具有安定維持前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體均勻分散狀態的特性。

本發明的評估方法，對液狀培養基組成物的工業生產過程中的品質管理有用，前述液狀培養基組成物係以均勻分散的狀態含有前述(i)的特定化合物經由前述(ii)的連結物質結合而成的構造體。例如，以種種方法製造以均勻分散的狀態含有前述(i)的特定化合物經由前述(ii)的連結物質結合而成的構造體之前述液狀培養基組成物。例如，上述的本發明的製造方法，或除了混合溫度不限於25℃以下並高於凝固點的溫度之點以外與本發明的製造方法相同的方法，可使用在WO2014/017513、US2014/0106348 A1等所述的方法等。工業生產的話，可製造每1批次超過100L及超過1000L體積的液狀培養基組成物。然後，採取所製造的液狀培養基組成物的一部分(例如全部體積的1%以下)做為試樣，提供予本發明的評估方法，剩 下的同一批次的培養基組成物則加以冷藏(例如0至4℃)保存。例如，將所製造的1批次的液狀培養基組成物，分注於多數的瓶(例如100支以上，1000支以上，10000支以上)。瓶中的該液狀培養基組成物的體積，每1瓶可以是例如50至500mL，佳者是400至500mL。將此瓶的一部分(例如1至10支)分離做為試樣，提供予本發明的評估方法，將剩下的同一批次的瓶加以冷藏(例如0至4℃)保存。例如，將試樣的瓶直接在26℃至50℃的溫度保管3小時以上。然後，在評估對象的培養基組成物中不能看到固形凝膠的存在時，可判斷與評估對象同一批次的液狀培養基組成物，是保存安定性優異、長期間保存也不容易形成固形凝膠、具有安定維持前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體均勻分散狀態的特性，所以冷藏保存的同一批次的培養基組成物(例如同一批次的瓶)，可對顧客出貨。

包含在這裡所陳述的專利及專利申請說明書的全部刊行物所述的內容，經由被引用在這裡，係將其全部以與明示同一左右編入於本說明書者。

以下由具體陳述本發明的製造方法及本發明的評估方法的實施例，將本發明更詳細說明，但本發明不受這些所限定。

[實施例]

(試驗例1：使用過濾器過濾的含有脫醯基化結冷膠的培養基組成物的調製法)

將脫醯基化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)在滅菌精製水(Nipro Pharma製)中懸浮成為所定的濃度(w/v)，在90℃加熱下攪拌溶解，將所得的水溶液在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘，調製成脫醯基化結冷膠水溶液。該水溶液的脫醯基化結冷膠的濃度，相對於目的之培養基組成物中的脫醯基化結冷膠濃度，係調製為1倍至10倍的濃度(通常是2倍)。

另一方面，相對於目的之培養基組成物的最終濃度，調製1倍至10倍濃度(通常是2倍)的濃縮培養基組成物。

準備脫醯基化結冷膠水溶液250mL及濃縮培養基組成物250mL。在潔淨操作檯(clean bench)內，在1L規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES，Thermo Fisher公司製)添加濃縮培養基組成物(或脫醯基化結冷膠水溶液)實施過濾器過濾，移入於系統下部的潔淨瓶中。其次在同一過濾器過濾系統添加脫醯基化結冷膠水溶液(或培養基組成物)，同樣實施過濾器過濾。在過濾時，將該瓶以手動振盪使過濾器下部的瓶內部的液體受到攪拌，將濃縮培養基組成物及脫醯基化結冷膠水溶液混合。過濾器過濾完成後，將過濾器卸下，將下部瓶的蓋子關緊後以手動攪拌約1分鐘，將2液混合而完成調製。

(試驗例2：含有脫醯基化結冷膠的培養基組成物的固形凝膠生成評估法的建立)

