CN112251367A

CN112251367A - 好氧脱氮制剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112251367A
Application number: CN201910661583.5A
Authority: CN
Inventors: 刘志培; 高喜燕; 刘缨; 苗莉莉
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: CN112251367B

Abstract

本发明提供一种好氧脱氮制剂及其制备方法与应用。所述好氧脱氮制剂是将假单胞菌AOB‑7接入含有生物可降解材料的培养基中发酵培养，所得发酵产物作为好氧脱氮制剂。菌株AOB‑7是一株能利用PHAs作为固体缓释碳源及载体进行高效好氧脱氮的假单胞菌，基于菌株AOB‑7开发出以PHA颗粒作为固体缓释碳源和生物膜载体的新型好氧脱氮制剂，这种新型好氧脱氮制剂可以直接添加到低碳氮比水体(如水产养殖池)中而改善水质，在好氧脱氮过程中能产生气态氮产物，将水体中积累的硝酸盐氮转化为气体，实现彻底脱氮。另外，这种新型好氧脱氮制剂在好氧脱氮过程中能产生对水产养殖动物具有免疫调节作用的3‑羟基丁酸。

Description

好氧脱氮制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体地说，涉及一种好氧脱氮制剂及其制备方法与应用，特别是在水产养殖循环水脱氮中的应用。

背景技术

近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，高密度的水产养殖方式在世界各地蓬勃发展。循环水养殖系统(Recirculating aquaculture system,RAS)因其高度集约化，环境友好，节省资源，可控养殖，以及产量高等优势在国内外得到了广泛应用。氨氮是水产养殖动物产生的最主要的代谢废物，当氨氮以分子氨状态存在时，会对水产养殖动物产生很强的神经性毒害，急性氨中毒正是养殖水体中极其严重的危害之一。循环水产养殖系统就是通过生物滤器的硝化过程将氨氮氧化成硝态氮。然而，由于排放的废水较少，加之持续进行的硝化过程，导致循环水养殖系统中硝酸盐氮的积累。与氨氮和亚硝酸盐相比，虽然硝酸盐对养殖物种的暂时应激效应相对较低，但对水产养殖动物的长期威胁仍然存在。因此，硝酸盐去除已成为水产养殖中不可避免的潜在问题。

RAS中的硝酸盐浓度取决于换水率和微生物的脱氮效率。好氧反硝化脱氮是细菌利用有机碳作为电子供体，利用氮氧化物如硝酸盐作为电子受体，将硝酸盐依次还原为亚硝酸、NO、N₂O和氮气。由于水产养殖水为微污染水，水中可利用的碳源浓度低，是好氧反硝化顺利进行的限制因素。因此，循环水养殖系统中好氧反硝化的顺利进行，常常需要补充合适的外加碳源作为电子供体。目前在循环水养殖水处理中常用的外加碳源有：甲醇、乙酸盐、糖类等。

目前为止，在循环水养殖水处理中常用的外加碳源一般是水溶性的，极易被微生物利用，需要精密控制投加的剂量以防止有毒物质的形成。此外，这类外加碳源自身没有选择性，可以被任何微生物包括病原微生物利用。因此水质和生态平衡可能受到影响或干扰。一个有效的替代方案是应用不溶性固体缓释碳源作为电子供体进行好氧反硝化过程。固体缓释碳源能够缓慢持续地释放或仅被特定的微生物降解，这不仅达到了碳源稳定供应的目的，而且为微生物提供了生长附着的场所，提高了污染物的去除效果。

聚3-羟基链烷酸酯(PHA)是在许多细菌的不平衡生长期间合成和积累的结构简单的大分子。它们的特征是不溶于水，无毒，并且可被微生物降解。在RAS中使用PHA作为持续释放碳源需要较少的控制，并且可以降低系统运转的管理成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种缓释碳源新型好氧脱氮制剂及其制备方法与应用，特别是在水产养殖循环水脱氮中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)AOB-7，其保藏编号为CGMCC No.17900。菌株AOB-7是利用DM-PHAs培养基经过大量初筛、复筛获得的可降解PHAs的一株假单胞菌。

