CN112273226A - 一种葛组织培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种葛组织培养的方法，涉及植物组培技术领域。本发明所述方法利用葛藤茎节建立组培体系，可以有效增加种植成活率，可以节约繁殖材料，繁殖后代能保持原有品种的优良性状，且可进行工厂化生产，并且组培苗易保存，便于运输，种植后不分化，对后期葛生产和资源保存提供了保障。

Description

一种葛组织培养的方法
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种葛组织培养的方法。
背景技术
葛属于豆科葛属，是我国具有悠久历史药食两用的植物，主要分布在我国江西、广东、浙江等地，近年来由于市场上需求量增加，人工种植面积也逐渐增加。葛种植主要采用扦插苗收获块根，由于扦插自身易老化，易出现疾病。基于此，科研工作者将目光投入葛的组织培养上，但是利用现有的组织培养技术，培养得到的葛组培苗质量低下，无法满足生产需要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种葛组织培养的方法，可快速得到大量高质量的葛组培苗，满足生产需要；同时为葛种质资源的保存和资源的快速繁育建立一套新型体系，并提供理论依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种葛组织培养的方法，包括以下步骤：(1)以1年生葛藤茎节为外植体，经消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～2mg/L 6-BA和0.5～1.5mg/LNAA；
(2)将所述不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，得增殖芽；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～1.5mg/L6-BA和0.1～1mg/LNAA；
(3)将所述增殖芽接种到生根培养基上进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0～0.5mg/LNAA。
优选的，步骤(1)所述消毒包括将葛藤置于流水下冲洗30min后，在无菌环境中，用体积百分含量为75％的乙醇水溶液消毒30s后，依次用蒸馏水清洗、升汞消毒和蒸馏水清洗；所述升汞消毒为利用质量百分含量为0.1％的升汞水溶液清洗20min；所述蒸馏水清洗均为用蒸馏水洗3～5次。
优选的，步骤(1)所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1.5mg/L 6-BA和1mg/LNAA。
优选的，步骤(2)所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA。
优选的，步骤(3)所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0.5mg/LNAA。
优选的，步骤(1)所述诱导培养、步骤(2)所述增殖培养和步骤(3)所述生根培养均为光照培养，所述光照培养的光照时间为16h/d，光照强度为2400lx；所述光照培养的温度为25+2℃。
优选的，在步骤(3)得到所述生根苗后，还包括炼苗和移栽。
优选的，所述移栽的移栽基质包括蛙石、珍珠岩和泥炭的混合物，所述蛙石、珍珠岩和泥炭的体积比为3:2:1。
本发明提供了一种葛组织培养的方法，利用葛藤茎节建立组培体系，可以有效增加种植成活率，可以节约繁殖材料，繁殖后代能保持原有品种的优良性状，且可进行工厂化生产，并且组培苗易保存，便于运输，种植后不分化，对后期葛生产和资源保存提供了保障。利用本发明所述方法，将茎节进行诱导培养20d后，可得到青绿色、较饱满的不定芽，诱导率达38.33～80.55％，在不定芽长大20d后，芽体长至2～3cm；将诱导出的健康、优质不定芽接种至增殖培养基中增殖培养20d，苗嫩绿色，生长状况较好，诱导率达66.66～91.66％；将培养出的健壮、适高2～3cm左右的单个继代芽分别接入不同的生根培养基中生根培养20d，生根率可达68.75～84.38％。
具体实施方式
本发明提供了一种葛组织培养的方法，包括以下步骤：(1)以1年生葛藤茎节为外植体，经消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～2mg/L 6-BA和0.5～1.5mg/LNAA；
(2)将所述不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，得增殖芽；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～1.5mg/L 6-BA和0.1～1mg/LNAA；
(3)将所述增殖芽接种到生根培养基上进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0～0.5mg/LNAA。
本发明以1年生葛藤茎节为外植体，经消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～2mg/L6-BA和0.5～1.5mg/LNAA。本发明所述消毒优选包括将葛藤置于流水下冲洗30min后，在无菌环境中，用体积百分含量为75％的乙醇水溶液消毒30s后，依次用蒸馏水清洗、升汞消毒和蒸馏水清洗；所述升汞消毒为利用质量百分含量为0.1％的升汞水溶液清洗20min；所述蒸馏水清洗均为用蒸馏水洗3～5次。本发明将外植体消毒后接种于所述诱导培养基上，所述接种优选的包括将消毒后的外植体切除腋芽，然后切成长0.8～1.2cm的小段进行接种，每瓶接种4个茎节小段。本发明所述诱导培养基以MS为基本培养基，优选还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1.5mg/L 6-BA和1mg/LNAA，利用所述诱导培养基进行诱导，诱导率可达80.55％。本发明所述诱导培养优选为光照培养，所述光照培养的光照时间优选为16h/d，光照强度为2400lx；所述诱导培养的温度优选为25+2℃。本发明所述诱导培养的时间优选为20d。在本发明中，不定芽长大30d后，芽上基本都会长出2～3片叶片，甚至3～4片。本发明对所述诱导培养基中的各组分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售试剂即可。