建立在第1圖所示的含有脫醯基化結冷膠的培養基中 固形凝膠生成的評估方法。

將含有脫醯基化結冷膠的培養基組成物50mL添加於500mL的角型培養瓶(Thermo Fisher公司製)，在37℃的恆溫箱內保管3小時以上。然後，將瓶緩慢反轉90度，將其反轉時判斷在液面及與瓶的境界面浮上的固形凝膠的存在(步驟1)。再以另外的角度反轉90度，判斷在液面及瓶的境界面浮上的固形凝膠的存在及在壁面黏著的固形凝膠的存在(步驟2)。由上述2步驟的判斷結果做為對固形凝膠生成的評估。判定如下。

沒有看到：步驟1及步驟2雙方都沒有看到固形凝膠

看到：在步驟2看到固形凝膠

明顯看到：在步驟1及步驟2雙方都看到固形凝膠

(試驗例3：水質及混合溫度對固形凝膠生成的影響)

將脫醯基化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)懸浮於滅菌精製水(Nipro Pharma公司製)或離子交換水(Milli-Q水)250mL成為0.075%(w/v)，在90℃加熱下攪拌溶解，將所得的水溶液在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘，調製成脫醯基化結冷膠水溶液(0.075%(w/v))。另一方面，在液體的TeSR-E8 basal medium(ST-05940,Stem Cell Technologies公司製)250mL，添加粉末的DMEM/F12(12400-024,Life Technologies公司製)3.90g及重碳酸氫鈉 (S5761-500G,Sigma公司製)0.30g，攪拌調製成2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)。

將冷藏或在37℃恆溫箱內保溫至使用前的2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)，在潔淨操作檯內，使用1L規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES,Thermo Fisher公司製)，實施過濾器過濾，移入於系統下部的潔淨瓶內。其次對在該過濾器過濾系統的瓶中的2倍濃縮培養基組成物，將冷藏或在37℃恆溫箱內保溫至使用前的0.075%(w/v)脫醯基化結冷膠水溶液，以試驗例1所述的方法攪拌同時以過濾器過濾添加。將上述的2倍濃縮培養基組成物及脫醯基化結冷膠水溶液保管至混合之前的溫度，統一設定為冷藏或37℃。過濾器過濾完成後，卸下過濾器，關緊下部瓶的蓋子後以手動攪拌約1分鐘使2液混合而完成調製(含有0.0375%(w/v)的脫醯基化結冷膠的TeSR-E8/DF)。

由試驗例2所述的方法，評估含有脫醯基化結冷膠的培養基中的固形凝膠生成。

將各條件下的固形凝膠生成的評估結果示於第1表。2倍濃縮培養基組成物及脫醯基化結冷膠水溶液由保管的狀態到兩者混合為止的時間是非常短，所以保管溫度與混合溫度之間沒有顯著的差異，所以在表中表示為混合溫度。

其結果，將上述的培養基組成物及去醯基結冷膠保管至評估之前的溫度是37℃時看到固形凝膠的形成，冷藏時則沒有看到。沒有看到使用水的種類對固形凝膠形成的影響。

(試驗例4：混合溫度及添加順序的比較)將脫醯基化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)懸浮於滅菌精製水(Nipro Pharma公司製)250mL成為0.075%(w/v)，在90℃加熱下攪拌溶解，將所得的水溶液在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘，調製成脫醯基化結冷膠水溶液(0.075%(w/v))。另一方面，在液體的TeSR-E8 basal medium(ST-05940,Stem Cell Technologies公司製)250mL，添加粉末的DMEM/F12(12400-024，Life Technologies公司製)3.90g及重碳酸氫鈉(S5761-500G，Sigma公司製)0.30g，攪拌調製成2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)。