第二方面，本发明提供假单胞菌AOB-7或其菌剂、粗酶液的以下任一应用：

1)用于低碳氮比水体脱氮处理；

2)用于制备好氧脱氮制剂；

3)用于3-羟基丁酸(3-HB)的发酵生产；

4)用于生物可降解材料的降解；

其中，所述生物可降解材料包括但不限于PHA，优选PHB、PHBV。

第三方面，本发明提供一种使用PHA(或称PHAs颗粒)作为固体缓释碳源和生物膜载体的新型好氧脱氮制剂，这种新型好氧脱氮制剂可以直接添加到水产养殖池中而改善养殖池水质。该新型好氧脱氮制剂的制备方法包括：将假单胞菌AOB-7接入含有生物可降解材料(PHA)的培养基中发酵培养，所得发酵产物可作为好氧脱氮制剂。

进一步地，所述好氧脱氮制剂的制备方法包括以下步骤：

将假单胞菌AOB-7接种于LB液体培养基培养24-36h后，6000-8000g离心10-15min后弃上清，用无菌生理盐水清洗菌体，然后用生理盐水配制OD₆₀₀＝1～1.5的菌悬液，所得菌悬液按照1-2％v/v的接种量接种于含70～140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHA培养基中，于25～30℃、120～160rpm条件下摇床培养60-72h，取出培养体系中的PHA颗粒，所得PHA颗粒即为好氧脱氮制剂，命名为PHAs(AOB-7)。

优选地，将假单胞菌AOB-7接种于LB液体培养基培养24h后，8000g离心15min后弃上清，用无菌生理盐水清洗菌体，然后用生理盐水配制OD₆₀₀＝1～1.5的菌悬液，所得菌悬液按照1％v/v的接种量接种于含70～140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHA培养基中，于25～30℃、120～160rpm条件下摇床培养2h，取出培养体系中的PHA颗粒，所得PHA颗粒即为好氧脱氮制剂。

其中，所述含70～140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHAs培养基的组成如下：每升培养基中，KNO₃ 0.5～1.0g，PHA 1.5g～3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.10～0.20g，CaCl₂ 0.005～0.01g，KH₂PO₄0.50～0.80g，Na₂HPO₄ 0.50～0.80g，FeSO₄ 0.01～0.02g，NaCl 10.00～30.00g，微量元素1.00-2.00mL，pH 7.0～7.5；所述微量元素组成如下：48.20～57.10g/L EDTA·2Na，2.80～3.90g/L ZnSO₄·7H₂O，5.00～7.00g/L CaCl₂·2H₂O，0.50～1.00g/L MnCl₂·4H₂O，3.00～5.00g/L FeSO₄·7H₂O，0.75～1.10g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.90～1.60g/L CuSO₄·5H₂O，0.90～1.60g/L CoCl₂·6H₂O，pH 6.0～6.5。

本发明提供的好氧脱氮制剂，其菌含量为3.23×10⁸～1.41×10⁹CFU/g。

当DM-PHA培养基中使用的PHA为PHB时，所得好氧脱氮制剂命名为PHB(AOB-7)，即PHB型，其菌含量优选为1.41×10⁹CFU/g左右。

当DM-PHA培养基中使用的PHA为PHBV时，所得好氧脱氮制剂命名为PHBV(AOB-7)，即PHBV型，其菌含量优选为3.23×10⁸CFU/g左右。

第四方面，本发明提供所述好氧脱氮制剂在低碳氮比水体脱氮处理中的应用。

第五方面，本发明提供一种低碳氮比水体脱氮处理方法，所述方法包括：向低碳氮比水体中加入固体缓释碳源，然后接入假单胞菌AOB-7或其菌剂，进行好氧反硝化脱氮处理。或者，

向低碳氮比水体中加入上述任一种或多种好氧脱氮制剂，进行好氧反硝化脱氮处理。

第六方面，本发明提供上述方法在改善水产养殖池水质中的应用。所述改善水质包括脱氮、增加水中3-羟基丁酸的含量。

所述缓释碳源新型好氧脱氮制剂使用方式包括：(1)直接加入循环水养殖系统的养殖池单元，改善养殖池水质；(2)加入到循环水养殖系统的生物滤器单元，在生物处理环节发挥作用改善系统水质。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供一株能利用PHAs作为固体缓释碳源及载体进行高效好氧脱氮的假单胞菌AOB-7，在此基础上开发出新型高效的缓释碳源好氧脱氮制剂PHAs(AOB-7)。其中PHB、PHBV颗粒经AOB-7利用后，表面结构布满孔洞缝隙，适合作为菌株AOB-7的生物膜载体，利于菌株AOB-7的深度附着。

