CN112295270B - 一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵领域，具体关于一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法；本发明首先合成了二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油，然后与一种磷酸化聚醚改性氨基硅油混合后与固体粉末反应，制备了一种适合于纤维堆囊菌发酵用的消泡剂，该种磷酸化聚醚改性氨基硅油具有枝化结构，具有很好的抗剪切能力，能适合于发酵液中的环境；另外，聚醚结构的加入有利于增加消泡剂的亲水性，增加了消泡剂在发酵液中的分散性，有利于增强消泡抑泡能力；本发明的消泡剂对于纤维堆囊菌的生长和埃博霉素产量有促进作用，是一种适合于纤维堆囊菌发酵液使用的消泡剂产品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，尤其是一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法。
背景技术
埃博霉素最早在纤维堆囊菌中发现并分离得到，发现其具有抗真菌活性，后经结构鉴定，是一类大环内酯类聚酮化合物，具有促微管聚合活性。并成为继紫杉醇之后能够对微管聚合有作用的研究热点之一。
CN101104864B涉及埃博霉素B的制备方法。具体的说，该发明提供了一种采用100升～500升发酵罐大规模发酵和大量分离制备埃博霉素B的技术方法。该发明还涉及埃博霉素B的制剂及在制备治疗格列卫耐药的慢性髓细胞性白血病药物中的应用。
CN109837225A公开了一株埃博霉素D高产菌及其在发酵产埃博霉素D中的应用，所述菌株分类命名为纤维堆囊菌(Sporangium cellulosum)SPD-1935，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M2018531，在摇床发酵实验中诱变菌株埃博霉素D达到436.27mg/L，相比于出发菌株的1.35mg/L的产量提高了323倍；同时在检测过程中发现有微量埃博霉素C存在，但是并没有发现有埃博霉素A和B的产生。经过连续5次传代培养其埃博霉素D的产量并无明显变化，表示其遗传稳定性良好。在500L发酵罐上对该菌种进行工业化发酵生产，得到其埃博霉素D的产量为451.93mg/L，相比于出发菌株提高了335倍。所以该发明菌株完全符合工业化生产埃博霉素D的生产技术指标，可用于大规模工业化发酵生产，具有重大社会意义。
CN106834377B公开了一种生产埃博霉素B的发酵方法，属于生物发酵领域。该方法在种子罐培养过程中流加氨水调节pH，得到大量种子菌体；在发酵过程中流加氨水或丙酸来调控pH，使得埃博霉素B的产量提高，简化了调控流程，降低了生产成本，利于工业化生产，具有良好的应用前景。
CN110964029A公开了一种埃博霉素B发酵液的预处理方法。该发明在发酵液中加入无机盐，使得树脂和菌体彻底分离，除去菌体后只剩树脂相，后续浸提物减少到原来的1/3，节省了进一步浸提所用的有机溶剂，也避免了菌体内杂质引入到后续的纯化过程中，从源头上去除与埃博霉素B保留时间相近的杂质。另外，经过分离后的树脂相不需要离心或板框过滤，直接装柱，不堵塞筛板，节省过柱时间。该发明所述的埃博霉素B发酵液的预处理方法，使得菌体与树脂较好的分离，简化了后续提取步骤，减少了后续浸提有机溶剂的使用量，提高了提取效率及收率，通用性强，工业化成本较低。
以上发明和现有技术表明目前生产埃博霉素主要还是靠微生物发酵得到，但是在发酵过程中，泡沫一直是困扰发酵的一个问题。如果泡沫控制不当，泡沫溢出，会造成一系列的问题：大量逃液降低装料系数，增大染菌的风险，造成原材料的浪费以及产物的损失等。因此有必要对泡沫加以控制。与其他微生物的不同之处在于，埃博霉素的生产物生物纤维堆囊菌在液体发酵过程中的泡沫很难消除，且再生能力强，大量的消泡剂的加入会影响微生物的正常生长和代谢，限制着埃博霉素的生产。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法。
