CN112220719A - 一种乌发组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乌发组合物及其制备方法和应用，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.05～10重量份、甘草亭酸0.01～7重量份、人参提取物0.1～8重量份和女贞子提取物0.01～5重量份。所述乌发组合物通过四种有效成分的协同复配，能够有效深入头皮和毛囊中，激活酪氨酸酶，修复受损黑色素细胞，促进黑色素细胞的生长、功能性黑色素细胞的成熟转变以及黑色素的生成，从黑色素形成通路上进行调控和修复，达到乌发、改善灰发和白发的目的；同时，所述乌发组合物能够对头皮和头发生长的微生态系统进行调控，维护头皮和头发的稳定和健康生长。

Description

一种乌发组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种乌发组合物及其制备方法和应用。
背景技术
头发是人体的附属器，是人体的重要组成部分，具有保护、修饰以及其他生理功能。近年来，随着社会经济的不断发展，人们的日常工作逐渐从繁重的体力劳动向脑力劳动转变，同时城市生活节奏加快，人们的工作和竞争压力较大，饮食作息不规律，上述因素都有可能导致头发生长的异常，从而过早出现白发、脱发等问题，给人们的身体和情绪带来负面影响。
综合来看，白发的成因有很多，遗传、衰老和疾病等因素均有可能引起白发的产生。现代医学认为：白发主要是由于黑色素减少、毛球中黑素细胞形成黑色素的功能减弱、酪氨酸酶活性降低或丧失、毛干中缺乏黑色素等原因导致的；中医则认为，白发的形成与肝肾不足、血气虚弱有关。白发虽然不会直接危及生命，但是会影响人的外在形象，给人造成心理压力和精神负担。因此，寻找一种可靠的乌发方法具有十分重要的意义。
目前市场上的乌发产品包括染发剂、洗发水和护发素等。其中，染发剂以氧化型染发剂和模拟黑色素生成过程的染发剂居多，上述染发剂的共同之处在于不是直接添加染料，而是加入染料中间体、改性剂、偶合剂或生成黑色素中间体等；使用上述染发剂可以使被染头发的色调具有较长的持久性，但头发以每月12mm的速度生长，新生长的头发依然是白发，因此是一种治标不治本的乌发产品。而洗发水、护发素等虽然宣称其中含有乌发成分，但是该类产品在头皮和头发上的停留时间短，其主要作用包括清洁、改善头发的干枯毛躁等，乌发效果并不显著。
采用中药组方对白发进行内源性防治是乌发的重要方法。CN107007745A公开了一种乌发的药物及其制备方法、使用方法，所述药物由以下重量份的原料组成：制黄精2～4份，制何首乌2～4份，补骨脂2～4份，熟地黄2～4份，黑芝麻2～4份，女贞子1～3份，当归1～3份，松叶1～2份；其制备方法和使用方法为：按照配方量称取各原料、粉碎，用蜂蜜调匀制成约9g的丸状，口服，每日早晚各1丸；所述药物主治白发、脱发等，具有较高的药用价值。CN107412444A公开了一种生发乌发养发的中药洗发药物，由如下组分制成：茶麸、旱莲草、侧柏叶、骨碎补、洗手果、菟丝子、首乌、当归、桑白皮和人参，所述中药洗发药物为浴粉剂、水剂、粉散剂或泡腾剂，用于头发清洗后，具有生发乌发固发、乌髭发、毛发再生和白发变黑等功效。CN110507579A公开了一种乌发精华液及制备方法，该乌发精华液包括水、中药提取物以及防腐剂，所述中药提取物包括制何首乌提取物、当归提取物、红花提取物、余甘子提取物、黑芝麻提取物、鳢肠提取物、马齿苋提取物、熟地黄提取物、银杏提取物、黄精提取物和杜仲提取物；所述乌发精华液具有补血、补精气、乌发、防脱发、抑菌消炎的功效。
现有技术中，内源性防治白发的中药组分大多包含何首乌、黑芝麻、人参和当归等，长期口服中药制剂会给肝脏和肾脏带来代谢负担，甚至导致肝脏或肾脏损伤；洗发类产品中的有效成分在头皮和头发上的停留时间较短，导致其功效性欠佳；乌发精华液由多种中药和植物提取物组合而成，存在一定的透皮吸收问题，起效慢，而且黏腻感较大，使用体验不佳。
因此，开发一种能够从根源上促进黑色素生成、起效快、乌发效果好的乌发产品，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乌发组合物及其制备方法和应用，所述乌发组合物通过樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物和女贞子提取物四种有效成分的协同复配，能够深入毛囊，针对黑色素的形成通路进行修复和调理，有效修复受损黑色素细胞，促进黑色素细胞生长，从根源上实现乌发、改善灰发和白发的功效。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种乌发组合物，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.05～10重量份、甘草亭酸0.01～7重量份、人参提取物0.1～8重量份和女贞子提取物0.01～5重量份。
本发明提供的乌发组合物包括樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物和女贞子提取物四种有效成分；其中，所述樱花花提取物从樱花花瓣中获得，含有总黄酮、多糖、多酚和皂苷等活性物质，能够有效促进酪氨酸酶活性和黑色素生成，尤其能够修复受损黑色素细胞、促进黑色素细胞生长，使毛囊恢复黑色素生成功能；所述甘草亭酸具有免疫调节、舒缓抗炎和促进细胞再生的功效，有助于毛母细胞和黑色素细胞的生长；所述人参提取物中含有丰富的皂苷和多糖类成分，能够延缓头皮衰老，增强头皮的细胞活性，促进头发的生长和修复；所述女贞子提取物中包含齐墩果酸、多糖类和脂肪油等有效成分，能够滋养头皮和头发，具有显著的乌发功效。