(二)本发明提供的好氧脱氮制剂可以利用固体缓释碳源实现高效率的脱氮，PHB型好氧脱氮制剂60h的硝酸盐氮去除率为100％；PHBV型好氧脱氮制剂96h的硝酸盐氮去除率为92.14％左右。

(三)利用本发明的好氧脱氮制剂，在好氧脱氮过程中能产生气态氮产物，将循环水养殖系统中积累的硝酸盐氮转化为气体，实现彻底脱氮。

(四)利用本发明的好氧脱氮制剂，在好氧脱氮过程中能产生3-羟基丁酸，而3-羟基丁酸对水产养殖动物具有显著的免疫调节作用。

附图说明

图1为本发明实施例2中菌株AOB-7的生长、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度变化情况。其中，A：DM-PHB中菌株AOB-7的生长、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度变化；B：DM-PHBV中菌株AOB-7的生长、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度变化。

图2为本发明实施例3中菌株AOB-7利用PHB、PHBV好氧脱氮过程中产气态产物的检测结果。

图3为本发明实施例4中菌株AOB-7利用PHB过程中产3-羟基丁酸的检测结果。其中，A：菌株AOB-7利用PHB过程中产3-羟基丁酸的液相色谱峰，B：菌株AOB-7利用PHB过程中产3-羟基丁酸的质谱峰。

图4为本发明实施例5中PHB型好氧脱氮制剂的表面形态。

图5为本发明实施例5中PHBV型好氧脱氮制剂的表面形态。

图6为本发明实施例7中PHB型好氧脱氮制剂在斑马鱼养殖循环水中的脱氮应用效果。其中，C代表对照组，T代表实验组。

图7为本发明菌株AOB-7基因组中的PHA合成酶基因。其中，1对应的箭头为PHA合成酶基因。菌株AOB-7基因组中共含有4个PHA合成酶基因。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明涉及的术语：

PHAs：聚羟基链烷酸酯；

PHB：聚3-羟基丁酸酯；

PHBV：聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)；

NH₄ ⁺-N：游离态氨；

NO₃ ^--N：硝态氮。

以下实施例中使用的PHAs颗粒、PHB颗粒及PHBV颗粒均为德国巴斯夫公司生产，商品编号分别为1001MD、HF001。

实施例1PHAs降解菌株AOB-7的筛选

PHAs降解菌株AOB-7通过在DM-PHAs培养基中筛选获得。具体如下：

以PHAs配制DM-PHAs培养基。DM-PHAs每升溶液组成如下：KNO₃ 1.00g，PHAs颗粒3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.20g，CaCl₂ 0.01g，KH₂PO₄ 0.50g，Na₂HPO₄ 0.50g，FeSO₄0.01g，NaCl10.00g，微量元素1.00mL，pH 7.2。上述微量元素组成如下：57.10g/L EDTA·2Na，3.90g/LZnSO₄·7H₂O，7.00g/L CaCl₂·2H₂O，1.00g/L MnCl₂·4H₂O，5.00g/L FeSO₄·7H₂O，1.10g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，1.60g/L CuSO₄·5H₂O，1.60g/L CoCl₂·6H₂O，pH 6.0。

在LB液体培养基中活化培养待筛选菌株，30℃、150rpm摇床培养24h后，8000g离心10min后弃上清，然后用0.9％生理盐水清洗三次菌体，最后用生理盐水配制OD₆₀₀＝1的菌悬液，所得菌悬液按照1％v/v的接种量接种至DM-PHAs培养基中，根据菌株是否能利用DM-PHAs中的PHAs固体颗粒生长，最终筛选获得PHAs降解菌株AOB-7。

菌株AOB-7的微生物学特征及生理生化特性：杆菌，0.7～0.8μm×1.4～2.8μm，革兰氏阴性，单极鞭毛，可运动；具有酯酶活性、类脂酯酶活性、类脂酶活性、白氨酸芳胺酶活性、胱氨酸芳胺酶活性、酸性磷酸酶活性、萘芬-AS-BI-磷酸水解酶活性、α-半乳糖苷酶活性；可以还原硝酸盐、脲酶和精氨酸水解酶活性为阳性，能利用葡萄糖、果糖、淀粉、肝糖、葡萄糖酸盐、麦芽糖、癸酸、苹果酸、柠檬酸。