(1)將脫醯基化結冷膠水溶液添加於2倍濃縮培養基組成物

將冷藏或在37℃恆溫箱內保溫至使用之前的2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)，在潔淨操作檯內，使用1L規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES，Thermo Fisher公司製)，實施過濾器過濾，移入於系統下部的潔淨瓶內。其次對在該過濾器過濾系統的瓶中的2倍濃縮培養基組成物，將在冷藏或37℃恆溫箱內保溫至使用之前的0.075%(w/v)脫醯基化結冷膠水溶液，由試驗例1所述的方法在攪拌，以過濾器過濾添加。將2倍濃縮培養基組成物及脫醯基化結冷膠水溶液保管至混合之前的溫度統一設定為冷藏或37℃。過濾器過濾完成後，卸下過濾器，關緊下部瓶的蓋子後以手動攪拌約1分鐘使2液混合而完成調製(含有0.0375%(w/v)脫醯基化結冷膠的TeSR-E8/DF)。

(2)將2倍濃縮培養基組成物添加於脫醯基化結冷膠水溶液

將冷藏或在37℃恆溫箱內保溫至使用之前的0.075%(w/v)脫醯基化結冷膠水溶液，在潔淨操作檯內，使用1L規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES,Thermo Fisher公司製)實施過濾器過濾，移入於系統下部的潔淨瓶內。其次對在該過濾器過濾系統的瓶中的0.075%(w/v)脫醯基化結冷膠水溶液，將冷藏或在37℃恆溫箱內保溫至使用之前的2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)，由試驗例1所述的方法在攪拌下以過濾器過濾添加。將2倍濃縮培養基組成物及脫醯基化結冷膠水溶液保管至混合之前的溫度統一設定為冷藏或37℃。過濾器過濾完成後，卸下過濾器，關緊下部 瓶的蓋子後以手動攪拌約1分鐘，使2液混合而完成調製(含有0.0375%(w/v)脫醯基化結冷膠的TeSR-E8/DF)。

由試驗例2所述的方法，評估含有脫醯基化結冷膠的培養基中的固形凝膠生成。

在各條件下的固形凝膠生成的評估結果示於第2表。

將在37℃加溫的脫醯基化結冷膠水溶液先添加到過濾器過濾系統、繼而將在37℃加溫的2倍濃縮培養基組成物添加於脫醯基化結冷膠水溶液使其混合的條件中，固形凝膠生成的左右最高。另一方面，要使固形凝膠的生成為最小限度的調製條件，是將冷藏的2倍濃縮培養基組成物先添加於過濾器過濾系統、繼而將冷藏的脫醯基化結冷膠水溶液添加於2倍濃縮培養基組成物使其混合的條件。

(試驗例5：過濾器過濾法的混合溫度的比較)

將脫醯基化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)懸浮於滅菌精製水(Nipro Pharma公司製)250mL成為0.075%(w/v)，在90℃加熱下攪拌溶解，將所得的水溶液在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘，調製成脫醯基化結冷膠水溶液(0.075%(w/v))。另一方面，在液體的TeSR-E8 basal medium(ST-05940,Stem Cell Technologies社公司)250mL，添加粉末的DMEM/F12(12400-024,Life Technologies公司製)3.90g及重碳酸氫鈉(S5761-500G,Sigma公司製)0.30g，攪拌調製成2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)。

(1)將脫醯基化結冷膠水溶液添加於2倍濃縮培養基組成物

將在室溫或15℃恆溫槽內保溫到使用之前的2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)，在潔淨操作檯內，使用1L規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES，Thermo Fisher公司製)，實施過濾器過濾，移入於系統下部的潔淨的瓶內。其次對在該過濾器過濾系統的瓶中的2倍濃縮培養基組成物，依照試驗例1所述的方法在攪拌下以過濾器過濾添加在室溫或15℃恆溫槽內保溫到使用之前的0.075%(w/v)脫醯基化結冷膠水溶液。將2倍濃縮培養基組成物及脫醯基化結冷膠水溶液保管到混合之前的溫度統一設定為室溫或15℃。過濾器過濾完成後，卸下過濾器，關緊下部瓶的蓋 子後以手動攪拌約1分鐘使2液混合而完成調製(含有0.0375%(w/v)脫醯基化結冷膠的TeSR-E8/DF)。

