CN114958708B - 一种促进微生物生长的方法及其应用 - Google Patents

一种促进微生物生长的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种促进微生物生长的方法及其应用，其包括如下步骤：S1.将淀粉、黏土和合金共混后，超声处理，然后冷冻干燥，得到人工土壤；S2.将菌种在培养基中培养后制备为菌悬液，然后将所述人工土壤加入菌悬液中，得到前驱体；S3.将所述前驱体在摇床中培养；其中，所述合金为镓铟合金。本发明的促进微生物生长的方法解除了部分生长因素的抑制，提高了微生物对底物的利用率，加快了微生物生长代谢的速度，比传统培养系统更加高效；本发明培养的微生物能更高效的进行气体发酵，生成更多目标产物，具有良好的应用前景。

Description

一种促进微生物生长的方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种促进微生物生长的方法及其应用。
背景技术
土壤环境中具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，能够满足微生物生长的需要。疏松的多孔结构也为微生物提供了生存空间。土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，微生物多样性高。筛选分离的纯菌也多从土壤中获得，土壤是天然的微生物库。
土壤对微生物有许多作用，可以影响微生物的生长代谢、基因转移等，并提供生长载体。土壤中的微生物具有多种功能，如固氮作用、硝化作用、反硝化作用、腐殖质的分解和合成等，在生态系统的氮、磷循环中发挥着巨大作用。同时土壤微生物可作碳“捕集器”，固定二氧化碳以减少大气中的温室气体。而气体发酵微生物在自养下进行合成有机物的同时，在固定二氧化碳方面也发挥着巨大作用。气体发酵微生物在利用气体为能源物质进行自养代谢活动过程中，能够合成高价值有机物，如生物燃料、蛋白质等。这种技术可以利用低价值混合气合成高价值产物，并且能够实现二氧化碳的固定，极具应用价值。但是由于微生物自养生长速率较慢，不利于大规模进行有机物的合成；且微生物的生长脱离固定载体，没有固定的生存空间，也容易造成菌体的流失。这些方面都是限制气体发酵工艺的因素，故可以通过土壤环境的优良作用，促进微生物的生长，提高产物产量。
然而天然土壤中富含多种微生物，在进行微生物培养时会带来许多杂菌，在培养过程中微生物之间存在的竞争关系，反而会影响发酵微生物的生长。且不同的土壤组分复杂，含有许多物质，随着工业发展，土壤重金属污染也日益严重，土著微生物是经过很长时间的筛选之后才得以生存，而发酵微生物可能会受到其毒害作用，不利于生长并进行发酵。
基于此，亟需研发一种促进微生物生长的方法，并将其应用于气体发酵中，以解决现有技术的不足，满足实际生产的需求。
发明内容
为克服现有技术中的缺陷，本发明公开了一种促进微生物生长的方法及其应用，能有效促进微生物的生长并进行气体发酵。其利用淀粉、黏土及镓铟合金三种原材料合成人工土壤，然后将所述人工土壤投加到菌悬液中，在该环境下对发酵微生物进行持续培养。令人意外地发现，该方法能极大地促进发酵微生物的生长，从而使其有机物合成行为大大加快，解除氮源的生长抑制。利用简单易得的材料，且材料可以通过修饰获得优良性能，即可实现促进微生物生长、减少异养下有机底物的消耗及改变菌群结构的作用。将人工土壤应用到微生物发酵中，可以为发酵微生物提供一个适宜的土壤环境，解除生长限制，促进微生物生长及其有机合成。
本发明的一个目的在于，提供一种促进微生物生长的方法，所述促进微生物生长的方法包括如下步骤：
S1.将淀粉、黏土和合金共混后，超声处理，然后冷冻干燥，得到人工土壤；
S2.将菌种在培养基中培养后制备为菌悬液，然后将所述人工土壤加入菌悬液中，得到前驱体；
S3.将所述前驱体在摇床中培养；
其中，所述合金为镓铟合金。
与传统土壤相比，采用淀粉、黏土和镓铟合金制备的人工土壤组成更加简单，避免了杂菌、有害成分的干扰，而破碎、冻干等步骤模仿了天然土壤形成过程，使其具有更好的生物相容性；令人意外地发现，淀粉、黏土和镓铟合金三者具有良好的协同作用，可以显示出优异的支撑、保护微生物的作用，以及调节微生物转录的作用，从而三者的共同存在，能够促进微生物的生长及合成、解决了微生物发酵培养的氮源抑制；以及具有促进微生物生长、减少异养下底物消耗的优点，从而极大的提高了产物产量，克服了微生物培养及发酵的技术瓶颈。