一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，将8-12份的二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯，55-68份的端环氧硅油，0.8-1.6份的巯基-二聚乙二醇-丙酸叔丁酯和0.06-0.24份的1-甲基咪唑盐酸盐加入到反应釜中，搅拌速度为70-90r/min，维持体系温度120-140℃、在真空度0.06-0.09MPa减压回流条件下反应2-5h，得到二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油；完成后加入10-18份的磷酸化聚醚改性氨基硅油，18-26份的二氧化硅、3-8份的超细硅酸铝，搅拌均匀，然后升温至110-140℃，反应时间为2-5h，然后加入0.6-1.8份的丙二酸和0.2-0.8份的柠檬酸，控温80-110℃木胶板反应30-60min，完成冷却至60-80℃，加入2.1-3.6份的表面活性剂，搅拌混合30-60min后加入0.6-2.3份的乳化剂和260-340份的去离子水，快速搅拌20-45min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂。
所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油的制备方法为：
按照质量份数，将100-150份的氨基硅油，23-36份的烯丙基聚醚和0.01-0.05份的催化剂加入到反应釜中，搅拌混合均匀后升温到100-120℃，保温反应150-240min，完成后冷却至室温，然后将2.1-3.4份的五氧化二磷在60-120min内平均分成5-10份加入到反应釜中，完成后升温到80-100℃，搅拌反应1-5h，完成后降温带室温，用5％-10％的醇胺溶液将反应液pH值调节到中性，常温搅拌30-60min，然后减压除去水分，即可得到所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油。
所述的催化剂为氯铂酸或氯铂酸铵或氯铂酸钾。
所述的醇胺溶液为乙醇胺或二乙醇胺或三乙醇胺。
所述的乳化剂为吐温80或聚氧乙烯辛基苯酚醚-10。
所述的表面活性剂为油酰氧基乙磺酸钠或N-油酰基N-甲基牛磺酸钠或琥珀酸二异辛酯磺酸钠。
所述的超细硅酸铝为400-800目超细粉末。
本发明的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，本发明首先合成了二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油，然后与一种磷酸化聚醚改性氨基硅油混合后与固体粉末反应，制备了一种适合于纤维堆囊菌发酵用的消泡剂，该种磷酸化聚醚改性氨基硅油具有枝化结构，具有很好的抗剪切能力，能适合于发酵液中的环境；另外，聚醚结构的加入有利于增加消泡剂的亲水性，增加了消泡剂在发酵液中的分散性，有利于增强消泡抑泡能力；本发明的消泡剂在合适添加量的时候对于纤维堆囊菌的生长和埃博霉素产量有促进作用，是一种适合于发酵生产埃博霉素使用的消泡剂产品。
具体实施方式
下面通过具体实施例对该发明作进一步说明：
在液体M26培养基中接种纤维堆囊菌进行培养，条件为30℃，130r/min，培养至对数期。收集对数生长期的菌体，并集合于装有玻璃珠(无菌)的摇瓶中，去除大部分液体M26培养基，用磁力搅拌器打匀约10min左右，然后按照10％的接种量接种到灭菌后的发酵培养基，培养条件为30℃，130r/min，培养约7天。
发酵培养基(g/L)：马铃薯淀粉2.2，脱脂奶粉1.4，葡萄糖2.1，大豆粉2.2，MgSO4·7H2O 1.0，CaCl2 1.0，TE1mL，pH调至7.2，12℃灭菌30min。
将以下各个实施例和对比例中制备的消泡剂按照0.1％的比例添加到培养基中，发酵结束后，收集菌体用真空抽滤方法除去培养基，放入烘箱中干燥至恒重后，称量50mL发酵体积的菌体干重。每个试验3个平行；提取发酵液中的产物，用1mL甲醇萃取12h，10000r/min离心浸提液10min，然后用0.45μm滤膜过滤上清液。HPLC分析埃博霉素A，B产量。同时做空白实验。
HPLC检测条件：色谱柱Aligent C18-35μm，4.6X250mm；检测波长249nm；流动相:甲醇:水＝7:3；进样量10μL；流速为1.0mL/min；柱温35℃。
消泡能力测试方法：1L量筒中加入300ml的空白发酵培养基，向其中通氮气，流量为3L/min，当泡沫高度达到1L刻度时，向其中加入0.1％的消泡剂，记录泡沫消失的时间，此为消泡时间。
实施例1
一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，将8g二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯，55g端环氧硅油，0.8g巯基-二聚乙二醇-丙酸叔丁酯和0.06g1-甲基咪唑盐酸盐加入到反应釜中，搅拌速度为70r/min，维持体系温度120℃、在真空度0.06MPa减压回流条件下反应2h，得到二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油；完成后加入10g磷酸化聚醚改性氨基硅油，18g二氧化硅、3g超细硅酸铝，搅拌均匀，然后升温至110℃，反应时间为2h，然后加入0.6g丙二酸和0.2g柠檬酸，控温80℃木胶板反应30min，完成冷却至60℃，加入2.1g表面活性剂，搅拌混合30min后加入0.6g乳化剂和260g去离子水，快速搅拌20min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂。