经16S rDNA测序(SEQ ID NO:1)，根据测序结果以及上述微生物学特征及生理生化特性，将该菌鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。菌株AOB-7现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.17900，保藏日期2019年6月5日。

本发明菌株AOB-7的基因组中含有编码PHA合成的基因(图7)。菌株AOB-7既具有胞内解聚酶，又具有胞外解聚酶，既可以利用自身合成的胞内PHA，也可以利用胞外的PHA颗粒。

实施例2PHAs降解菌株AOB-7利用PHB、PHBV为唯一碳源的好氧脱氮特性检测

将PHAs降解菌株AOB-7接种至DM-PHB或DM-PHBV培养基中，25～30℃、120-150rpm摇床培养84～108h，每隔12h检测培养体系中菌体OD₆₀₀值、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的浓度变化，根据是否有硝酸盐还原为亚硝酸盐，确定其好氧反硝化脱氮的特性。

菌株AOB-7的生长、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度变化如图1所示，在DM-PHB和DM-PHBV培养基中分别培养4天后，OD₆₀₀达到最大值，分别为4.2和2.6。通过平板菌落计数法进一步验证OD₆₀₀值。DM-PHB和DM-PHBV中的总菌落形成单位分别为1.41×10⁹CFU/mL和3.23×10⁸CFU/mL。

在DM-PHB中几乎没有亚氮积累阶段，培养36h后亚氮浓度逐渐增加，然后迅速下降。在DM-PHBV中观察到亚硝酸盐在第36至第84h有短暂的积累阶段，浓度约为20mg/L。

在DM-PHB中利用PHB为固体缓释碳源时60h的硝酸盐氮去除率为100％；在DM-PHBV中利用PHBV为固体缓释碳源时，96h的硝酸盐氮去除率为92.14％。硝酸盐氮去除速率分别为0.56±0.15mg NO₃ ^--N L^-1d^-1和0.35±0.10mg NO₃ ^--N L^-1d^-1。

DM-PHB培养基组成如下：KNO₃ 1.00g，PHB颗粒3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.20g，CaCl₂0.01g，KH₂PO₄ 0.50g，Na₂HPO₄ 0.50g，FeSO₄ 0.01g，NaCl 10.00g，微量元素1.00mL，pH 7.2。上述微量元素组成如下：57.10g/L EDTA·2Na，3.90g/L ZnSO₄·7H₂O，7.00g/L CaCl₂·2H₂O，1.00g/L MnCl₂·4H₂O，5.00g/L FeSO₄·7H₂O，1.10g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，1.60g/LCuSO₄·5H₂O，1.60g/L CoCl₂·6H₂O，pH 6.0。

DM-PHBV培养基组成如下：KNO₃ 1.00g，PHBV颗粒3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.20g，CaCl₂0.01g，KH₂PO₄ 0.50g，Na₂HPO₄ 0.50g，FeSO₄ 0.01g，NaCl 10.00g，微量元素1.00mL，pH 7.2。上述微量元素组成如下：57.10g/L EDTA·2Na，3.90g/L ZnSO₄·7H₂O，7.00g/L CaCl₂·2H₂O，1.00g/L MnCl₂·4H₂O，5.00g/L FeSO₄·7H₂O，1.10g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，1.60g/LCuSO₄·5H₂O，1.60g/L CoCl₂·6H₂O，pH 6.0。

实施例3PHAs降解菌株AOB-7利用PHB、PHBV好氧脱氮过程中产气态产物的检测

上述好氧反硝化过程表明菌株AOB-7能进行高效的好氧反硝化途径，可能发生了NO₃ ^--N或NO₂ ^--N转化为气态氮。为了验证这种推测，进行GC-MS和GC-IRMS分析以鉴定通过好氧反硝化途径产生了N₂O和N₂。

对脱氮过程的气态产物N₂和N₂O的检测是确定该菌株是否具有脱氮功能最确凿最直接的证据。由于空气中存在着大量的N₂，通过反硝化途径产生的N₂量较少，单纯通过检测N₂量的变化并不能说明问题，因此结合同位素标记，通过检测样品中同位素比的变化来验证N₂的产生与否。空气中N₂O的量很少，可以通过检测量的变化来确定N₂O的产生。