进一步地，所述镓铟合金中镓和铟的质量之比为(2-4):1。
进一步地，所述淀粉选自玉米淀粉、木薯淀粉和红薯淀粉中的一种或多种。
进一步地，步骤S2中，所述菌悬液的OD600值为0.05-0.20。
进一步地，步骤S2中，所述培养基的成分包括卤化物、硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸氢盐、磷酸盐、上述成分的水合物、微量元素中的一种或多种。
优选地，所述培养基中含有(NH4)2SO4，所述培养基通过调节(NH4)2SO4含量来调节氨氮浓度。
进一步地，所述培养基中，果糖的含量为1-2wt％。
优选地，该培养基中要包括足够的有机底物，从而保证微生物能给进行好氧呼吸，并且有足够的能源物质。
进一步地，所述人工土壤为粉末状或片状。
进一步地，所述菌种为杀虫贪铜菌。
进一步地，步骤S3中，所述培养的温度为25-37℃；所述培养的转速为100-500rpm；所述培养的时间为48-120h；所述培养的pH值为6-8。
本发明的另一个目的在于，提供上述促进微生物生长的方法在气体发酵中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1.相比于传统土壤，本发明采用了以淀粉、黏土和镓铟合金制备的人工土壤作为微生物生长场所，三者具有协同效应，共同促进支撑、保护微生物以及调节微生物转录的作用，从而更好地促进微生物的生长和合成。
2.本发明的促进微生物生长的方法解除了部分生长因素的抑制，提高了微生物对底物的利用率，加快了微生物生长代谢的速度，比传统培养系统更加高效；
3.本发明培养的微生物能更高效的进行气体发酵，发挥生物固碳作用，获得更多高价值的代谢产物聚-β-羟丁酸(PHB)，具有良好的应用前景。
附图说明
图1示出了实施例1制备的人工土壤电镜扫描结构图。
图2示出了测试例中实施例1-2和对比例1-5的PHB生成量。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
本发明实施例中的杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)从北纳生物公司购买。
本发明实施例中的镓铟合金购买自SigmaAldrich，其中镓75.5wt％、铟24.5wt％。
本发明实施例1-3中的培养基成分和浓度如下表1所述。
表1培养基的成分和浓度
Figure BDA0003671530360000031
上述微量元素，其成分和浓度如下表2所述。
表2微量元素的成分和浓度
成分 浓度(g/l)
CaSO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 1
NiSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.56
柠檬酸铁 0.4
实施例1
一种促进微生物生长的方法，其包括如下步骤：
S1.将木薯淀粉、黏土和水共混后(质量比1:1:18)，用磁力搅拌器过夜搅拌，然后加入镓铟合金(与黏土等质量)，超声处理至混合均匀，冷冻干燥后，得到粉末状人工土壤；
图1示出了人工土壤的电镜扫描结构图；
S2.将杀虫贪铜菌接种至培养基中培养20h，得到中间体，然后离心，倒去上清液，再利用25×PBS清洗，然后再次离心倒去上清液，重复三次，使菌体分散于培养基中，获得OD600为0.20的菌悬液；
设定2组平行实验：将所述人工土壤直接投加到所述菌悬液中，混合均匀，得到前驱体(10mL)；
S3.将所述前驱体放入摇床中，30℃恒温，转速100rpm，pH值6.5下，培养24h。
实施例2
一种促进微生物生长的方法，其包括如下步骤：
S1.将木薯淀粉、黏土和水共混后(质量比1:1:8)，用磁力搅拌器过夜搅拌，然后加入镓铟合金(与黏土等质量)，超声处理至混合均匀，冷冻干燥后，得到粉末状人工土壤；
S2.将杀虫贪铜菌接种至培养基中培养16h，得到中间体，然后离心，倒去上清液，再利用25×PBS清洗，然后再次离心倒去上清液，重复三次，使菌体分散于培养基中，获得OD600为0.19的菌悬液；
设定2组平行实验：将所述人工土壤直接投加到所述菌悬液中，混合均匀，得到前驱体(15mL)；
S3.将所述前驱体放入摇床中，32℃恒温，转速300rpm，pH值7.5下，培养32h。
实施例3
一种促进微生物生长的方法，其包括如下步骤：