所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油的制备方法为：
按照质量份数，将100g氨基硅油，23g烯丙基聚醚和0.01g催化剂加入到反应釜中，搅拌混合均匀后升温到100℃，保温反应150min，完成后冷却至室温，然后将2.1g五氧化二磷在60min内平均分成5份加入到反应釜中，完成后升温到80℃，搅拌反应1h，完成后降温带室温，用5％的醇胺溶液将反应液pH值调节到中性，常温搅拌30min，然后减压除去水分，即可得到所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油。
所述的催化剂为氯铂酸。
所述的醇胺溶液为乙醇胺。
所述的乳化剂为吐温80。
所述的表面活性剂为油酰氧基乙磺酸钠。
所述的超细硅酸铝为400目超细粉末。
实施例2
一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，将10g二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯，58g端环氧硅油，1.2g巯基-二聚乙二醇-丙酸叔丁酯和0.1.8g1-甲基咪唑盐酸盐加入到反应釜中，搅拌速度为80r/min，维持体系温度130℃、在真空度0.07MPa减压回流条件下反应3h，得到二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油；完成后加入14g磷酸化聚醚改性氨基硅油，22g二氧化硅、5g超细硅酸铝，搅拌均匀，然后升温至130℃，反应时间为3h，然后加入1.2g丙二酸和0.5g柠檬酸，控温90℃木胶板反应40min，完成冷却至70℃，加入2.8g表面活性剂，搅拌混合40min后加入1.6g乳化剂和300g去离子水，快速搅拌35min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂。
所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油的制备方法为：
按照质量份数，将130g氨基硅油，30g烯丙基聚醚和0.03g催化剂加入到反应釜中，搅拌混合均匀后升温到110℃，保温反应180min，完成后冷却至室温，然后将2.1-3.4g五氧化二磷在90min内平均分成8份加入到反应釜中，完成后升温到80-100℃，搅拌反应1-5h，完成后降温带室温，用8％的醇胺溶液将反应液pH值调节到中性，常温搅拌5min，然后减压除去水分，即可得到所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油。
所述的催化剂为氯铂酸铵。
所述的醇胺溶液为二乙醇胺。
所述的乳化剂为聚氧乙烯辛基苯酚醚-10。
所述的表面活性剂为N-油酰基N-甲基牛磺酸钠。
所述的超细硅酸铝为600目超细粉末。
实施例3
一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，将12g二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯，68g端环氧硅油，1.6g巯基-二聚乙二醇-丙酸叔丁酯和0.24g1-甲基咪唑盐酸盐加入到反应釜中，搅拌速度为90r/min，维持体系温度140℃、在真空度0.09MPa减压回流条件下反应5h，得到二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油；完成后加入18g磷酸化聚醚改性氨基硅油，26g二氧化硅、8g超细硅酸铝，搅拌均匀，然后升温至140℃，反应时间为5h，然后加入1.8g丙二酸和0.8g柠檬酸，控温110℃木胶板反应60min，完成冷却至80℃，加入3.6g表面活性剂，搅拌混合60min后加入2.3g乳化剂和340g去离子水，快速搅拌45min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂。
所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油的制备方法为：