本发明提供的乌发组合物通过樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物和女贞子提取物四种有效成分的协同复配，能够有效深入头皮和毛囊中，激活酪氨酸酶，修复受损黑色素细胞，促进黑色素细胞的生长、功能性黑色素细胞的成熟转变以及黑色素的生成，从黑色素形成通路上进行调控和修复，达到乌发、改善灰发和白发的目的；同时，所述乌发组合物能够对头皮、毛囊和头发生长的微生态系统进行调控，维护头皮和头发的稳定和健康生长。
本发明中所述乌发组合物中，所有组分的含量(重量份)、质量比或质量百分含量都是以有效成分含量进行计算，不包括溶剂和/或提取剂。
本发明中，所述樱花花提取物的含量为0.05～10重量份，例如0.08重量份、0.1重量份、0.15重量份、0.2重量份、0.4重量份、0.5重量份、0.8重量份、1重量份、2重量份、3重量份、4重量份、5重量份、6重量份、7重量份、8重量份、9重量份或9.5重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述甘草亭酸的含量为0.01～7重量份，例如0.03重量份、0.05重量份、0.08重量份、0.1重量份、0.15重量份、0.2重量份、0.4重量份、0.5重量份、0.8重量份、1重量份、2重量份、3重量份、4重量份、5重量份、6重量份或6.5重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述人参提取物的含量为0.1～8重量份，例如0.12重量份、0.15重量份、0.18重量份、0.2重量份、0.5重量份、0.8重量份、1重量份、2重量份、3重量份、4重量份、5重量份、6重量份、7重量份或7.5重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
所述女贞子提取物的含量为0.01～5重量份，例如0.03重量份、0.05重量份、0.08重量份、0.1重量份、0.15重量份、0.2重量份、0.4重量份、0.5重量份、0.8重量份、1重量份、2重量份、3重量份、4重量份或4.5重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述樱花花提取物采用如下方法提取得到，所述方法包括：采用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂包括C3～C6(例如C3、C4、C5或C6)小分子多元醇、乙醇和水的组合物。
优选地，所述C3～C6小分子多元醇包括1,2-己二醇、1,2-戊二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、甲基丙二醇、异戊二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合。
作为本发明的优选技术方案，所述樱花花提取物从樱花花瓣中提取得到，所用提取剂包括小分子多元醇、乙醇和水的组合，通过提取剂组分的筛选和优化，更有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的有效成分的浸出，使得到的樱花花提取物含有更加丰富的有效成分，尤其是总黄酮含量显著提升；且其适用于水剂和乳化剂等多种剂型的产品，应用范围广。
优选地，所述提取剂中C3～C6小分子多元醇的质量百分含量为35～55％，例如36％、38％、40％、42％、44％、45％、47％、49％、50％、51％、53％或54％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述提取剂中乙醇的质量百分含量为15～40％，例如16％、18％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、37％或39％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述提取剂按照质量百分含量包括：C3～C6小分子多元醇35～55％，乙醇15～40％，余量为水。
优选地，所述浸提的温度为60～100℃，例如62℃、65℃、68℃、70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃、88℃、90℃、92℃、95℃或98℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述浸提的时间为0.5～3h，例如0.8h、1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h或2.8h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述樱花花瓣与提取剂的质量比为1:(40～80)，例如1:42、1:45、1:48、1:50、1:52、1:55、1:58、1:60、1:62、1:65、1:68、1:70、1:72、1:75、1:77或1:79等。
优选地，所述樱花花瓣为经过干燥处理和/或粉碎处理的樱花花瓣，进一步优选为樱花干花瓣粉。
本发明中，所述樱花花提取物中包括总黄酮、多酚、多糖和皂苷。