气体样品的制备方法如下：分别用30％～50％K¹⁵NO₃标记的DM-PHB培养基100mL在厌氧瓶中密封培养AOB-7菌株，25～30℃，120-160rpm培养5～7d，抽取上层气体5～10μL上样，采用稳定同位素比质谱(GC-IRMS)技术、气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分别进行N₂、N₂O的检测。

通过GC/MS检测反硝化的中间产物N₂O，结果如图2所示，当以硝酸盐为底物、以PHB和PHBV颗粒作为唯一碳源进行反硝化过程中，产生了N₂O。在相同气体上样量的情况下，DM-PHB中的N₂O丰度为2000，高于DM-PHBV中的1200。

实施例4PHAs降解菌株AOB-7利用PHB过程中产3-羟基丁酸的检测

将PHAs降解菌株AOB-7接种至以PHB为唯一碳源的DM-PHB培养基中，30℃160rpm摇床培养48h后发酵液于4℃，8000g离心15min，离心后的上清液通过无菌过滤器过滤即得到胞外解聚酶的粗酶液，取粗酶液1mL加入至20mL灭菌的以PHB为唯一碳源的DM培养基中，30℃反应12h后，将所得酶反应液稀释20倍之后，取2μL上样三重四极杆液相色谱-质谱联用仪进行酶解产物的质谱鉴定。

通过液相色谱质谱联用技术检测粗酶液的加入在DM-PHB中产生的胞外酶解产物，如图3所示，质谱检测到了m/z 103所代表的3-羟基丁酸单体，以及m/z 189所代表的3-羟基丁酸二聚体。根据HPLC色谱图，3-羟基丁酸单体的峰面积大于3-羟基丁酸二聚体的峰面积，说明3-羟基丁酸单体是主要的酶解产物，3-羟基丁酸二聚体是次要酶解产物。

3-羟基丁酸作为主要的酶解产物对于该发明制剂具有重要意义。因为丁酸和丁酸钠早在2003年已经被列入《饲料添加剂品种目录》中，成为允许使用的饲料添加剂。这是因为首先丁酸盐是动物肠道细胞能量的快速来源，丁酸氧化无需经过肝胆吸收和三羧酸循环，可直接为肠上皮细胞提供能量，是肠上皮的快速能量源。第二，丁酸盐可促进胃肠道细胞的增殖和成熟，改善小肠形态；第三，丁酸和丁酸盐可以调节胃肠道pH和肠道微生物菌群平衡；第四，可以增强养殖动物的机体免疫功能；第五，可以通过控制细胞膜上mRNA数量，调控或影响转运蛋白质的表达。

实施例5缓释碳源好氧脱氮制剂PHAs(AOB-7)的制备

将PHAs降解菌株AOB-7于LB液体培养基培养24h后，8000g离心15min后弃上清，然后用0.9％无菌生理盐水清洗三次菌体，最后用生理盐水配制OD₆₀₀＝1的菌悬液，所得菌悬液按照1％v/v的接种量接种于含140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHB培养基或含140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHBV培养基中，于30℃、150rpm条件下摇床培养72h，取出培养体系中的PHB或PHBV颗粒，所得PHB或PHBV颗粒即为缓释碳源好氧脱氮制剂。

其中，含140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHB培养基组成如下：KNO₃ 1.00g，PHB颗粒3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.20g，CaCl₂ 0.01g，KH₂PO₄ 0.50g，Na₂HPO₄ 0.50g，FeSO₄ 0.01g，NaCl10.00g，微量元素1.00mL，pH 7.2。上述微量元素组成如下：57.10g/L EDTA·2Na，3.90g/LZnSO₄·7H₂O，7.00g/L CaCl₂·2H₂O，1.00g/L MnCl₂·4H₂O，5.00g/L FeSO₄·7H₂O，1.10g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，1.60g/L CuSO₄·5H₂O，1.60g/L CoCl₂·6H₂O，pH 6.0。