按照质量份数，将150g氨基硅油，36g烯丙基聚醚和0.05g催化剂加入到反应釜中，搅拌混合均匀后升温到120℃，保温反应240min，完成后冷却至室温，然后将3.4g五氧化二磷在120min内平均分成10份加入到反应釜中，完成后升温到100℃，搅拌反应5h，完成后降温带室温，用10％的醇胺溶液将反应液pH值调节到中性，常温搅拌60min，然后减压除去水分，即可得到所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油。
所述的催化剂为氯铂酸钾。
所述的醇胺溶液为三乙醇胺。
所述的乳化剂为聚氧乙烯辛基苯酚醚-10。
所述的表面活性剂为琥珀酸二异辛酯磺酸钠。
所述的超细硅酸铝为800目超细粉末。
所以上实施例制备消泡剂的性能以及对发酵生产埃博霉素的影响结果如下表所示：
| 消泡时间(s) | 生物量(mg) | 埃博霉素产量(mg/L) | |
| 空白实验 | -- | 146 | 11.4 |
| 实施例1 | 3.2 | 183 | 16.2 |
| 实施例2 | 2.6 | 192 | 16.8 |
| 实施例3 | 2.2 | 198 | 17.1 |
对比例1
一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，将8g二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯，55g端环氧硅油，0.8g巯基-二聚乙二醇-丙酸叔丁酯和0.06g1-甲基咪唑盐酸盐加入到反应釜中，搅拌速度为70r/min，维持体系温度120℃、在真空度0.06MPa减压回流条件下反应2h，得到二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油；完成后加入18g二氧化硅、3g超细硅酸铝，搅拌均匀，然后升温至110℃，反应时间为2h，然后加入0.6g丙二酸和0.2g柠檬酸，控温80℃木胶板反应30min，完成冷却至60℃，加入2.1g表面活性剂，搅拌混合30min后加入0.6g乳化剂和260g去离子水，快速搅拌20min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂。
所述的乳化剂为吐温80。
所述的表面活性剂为油酰氧基乙磺酸钠。
所述的超细硅酸铝为400目超细粉末。
对比例2
一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，10g磷酸化聚醚改性氨基硅油，18g二氧化硅、3g超细硅酸铝，搅拌均匀，然后升温至110℃，反应时间为2h，然后加入0.6g丙二酸和0.2g柠檬酸，控温80℃木胶板反应30min，完成冷却至60℃，加入2.1g表面活性剂，搅拌混合30min后加入0.6g乳化剂和260g去离子水，快速搅拌20min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂。
所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油的制备方法为：
按照质量份数，将100g氨基硅油，23g烯丙基聚醚和0.01g催化剂加入到反应釜中，搅拌混合均匀后升温到100℃，保温反应150min，完成后冷却至室温，然后将2.1g五氧化二磷在60min内平均分成5份加入到反应釜中，完成后升温到80℃，搅拌反应1h，完成后降温带室温，用5％的醇胺溶液将反应液pH值调节到中性，常温搅拌30min，然后减压除去水分，即可得到所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油。
所述的催化剂为氯铂酸。
所述的醇胺溶液为乙醇胺。
所述的乳化剂为吐温80。
所述的表面活性剂为油酰氧基乙磺酸钠。
所述的超细硅酸铝为400目超细粉末。
对比例3
一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，将8g二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯，55g端环氧硅油，0.8g巯基-二聚乙二醇-丙酸叔丁酯和0.06g1-甲基咪唑盐酸盐加入到反应釜中，搅拌速度为70r/min，维持体系温度120℃、在真空度0.06MPa减压回流条件下反应2h，得到二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油；完成后加入10g磷酸化聚醚改性氨基硅油，18g二氧化硅搅拌均匀，然后升温至110℃，反应时间为2h，然后加入0.6g丙二酸和0.2g柠檬酸，控温80℃木胶板反应30min，完成冷却至60℃，加入2.1g表面活性剂，搅拌混合30min后加入0.6g乳化剂和260g去离子水，快速搅拌20min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂。