本发明将所述不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，得增殖芽；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～1.5mg/L 6-BA和0.1～1mg/LNAA。本发明优选上述诱导出的健康、长至2-3cm的不定芽进行增殖培养，本发明所述增殖培养优选为光照培养，所述光照培养的光照时间优选为16h/d，光照强度为2400lx；所述增殖培养的温度优选为25+2℃。本发明所述增殖培养的时间优选为30d。本发明所述增殖培养用的增殖培养基以MS为基本培养基，优选还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA，利用本发明所述增殖培养基，最高可达91.66％的诱导率。本发明对所述增殖培养基的组分来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售试剂即可。
本发明将所述增殖芽接种到生根培养基上进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0～0.5mg/LNAA。本发明优选芽增殖长到30d后，选苗高2～4cm的植株接入生根培养基中进行生根培养，所述生根培养优选为光照培养，所述光照培养的光照时间优选为16h/d，光照强度为2400lx；所述生根培养的温度优选为25+2℃。本发明所述生根培养的时间优选为20d。本发明所述生根培养基以MS为基本培养基，优选还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0.5mg/LNAA，利用所述生根培养基进行20d的生根培养后，根粗壮，生根数多，侧根数多，根黄褐色；生根苗长势旺盛，苗高4～5cm，青绿色，叶片直径0.5cm左右。本发明对所述生根培养基的各组分来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售试剂即可。
本发明在得到所述生根苗后，优选还包括炼苗和移栽。本发明优选将生根苗的培养瓶口打开2～3d使其适应外界环境，然后将生根苗移出瓶外，以20～25℃温水洗去残留培养基；后将苗移栽至移栽基质中。本发明所述移栽基质优选为蛙石、珍珠岩和泥炭的混合物，且所述蛙石、珍珠岩和泥炭的体积比为3：2：1。本发明在应用所述移栽基质前，优选将所述移栽基质在121℃灭菌锅中，高温灭菌，冷却后用营养钵盛装，移栽前先用自来水浇透基质，压实后插入苗，再将根际部压实。本发明优选在移栽过程中不时进行喷雾，防止小苗失水萎蔫，移栽完毕后，在营养钵上罩上透明塑料袋保湿，以后每天喷雾以保持基质和空气湿润。本发明在所述移栽10d以后逐渐揭开塑料袋，继续炼苗，观察苗的生长状况，并给予充足的光照和正常的水肥管理。本发明对所述组培苗的室外栽培的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规葛栽培方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的葛组织培养的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1试验材料与方法
1.1试验材料
本试验以江西省江西农业大学人工种植的赣葛2号为材料，取其生长健壮1年生葛藤上的茎节作为外植体进行试验。
1.2试验方法
1.2.1出芽诱导外植体的前处理及接种
将葛藤置于流水下冲洗30min后，转入超净台，先用75％酒精消毒30s，然后用蒸馏水洗3～5次，接着用0.1％升汞洗20min，最后用蒸馏水洗3～5次进行接种。消毒处理后，茎节切除腋芽，切成长1cm茎段，每瓶4个茎段，每个处理9瓶进行诱导培养。
1.2.2增殖培养基的筛选
为了达到较高的芽增殖数，本实验选用诱导出的健康、优质不定芽作为外植体，接种不同种类和浓度的激素培养基进行芽增殖培养，每个处理接种9瓶，每瓶接种4个外植体。
1.2.3生根培养和移栽
当增殖芽长至2～3cm时移至生根培养基上诱导生根。本试验用NAA进行生根试验。待生根苗长至20d，同时苗长有主根和侧根，则移至营养钵中培养。
1.2.4培养条件
培养瓶内培养时，均以MS为基本培养基，加入30g/L的蔗糖，6.5g/L的琼脂，pH值为5.8，附加不同种类和浓度的激素。接种后均放置培养室，光照时间16h/d，光照强度2400lx，培养温度25+2℃进行培养。
1.3数据统计
每天观察外植体长势，每周记载茎节污染数、褐化数、死亡数、出芽数、芽分化情况和生根情况等，培养20、30d后统计不定芽的诱导率以及芽苗的高度、根的长势等。用Excel处理数据。
污染率＝(污染的块数/接种块数)×100％；
诱导率＝(出芽的茎节块数/接种块数)×100％；
生根率＝(出根块数/接种块数)×100％。
2结果与分析
2.1茎节诱导培养基浓度配比
将消毒好的茎节接种于诱导培养基上，最早7～10d茎节上侧芽转绿，15d左右芽体膨大，20左右长出不定芽，30d时芽体长至2～3cm。附加不同浓度激素组合下的不定芽诱导情况如下表1所示。
表1茎节诱导培养培养基浓度配比
Figure BDA0002484978910000061