(2)將2倍濃縮培養基組成物添加於脫醯基化結冷膠水溶液

將在室溫或15℃恆溫槽內保溫到使用之前的0.075%(w/v)脫醯基化結冷膠水溶液，在潔淨操作檯內，使用1L規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES，Thermo Fisher公司製)，實施過濾器過濾，移入於系統下部的潔淨瓶內。其次對在該過濾器過濾系統的瓶中的0.075%(w/v)脫醯基化結冷膠水溶液，依照試驗例1所述的方法在攪拌下以過濾器過濾添加在室溫或15℃恆溫槽內保溫到使用之前的2倍濃縮培養基組成物(2 x TeSR/DF)。將2倍濃縮培養基組成物及脫醯基化結冷膠水溶液保管到混合之前的溫度統一設定為室溫或15℃。過濾器過濾完成後，卸下過濾器，關緊下部瓶的蓋子後以手動攪拌約1分鐘，使2液混合而完成調製(含有0.0375%(w/v)的脫醯基化結冷膠的TeSR-E8/DF)。

由試驗例2所述的方法，評估含有脫醯基化結冷膠的培養基中的固形凝膠生成。

將在各條件下的固形凝膠生成的評估結果示於第3表。

將脫醯基化結冷膠水溶液添加於過濾器過濾系統中的濃縮培養基組成物進行混合的情況時，在15℃或室溫的條件下與冷藏的混合同樣沒有看到固形凝膠的生成。另一方面，將濃縮培養基組成物添加於過濾器過濾系統中的脫醯基化結冷膠水溶液進行混合時，在15℃或室溫的條件下看到固形凝膠的生成。

[產業上的可利用性]

依據本發明的製造方法，可製造在保存時固形凝膠的形成受抑制之安定的上述培養基組成物。由本發明的製造方法所製造的培養基組成物中，特定化合物互相間經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體可長時間維持均勻分散的狀態。

本申請案是以在日本申請的特願2016-213705(申請日：2016年10月31日)做為基礎，在本說明 書中包含其全部內容。

Claims (9)

1. 一種液狀培養基組成物的製造方法，其係包含：將含有下述(i)的特定化合物之第1液體與含有下述(ii)的連結物質之第2液體，在25℃以下並高於凝固點的溫度下混合，形成以均勻分散的狀態含有前述特定化合物經由前述連結物質結合而形成的構造體的液狀培養基組成物的製程，(i)特定化合物，係具有陰離子性官能基的高分子化合物，可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。
2. 如申請專利範圍第1項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，混合溫度是15℃以下並高於凝固點。
3. 如申請專利範圍第2項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，混合溫度是4℃以下並高於凝固點。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，包含對第2液體添加第1液體之步驟。
5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述(i)的特定化合物是脫醯基化結冷膠，第1液體是含有該脫醯基化結冷膠的水溶液，前述(ii)的連結物質是鈣離子及鎂離子中的一方或 雙方，第2液體是含有鈣離子及鎂離子中的一方或雙方的液體培養基或該液體培養基的濃縮液。
6. 如申請專利範圍第5項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述液狀培養基組成物中的脫醯基化結冷膠的濃度是0.001%(w/v)至1.0%(w/v)。
7. 一種液狀培養基組成物的保存安定性之評估方法，該液狀培養基組成物係以均勻分散的狀態含有下述(i)的特定化合物經由下述(ii)的連結物質結合而成的構造體，該評估方法係包含：將該培養基組成物在26℃至50℃的溫度保管3小時以上、以及調查保管後的培養基組成物中有無固形凝膠的存在，(i)特定化合物，係具有陰離子性官能基的高分子化合物，可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。
8. 如申請專利範圍第7項所述的液狀培養基組成物的保存安定性之評估方法，其中，以靜止狀態保管前述培養基組成物。
9. 如申請專利範圍第7項或第8項所述的液狀培養基組成物的保存安定性之評估方法，其中，前述(i)的特定化合物是脫醯基化結冷膠，前述(ii)的連結物質是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方。