含140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHBV培养基组成如下：KNO₃ 1.00g，PHBV颗粒3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.20g，CaCl₂ 0.01g，KH₂PO₄ 0.50g，Na₂HPO₄ 0.50g，FeSO₄ 0.01g，NaCl10.00g，微量元素1.00mL，pH 7.2。上述微量元素组成如下：57.10g/L EDTA·2Na，3.90g/LZnSO₄·7H₂O，7.00g/L CaCl₂·2H₂O，1.00g/L MnCl₂·4H₂O，5.00g/L FeSO₄·7H₂O，1.10g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，1.60g/L CuSO₄·5H₂O，1.60g/L CoCl₂·6H₂O，pH 6.0。

在制备PHB型好氧脱氮制剂时，所用PHAs颗粒为PHB颗粒。所得好氧脱氮制剂命名为PHB(AOB-7)，即PHB型。

在制备PHBV型好氧脱氮制剂时，所用PHAs颗粒为PHBV颗粒。所得好氧脱氮制剂命名为PHBV(AOB-7)，即PHBV型。

好氧脱氮制剂PHB(AOB-7)和PHBV(AOB-7)的菌含量分别为1.41×10⁹CFU/mL和3.23×10⁸CFU/mL。

缓释碳源好氧脱氮制剂PHAs(AOB-7)的形态观察：

将制备的缓释碳源好氧脱氮制剂PHAs(AOB-7)，取制剂中的PHB、PHBV颗粒用于后续观察。空白DM-PHB和DM-PHBV培养基中的PHB和PHBV颗粒分别用作对照。对于空白PHB、PHBV颗粒和制剂PHB、PHBV颗粒，分别加入3％戊二醛固定12～24h，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)漂洗3次，每次用时分别为4min，5min，6min。每次漂洗6000rpm离心1.5min。用50％、70％、85％、95％乙醇，顺序脱水各1次，每次10min，100％乙醇脱水3次，每次10min。临界点干燥仪干燥，离子溅射喷金后扫描电镜(Scanning electron microscopy,SEM)观察并釆集图像。

PHB型和PHBV型制剂的表面形态如图4和图5所示，25～30倍下扫描电镜观察，PHB(AOB-7)、PHBV(AOB-7)好氧脱氮制剂表面粗糙，可见大的缝隙，边缘圆滑，整体结构疏松化。300倍下扫描电镜观察，PHB(AOB-7)、PHBV(AOB-7)好氧脱氮制剂表面布满孔洞缝隙，利于AOB-7菌株细胞进入、附着并生长。5000倍下，2种好氧脱氮制剂的表面及空隙观察到细菌密布，杆状AOB-7细胞进入PHB材料内部，深度附着。

实施例6好氧脱氮制剂不同添加比例对模拟养殖循环水的脱氮效果

1、制剂1％添加比例对模拟养殖循环水(35mg/L NO₃ ^--N+1.4mg/L NH₄ ⁺-N)的脱氮效果

配制35mg/L NO₃ ^--N、1.4mg/L NH₄ ⁺-N浓度的模拟养殖废水，其配方如下：KNO₃0.25g/L，NH₄Cl 0.0054g/L，MgSO₄·7H₂O 0.10g/L，CaCl₂ 0.005g/L，KH₂PO₄ 0.50g/L，Na₂HPO₄ 0.50g/L，FeSO₄ 0.01g/L。在装有250mL上述模拟养殖废水的三角瓶中以1％的投加比例(m/v)添加实施例5制备的缓释碳源好氧脱氮制剂PHB(AOB-7)，28℃、160rpm摇床转速下培养48h后，经水质检测表明，氨氮浓度为0，硝态氮去除率达98.32％。

2、制剂1％添加比例对模拟养殖循环水(70mg/L NO₃ ^--N+3.5mg/L NH₄ ⁺-N)的脱氮效果

配制70mg/L NO₃ ^--N、3.5mg/L NH₄ ⁺-N浓度的模拟养殖废水，其配方如下：KNO₃0.50g，NH₄Cl 0.0135g，MgSO₄·7H₂O 0.10g，CaCl₂ 0.005g，KH₂PO₄ 0.50g，Na₂HPO₄0.50g，FeSO₄ 0.01g。在装有250mL上述模拟养殖废水的三角瓶中以1％的投加比例(m/v)添加实施例5制备的缓释碳源好氧脱氮制剂PHB(AOB-7)，28℃、160rpm摇床转速下培养48h后，经水质检测表明，氨氮浓度为0，硝态氮去除率达96.79％。