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中总黄酮的质量为5.5～7％，例如5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％或6.9％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多酚的质量为0.7～1％，例如0.72％、0.74％、0.76％、0.78％、0.8％、0.82％、0.84％、0.86％、0.88％、0.9％、0.92％、0.94％、0.96％或0.98％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多糖的质量为1.2～1.6％，例如1.22％、1.25％、1.28％、1.3％、1.32％、1.35％、1.38％、1.4％、1.42％、1.45％、1.48％、1.5％、1.52％、1.55％、1.57％或1.59％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中皂苷的质量为0.4～0.6％，例如0.41％、0.43％、0.45％、0.47％、0.49％、0.5％、0.51％、0.53％、0.55％、0.57％或0.59％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述樱花花提取物与甘草亭酸的质量比为(1～3):1，例如1.1:1、1.3:1、1.5:1、1.7:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.3:1、2.5:1、2.7:1或2.9:1等。
作为本发明的优选技术方案，所述樱花花提取物与甘草亭酸的质量比为1:1～3:1，二者在上述范围内相互协同，一方面能够促进酪氨酸酶活性和黑色素生成，尤其能够修复受损黑色素细胞、促进黑色素细胞生长，使毛囊恢复黑色素生成功能，另一方面能够针对受损的头皮微环境进行舒缓和免疫调节，促进细胞再生，调控头皮和头发生长的微环境，形成健康稳态的头皮生态。如果二者的比例失衡，樱花花提取物含量过低则会直接影响所述乌发组合物的乌发效果，而甘草亭酸含量过低则不利于头皮健康微环境的重建，使乌发组合物显效慢，乌发效果不稳定。
优选地，以所述樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物和女贞子提取物的总质量为100％计，所述樱花花提取物的质量为30～60％，例如32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、51％、53％、55％、57％或59％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为40～50％。
优选地，所述乌发组合物中还包括溶剂。
优选地，所述溶剂为水，或水与醇类溶剂的混合物。
优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1,3-丁二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.5～10重量份、甘草亭酸0.1～5重量份、人参提取物0.1～5重量份和女贞子提取物0.1～5重量份。
所述樱花花提取物采用如下方法提取得到，所述方法包括：采用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂按照质量百分含量包括：C3～C6小分子多元醇35～55％，乙醇15～40％，余量为水。
另一方面，本发明提供一种如第一方面所述的乌发组合物的制备方法，所述制备方法包括：将樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物、女贞子提取物与溶剂混合均匀，得到所述乌发组合物。
优选地，所述溶剂为水，或水与醇类溶剂的混合物。
优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1,3-丁二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
本发明提供的乌发组合物通过将各组分配方的混合制备得到，溶剂的添加量可以根据实际应用中对于有效成分的浓度要求进行调节；为了增加各组分在溶剂中的溶解度，可以在混合过程中适度加热(优选温度≤85℃，避免高温造成有效成分失活)。
另一方面，本发明提供一种乌发化妆品，所述乌发化妆品包括如第一方面所述的乌发组合物。
优选地，所述乌发化妆品包括乌发精华液、乌发精油、乌发喷雾、乌发乳液、洗发水、护发素或发膜中的任意一种。
另一方面，本发明提供一种乌发精华液，所述乌发精华液包括如第一方面所述的乌发组合物。
优选地，所述乌发精华液中乌发组合物的质量百分含量0.1～55％，例如0.15％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、13％、15％、17％、19％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、38％、40％、42％、45％、48％、50％、51％、53％或54％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述乌发精华液中还包括溶剂、保湿剂、pH调节剂、稳定剂、增溶剂、抗氧化剂、增稠剂、防腐剂、增溶剂或芳香剂中的任意一种或至少两种的组合。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的乌发组合物包含樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物、女贞子提取物四种有效成分，通过组分之间的协同配合，能够有效深入头皮和毛囊中，激活酪氨酸酶，修复受损黑色素细胞、促进黑色素细胞生长和黑色素的生成，从黑色素形成通路上进行调控和修复，达到乌发、改善灰发和白发的的目的；同时，所述乌发组合物能够对头皮、毛囊和头发生长的微生态系统进行调控，维护头发生长环境的健康，实现长久的乌发效果。