**污染率、出芽块数、诱导率和平均芽数的统计都是在不定芽出现30d；平均芽数是指每块出芽茎节的芽平均数。
经观察发现A2、A3、A5和A6诱导葛茎节不定芽出芽的诱导率较高，生长状况良好，芽饱满，绿色，可发展成小苗，尤其是处理A5，诱导率达80.55％，而且污染、褐化和直接死亡的块数较少，后期芽萌动较其它处理快，粗壮，颜色浓绿。处理A4、A7观察得出，6-BA和NAA浓度相同，茎节接入后易褐化和死亡。不定芽诱导同时插入培养基一端的伤口会逐渐长出愈伤组织，部分表现出褐化，有的严重褐化。处理A2、A5、A7和A3、A6、A8发现相同浓度NAA培养基，6-BA浓度越高，茎节伤口周围产生愈伤组织越多，愈伤组织越多，芽的长势较其它处理弱。相同浓度6-BA培养基中NAA没有表现出明显的特征。在不定芽长大30d后，芽上基本都会长出2～3片叶片，甚至有的3～4片，可进行继代培养。
2.2不定芽增殖培养
待2.1培养出的不定芽长至2～3cm时，移至增殖培养基进行培养，培养基配比见表2。接种培养30d时统计并计算试管芽分化情况(污染数、出芽数、诱导率、污染率)和芽苗生长高度等。
表2增殖培养基配比
Figure BDA0002484978910000062
Figure BDA0002484978910000071
试验发现：B1、B2、B4处理诱导率较高，芽嫩绿色，生长状况较好，尤其是处理B4诱导率达到91.66％，而且接种后芽最多可分化出6个，芽无死亡，芽长势良好，可发育成绿色小苗。B2和B4处理芽苗在生长过程中，表现为叶片大，叶色浓绿，茎粗，非常适宜于生根培养。B3和B5较其它处理周围会分化出较多的愈伤组织，不利于芽的分化。
2.3不定根诱导和移栽
将2.2培养出的健壮、适高2～3cm的单个继代芽分别接入不同的生根培养基中，诱导生根，实验结果见表3。接种培养20d时统计并计算生根数和生根率等。
表3生根培养基配比
Figure BDA0002484978910000072
观察发现，C2生根诱导率好于C1，而且试管苗长势旺盛，根系发达，主、须根分明且主根长，苗长势好，苗高，叶片大，叶色深绿。培养10d后，随着根系的形成和生长，试管苗迅速生长，培养到20d时，生根苗就可长成高4cm以上、生长成非常健壮的试管苗。
将生根组培苗培养瓶口打开2～3d使其适应外界环境，然后将生根苗移出瓶外，以20～25℃温水洗去残留培养基。后将苗移栽至基质中。培养基质为蛙石、珍珠岩和泥炭的混合物(蛙石：珍珠岩：泥炭＝3：2：1)。将基质在121℃灭菌锅中，高温灭菌，冷却后用营养钵盛装，移栽前先用自来水浇透基质，压实后插入苗，再将根际部压实。移栽过程中不时进行喷雾，防止小苗失水萎蔫。移栽完毕后，在营养钵上罩上透明塑料袋保湿，以后每天喷雾以保持基质和空气湿润。10d以后逐渐揭开塑料袋，继续炼苗，观察苗的生长状况，并给予充足的光照和正常的水肥管理。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种葛组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以1年生葛藤茎节为外植体，经消毒后接种于诱导培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～2mg/L 6-BA和0.5～1.5mg/LNAA；
(2)将所述不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，得增殖芽；所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1～1.5mg/L 6-BA和0.1～1mg/LNAA；
(3)将所述增殖芽接种到生根培养基上进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0～0.5mg/LNAA。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述消毒包括将葛藤置于流水下冲洗30min后，在无菌环境中，用体积百分含量为75％的乙醇水溶液消毒30s后，依次用蒸馏水清洗、升汞消毒和蒸馏水清洗；所述升汞消毒为利用质量百分含量为0.1％的升汞水溶液清洗20min；所述蒸馏水清洗均为用蒸馏水洗3～5次。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1.5mg/L 6-BA和1mg/LNAA。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述增殖培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、1mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括：6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖和0.5mg/LNAA。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导培养、步骤(2)所述增殖培养和步骤(3)所述生根培养均为光照培养，所述光照培养的光照时间为16h/d，光照强度为2400lx；所述光照培养的温度为25+2℃。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(3)得到所述生根苗后，还包括炼苗和移栽。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述移栽的移栽基质包括蛙石、珍珠岩和泥炭的混合物，所述蛙石、珍珠岩和泥炭的体积比为3:2:1。
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