3、制剂2％添加比例对模拟养殖循环水(140mg/L NO₃ ^--N+7mg/L NH₄ ⁺-N)的脱氮效果

配制140mg/L NO₃ ^--N、7mg/L NH₄ ⁺-N浓度的模拟养殖废水，其配方如下：KNO₃1.00g，NH₄Cl 0.027g，MgSO₄·7H₂O 0.10g，CaCl₂ 0.005g，KH₂PO₄ 0.50g，Na₂HPO₄0.50g，FeSO₄0.01g。在装有250mL上述模拟养殖废水的三角瓶中以2％的投加比例(m/v)添加实施例5制备的缓释碳源好氧脱氮制剂PHB(AOB-7)，28℃、160rpm摇床转速下培养48h后，经水质检测表明，氨氮浓度为0，硝态氮去除率达97.54％。

实施例7好氧脱氮制剂在斑马鱼养殖循环水中的脱氮应用效果

建立斑马鱼循环水养殖系统，选择大小约为600mm×405mm×300mm(长×宽×高)的长方形水族箱，设置增氧泵、过滤器、加热棒等配套设施。注入曝除氯气3天后的自来水，保持水温在24～26℃，溶氧量在≥6mg/L，酸碱度在pH7.5～8.5，保持自然光照的日夜节律。暂养2周后，设置PHB(AOB-7)脱氮制剂(实施例5制备)添加组和对照组，每组18条1-2月龄斑马鱼，斑马鱼平均初始体重100g左右。脱氮制剂添加组和对照组在为期4周的试验期内零换水率，按照体重的6％每天两次喂食，饲喂时间分别为9:00am、5:00pm，4周内连续监测PHB(AOB-7)脱氮制剂添加组和对照组的水质指标，试验结束后测量末期体重，计算增重率，饲料系数，特定增长率。

用于饲喂斑马鱼的饲料可参照文献(Guo,X.,Ran,C.,Zhang,Z.,He,S.,Jin,M.,&Zhou,Z.(2017).The Growth-Promoting Effect of Dietary Nucleotides in Fish IsAssociated with an Intestinal Microbiota-Mediated Reduction in EnergyExpenditure.The Journal of Nutrition,147(5),781–788.doi:10.3945/jn.116.245506)中的基础饲料配方配制，每100g基础饲料的组成如下：酪蛋白40g，明胶10g，糊精28g，豆油6％，赖氨酸0.33g，VC磷酸酯0.1％；多维0.2g，多矿0.2％，磷酸二氢钙2g，氯化胆碱0.2％，海藻酸钠2g，微晶纤维素4％，沸石粉6.97g。

该实施例中，PHB(AOB-7)脱氮制剂添加组的氨氮浓度维持在约0.15mg/L水平，而在对照组中，氨氮浓度高得多，约为1.2mg/L。在为期4周的试验期间，对照组和PHB(AOB-7)脱氮制剂添加组的亚硝酸浓度始终保持在非常低的水平，介于0～0.03mg/L之间，表明斑马鱼循环水养殖系统中亚硝酸盐氮可忽略不计。对照组和PHB(AOB-7)脱氮制剂添加组的硝酸盐氮浓度差异极大。对照组的硝酸盐氮浓度维持在约43.9-46.1mg/L。而在脱氮剂添加组中，硝酸盐氮浓度从第4天的43.4mg/L逐渐下降，在第13天后硝酸盐氮浓度维持在15.4mg/L左右(图6)。

实施例8好氧脱氮制剂在斑马鱼循环水养殖中对斑马鱼的益生效果

按照实施例7的方法建立斑马鱼循环水养殖系统，暂养2周后，设置PHB(AOB-7)脱氮制剂添加组和对照组，每组18条1-2月龄斑马鱼，斑马鱼平均初始体重100g左右。脱氮制剂(实施例5制备)添加组和对照组在为期4周的试验期内零换水率，按照体重的6％每天两次喂食，饲喂时间分别为9:00am、5:00pm，试验结束后测量末期体重，计算增重率，饲料系数，特定增长率。

该实施例中，PHB(AOB-7)脱氮制剂对斑马鱼的生长也有很大影响。与对照相比，PHB(AOB-7)脱氮制剂添加组斑马鱼的最终体重，增重率，特殊生长速率都显著增高，饲料系数降低。其中增重率显著增加29.12％，饲料系数显著降低18.31％(表1)。