(2)本发明所述樱花花提取物可以通过特定组分的提取剂浸提得到，所述提取剂包含小分子多元醇、乙醇和水的组合，更有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分的浸出，使得到的樱花花提取物中含有更丰富的乌发有效成分。
(3)本发明提供的乌发组合物温和无刺激性，能够上调β-catenin蛋白水平，促进β-catenin基因的表达，对酪氨酸酶的激活率可以达到15～23％，使B16黑色素瘤细胞内的黑色素含量提升至7.2～8.0％，在动物实验中使用15天时即可实现显效乌发，逆转了因外界氧化因素导致的白发产生，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所述乌发组合物对黑花色豚鼠用药实验的结果图；
图2为实施例1所述乌发组合物对黑花色豚鼠用药实验的β-catenin免疫荧光结果图；
图3为实施例1所述乌发组合物对黑花色豚鼠用药实验的β-catenin蛋白水平测试结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例1
一种樱花花提取物，提取方法如下：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入120kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，乙醇25％，水25％)，在80℃条件下浸提2h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例2
一种樱花花提取物，提取方法如下：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入90kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇33％，甲基丙二醇17％，乙醇25％，水25％)，在90℃条件下浸提1.5h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例3
一种樱花花提取物，提取方法如下：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入150kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇35％，甘油20％，乙醇15％，水30％)，在70℃条件下浸提3h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例4
一种樱花花提取物，提取方法如下：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入130kg提取剂(按照质量百分含量包括：1,2-己二醇15％，1,3-丁二醇10％、1,3-丙二醇10％、乙醇40％，水25％)，在80℃条件下浸提2.5h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例5
一种樱花花提取物，提取方法如下：
取樱花干花瓣粉(平均细度为50目)2kg，向其中加入120kg提取剂(按照质量百分含量包括：甲基丙二醇20％，异戊二醇10％、1,2-戊二醇10％、乙醇30％，水30％)，在80℃条件下浸提3h，过滤除去花瓣粉残渣，将滤液浓缩，得到所述樱花花提取物。
制备例6
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇50％，乙醇25％，水25％。
制备例7
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：甲基丙二醇50％，乙醇25％，水25％。
制备例8
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇15％，甲基丙二醇15％，乙醇35％，水35％。
制备例9
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，乙醇50％。
制备例10
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：1,2-己二醇25％，甲基丙二醇25％，水50％。
制备例11
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂按照质量百分含量包括：乙醇50％，水50％。
制备例12
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂为纯水。
制备例13
一种樱花花提取物，其提取方法与制备例1的区别仅在于，提取剂为乙醇。
实施例1～7
一种乌发组合物，其组分配方如表1所示，配方中各组分的单位均为“重量份”。
表1
Figure BDA0002753513310000131
表1中，人参提取物购自湖南佳沐生物科技有限公司，女贞子提取物购自湖南佳沐生物科技有限公司；樱花花提取物的重量份以有效成分的含量计算(不含溶剂和提取剂)。
按照表1中的组分配方将各物料混合均匀，得到所述乌发组合物。
实施例8～19
一种乌发组合物，其与实施例1的区别仅在于，将其中的樱花花提取物分别替换为制备例2～13提供的樱花花提取物。