所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油的制备方法为：
按照质量份数，将100g氨基硅油，23g烯丙基聚醚和0.01g催化剂加入到反应釜中，搅拌混合均匀后升温到100℃，保温反应150min，完成后冷却至室温，然后将2.1g五氧化二磷在60min内平均分成5份加入到反应釜中，完成后升温到80℃，搅拌反应1h，完成后降温带室温，用5％的醇胺溶液将反应液pH值调节到中性，常温搅拌30min，然后减压除去水分，即可得到所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油。
所述的催化剂为氯铂酸。
所述的醇胺溶液为乙醇胺。
所述的乳化剂为吐温80。
所述的表面活性剂为油酰氧基乙磺酸钠。
对比例4
采用植物大豆油(市售金龙鱼品牌)作为消泡剂。
对比例5
采用聚乙二醇P2000(国药集团化学试剂有限公司)作为消泡剂。
对比例6
采用有机硅类消泡剂SXP101(宿州市华润化工有限责任公司)作为消泡剂。
对比例7
采用磷酸三丁酯(江苏南京中山集团公司化工厂)作为消泡剂。
所以上对比例制备消泡剂的性能以及对发酵生产埃博霉素的影响结果如下表所示：
Claims (6)
1.一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其具体方案如下：
按照质量份数，将8-12份的二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯，55-68份的端环氧硅油，0.8-1.6份的巯基-二聚乙二醇-丙酸叔丁酯和0.06-0.24份的1-甲基咪唑盐酸盐加入到反应釜中，搅拌速度为70-90r/min，维持体系温度120-140℃、在真空度0.06-0.09MPa减压回流条件下反应2-5h，得到二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯改性硅油；完成后加入10-18份的磷酸化聚醚改性氨基硅油，18-26份的二氧化硅、3-8份的超细硅酸铝，搅拌均匀，然后升温至110-140℃，反应时间为2-5h，然后加入0.6-1.8份的丙二酸和0.2-0.8份的柠檬酸，控温80-110℃搅拌反应30-60min，完成冷却至60-80℃，加入2.1-3.6份的表面活性剂，搅拌混合30-60min后加入0.6-2.3份的乳化剂和260-340份的去离子水，快速搅拌20-45min，即可得到所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂；
所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油的制备方法为：
按照质量份数，将100-150份的氨基硅油，23-36份的烯丙基聚醚和0.01-0.05份的催化剂加入到反应釜中，搅拌混合均匀后升温到100-120℃，保温反应150-240min，完成后冷却至室温，然后将2.1-3.4份的五氧化二磷在60-120min内平均分成5-10份加入到反应釜中，完成后升温到80-100℃，搅拌反应1-5h，完成后降温至 室温，用5％-10％的醇胺溶液将反应液pH值调节到中性，常温搅拌30-60min，然后减压除去水分，即可得到所述的磷酸化聚醚改性氨基硅油。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其特征在于：所述的催化剂为氯铂酸或氯铂酸铵或氯铂酸钾。
3.根据权利要求1所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其特征在于：所述的醇胺溶液为乙醇胺或二乙醇胺或三乙醇胺。
4.根据权利要求1所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其特征在于：所述的乳化剂为吐温80或聚氧乙烯辛基苯酚醚-10。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其特征在于：所述的表面活性剂为油酰氧基乙磺酸钠或N-油酰基N-甲基牛磺酸钠或琥珀酸二异辛酯磺酸钠。
6.根据权利要求1所述的一种发酵生产埃博霉素用消泡剂的制备方法，其特征在于：所述的超细硅酸铝为400-800目超细粉末。
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