表1

注：同一行中数值具有不同小写字母上标者差异显著(P<0.05)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 好氧脱氮制剂及其制备方法与应用

<130> KHP191113547.2

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400> 1

attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggatgagagg agcttgctcc 60

ttgatttagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtggt gggggataac 120

gttccgaaag gaacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcgggg gatcttcgga 180

cctcgcgcca ttagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca 240

aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt 300

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca 360

gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag 420

ggtattcacc taatacgtga gtattttgac gttaccgaca gaataagcac cggctaactt 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 540

agcgcgcgta ggtggttcgt taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg 600

catccaaaac tggcgagcta gagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg 660

aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga 720

cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgatgtc aactagccgt tggaatcctt gagattttag tggcgcagct aacgcattaa 840

gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 900

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg 960

acatgctgag aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg 1020

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc 1080

cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac 1140

cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggccaggg ctacacacgt 1200

gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc 1260

gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc 1320

gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380

atgggagtgg gttgctccag aagtagctag tctaaccttc ggggggacgg ttaccacgga 1440

gtgattcatg actggggtg 1459

Claims

1.假单胞菌(Pseudomonas sp.)AOB-7，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.17900。

2.权利要求1所述假单胞菌AOB-7或其菌剂、粗酶液的以下任一应用：

1)用于低碳氮比水体脱氮处理；

2)用于制备好氧脱氮制剂；

3)用于3-羟基丁酸的发酵生产；

4)用于生物可降解材料的降解；

其中，所述生物可降解材料为PHA，优选PHB、PHBV。

3.好氧脱氮制剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述假单胞菌AOB-7接入含有生物可降解材料的培养基中发酵培养，所得发酵产物即为好氧脱氮制剂；

其中，所述生物可降解材料为PHA，优选PHB、PHBV。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将假单胞菌AOB-7接种于LB液体培养基培养24-36h后，6000-8000g离心10-15min后弃上清，用无菌生理盐水清洗菌体，然后用生理盐水配制OD₆₀₀＝1～1.5的菌悬液，所得菌悬液按照1-2％v/v的接种量接种于含70～140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHA培养基中，于25～30℃、120～160rpm条件下摇床培养60-72h，取出培养体系中的PHA颗粒，所得PHA颗粒即为好氧脱氮制剂；

其中，所述含70～140mg/L NO₃ ^--N的DM-PHA培养基的组成如下：每升培养基中，KNO₃0.5～1.0g，PHA 1.5g～3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.10～0.20g，CaCl₂ 0.005～0.01g，KH₂PO₄ 0.50～0.80g，Na₂HPO₄ 0.50～0.80g，FeSO₄ 0.01～0.02g，NaCl 10.00～30.00g，微量元素1.00-2.00mL，pH 7.0～7.5；所述微量元素组成如下：48.20～57.10g/L EDTA·2Na，2.80～3.90g/L ZnSO₄·7H₂O，5.00～7.00g/L CaCl₂·2H₂O，0.50～1.00g/L MnCl₂·4H₂O，3.00～5.00g/L FeSO₄·7H₂O，0.75～1.10g/L(NH4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.90～1.60g/L CuSO₄·5H₂O，0.90～1.60g/L CoCl₂·6H₂O，pH 6.0～6.5。

5.按照权利要求3或4所述方法制备的好氧脱氮制剂。

6.根据权利要求5所述的好氧脱氮制剂，其特征在于，所述好氧脱氮制剂的菌含量为3.23×10⁸～1.41×10⁹CFU/g。

7.权利要求5或6所述好氧脱氮制剂在低碳氮比水体脱氮处理中的应用。

8.低碳氮比水体脱氮处理方法，其特征在于，所述方法包括：向低碳氮比水体中加入固体缓释碳源，然后接入权利要求1所述假单胞菌AOB-7或其菌剂，进行好氧反硝化脱氮处理；

其中，所述固体缓释碳源为PHA，优选PHB、PHBV。

9.低碳氮比水体脱氮处理方法，其特征在于，所述方法包括：向低碳氮比水体中加入权利要求5或6所述的好氧脱氮制剂，进行好氧反硝化脱氮处理。

10.权利要求8或9所述方法在改善水产养殖池水质中的应用。