S1.将木薯淀粉、黏土和水共混后(质量比1:1:10)，用磁力搅拌器过夜搅拌，然后加入镓铟合金(与黏土等质量)，超声处理至混合均匀，冷冻干燥后，得到粉末状人工土壤；
S2.将杀虫贪铜菌接种至培养基中培养18h，得到中间体，然后离心，倒去上清液，再利用25×PBS清洗，然后再次离心倒去上清液，重复三次，使菌体分散于培养基中，获得OD600为0.20的菌悬液；
设定2组平行实验：将所述人工土壤直接投加到所述菌悬液中，混合均匀，得到前驱体(20mL)；
S3.将所述前驱体放入摇床中，35℃恒温，转速200rpm，pH值7.0下，培养40h。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：未进行步骤S1；且步骤S2中，未将人工土壤投加至菌悬液中，其他步骤和条件与实施例1相同。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于：未进行步骤S1；且步骤S2中，未将人工土壤投加至菌悬液中，其他步骤和条件与实施例2相同。
对比例3
本对比例与实施例2的区别在于：步骤S1中，不加入镓铟合金，其余组分质量份数相同，其他步骤和条件与实施例2相同。
对比例4
本对比例与实施例2的区别在于：步骤S1中，不加入淀粉，其余组分质量份数相同，其他步骤和条件与实施例2相同。
对比例5
本对比例与实施例2的区别在于：步骤S1中，不加入黏土，其余组分质量份数相同，其他步骤和条件与实施例2相同。
测试例
测试方法：从上述实施例1-2和对比例1-5培养完成的前驱体中各取1mL菌液，离心、消解后，利用超高效液相色谱仪测定PHB表征产物产量。
测试结果如表3和图2所示。
表3 PHB生成量
Figure BDA0003671530360000051
Figure BDA0003671530360000061
图2示出了实施例1-2和对比例1-5的PHB生成量。
从表3和图2中可以看出，对比例1-2中随着氮源浓度的增加，产物产量一直在下降，可见氮源的抑制作用；实施例1在氨氮浓度1.0g/L下，人工土壤发挥出促进作用，微生物的产物PHB产量明显高于对比例1中未添加人工土壤，PHB产量可达267.6mg/L，产量提高了30.0mg/L；而实施例2与对比例2也表明，在2.0g/L的氨氮浓度下，人工土壤也能表现出促进产物合成的作用，产量提高了55.0mg/L，提升比例达到了29.8％；对比例3-5的PHB生成量相比实施例2存在较大差距，说明淀粉、黏土和镓铟合金之间存在协同作用，只有三者共同存在人工土壤中，才能表现出优良的性能，从而解除氮源对微生物生长的抑制，提高微生物对底物的利用率，促进微生物的生长速度，从而提升PHB的产量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种促进微生物生长的方法，其特征在于，所述促进微生物生长的方法包括如下步骤：
S1. 将淀粉、黏土和合金共混后，超声处理，然后冷冻干燥，得到人工土壤；
S2. 将菌种在培养基中培养后制备为菌悬液，然后将所述人工土壤加入菌悬液中，得到前驱体；
S3. 将所述前驱体在摇床中培养；
其中，所述合金为镓铟合金；
所述淀粉、黏土和合金的质量比为1:1:1；
所述镓铟合金中镓和铟的质量之比为(2-4):1；
所述菌种为杀虫贪铜菌。
2.根据权利要求1所述促进微生物生长的方法，其特征在于，所述淀粉选自玉米淀粉、木薯淀粉和红薯淀粉中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述促进微生物生长的方法，其特征在于，步骤S2中，所述菌悬液的OD600值为0.05-0.20。
4.根据权利要求1所述促进微生物生长的方法，其特征在于，步骤S2中，所述培养基的成分包括KH2PO4、Na2HPO4·7H2O、NaHCO3、MgSO4·7H2O、CaSO4·2H2O、NiSO4·7H2O、柠檬酸铁。
5.根据权利要求1所述促进微生物生长的方法，其特征在于，所述人工土壤为粉末状或片状。
6.根据权利要求1所述促进微生物生长的方法，其特征在于，所述菌种为杀虫贪铜菌。
7.根据权利要求1所述促进微生物生长的方法，其特征在于，步骤S3中，所述培养的温度为25-37℃；所述培养的转速为100-500 rpm；所述培养的时间为48-120 h；所述培养的pH值为6-8。
8.权利要求1-7任一项所述促进微生物生长的方法在气体发酵中的应用。
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