对比例1
一种乌发组合物，其与实施例1的区别仅在于，不含有樱花花提取物，甘草亭酸为5.25重量份，人参提取物为5.25重量份，女贞子提取物为3.5重量份。
对比例2
一种乌发组合物，其与实施例1的区别仅在于，不含有甘草亭酸，樱花花提取物为7.7重量份，人参提取物为3.8重量份，女贞子提取物为2.5重量份。
对比例3
一种乌发组合物，其与实施例1的区别仅在于，不含有人参提取物，樱花花提取物为7.7重量份，甘草亭酸为3.8重量份，女贞子提取物为2.5重量份。
对比例4
一种乌发组合物，其与实施例1的区别仅在于，不含有女贞子提取物，樱花花提取物为7重量份，甘草亭酸为3.5重量份，人参提取物为3.5重量份。
对比例5
一种乌发组合物，组分包括：14重量份黑芝麻素，16重量份水。
测试例1
对制备例1～13提供的樱花花提取物进行组分含量测试，方法如下：
(1)总黄酮测试标准曲线的建立：
以芦丁标准品配制浓度为0.416mg/mL的芦丁标准溶液(溶剂为30％乙醇)，分别取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL，用30％乙醇定容为5mL；然后分别加入0.3mL Al(NO3)3溶液(浓度为10％)、0.3mL 5％NaNO2溶液(浓度为5％)、3mL NaOH溶液(1mol/L)和1.4mL 30％乙醇；反应15min后在510nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到芦丁标准曲线：Y＝6.0769X+0.0084，R2＝0.9998。
(2)多糖测试标准曲线的建立：
以葡萄糖标准品配制浓度为0.1001mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，用纯水定容为2mL；然后分别加入1mL苯酚溶液(浓度为5％)和5mL浓硫酸，反应15min后冷水中冷却显色30min；在490nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到葡萄糖标准曲线：Y＝54.781X-0.0028，R2＝0.9992。
(3)多酚测试标准曲线的建立：
以没食子酸标准品配制浓度为0.1001mg/mL的没食子酸标准溶液，分别取0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL，分别加入5mL蒸馏水和1.5mL F-C试剂，混合静置4min；然后加入3mL碳酸钠溶液(浓度为10％)，避光静置60min，紫外检测最大吸收波长，得到没食子酸标准曲线：Y＝117.1X+0.0226，R2＝0.9994。
(4)皂苷测试标准曲线的建立：
以齐墩果酸标准品(98％)配制浓度为0.100mg/mL的齐墩果酸标准溶液(溶剂为甲醇)，0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL，70℃加热挥干甲醇，分别加入0.2mL香草醛-冰醋酸溶液(香草醛浓度为5％)和0.3mL高氯酸溶液，70℃水浴条件下反应16min，冰水浴中停止反应5min；然后加入5mL冰醋酸，放置22min后，在540nm的条件下用紫外分光光度计测试吸光度，得到齐墩果酸标准曲线：Y＝77.577X+0.0643，R2＝0.9931。
将制备例1～13提供的樱花花提取物稀释100倍，用于总黄酮含量的检测；将樱花花提取物稀释50倍，分别用于多糖和多酚含量的检测；将樱花花提取物稀释20倍，分别用于皂苷含量的检测。
根据上述实验方法分别测试紫外吸光度值，然后将吸光度代入对应的标准曲线中，通过换算得到各组分的质量百分含量，然后以提取方法中所用的樱花干花瓣粉的质量为100％计，折算出得到的樱花花提取物中总黄酮、多酚、多糖和皂苷的质量。具体数据如表2所示。
表2
Figure BDA0002753513310000151
Figure BDA0002753513310000161
结合制备例1～13的提取工艺和表2的数据可知，采用小分子多元醇、乙醇和水三者混合的提取剂有利于樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分的浸出，使得到的樱花花提取物中含有更多的有效成分，总黄酮、皂苷、多糖和多酚的含量较高。如果提取剂并非小分子多元醇、乙醇和水的组合(制备例9～13)，则樱花花提取物中的有效成分显著降低，尤其对于总黄酮含量的影响更加显著。
测试例2
对实施例1～19提供的乌发组合物进行安全性测试，方法如下：
(1)细胞毒性实验
HaCaT细胞为人永生表皮细胞系，HaCaT细胞的细胞毒性测试数据可作为对皮肤安全性的参考数据。将对数生长期的HaCaT细胞接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，细胞浓度为5×104/mL，37℃、5％CO2条件下培养24h使细胞贴壁生长；将96孔板中的细胞分为15组，分别对应实施例1～19(实验组)和空白对照，每组设置6个复孔；吸出旧的培养基，PBS清洗后，以每孔0.1％的浓度向实验组中加入实施例1～19提供的乌发组合物，37℃、5％CO2条件下培养48h后，再加入终浓度为5mg/mL的MTT 10μL继续培养4h；终止培养，吸弃上清，向每个孔中加入50μL DMSO，置于培养箱中10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪570nm处测定各孔的光密度值(OD值)，计算细胞存活率＝(OD实验–OD0)/(OD对照–OD0)，其中，OD0为培养基的OD值。
(2)3D皮肤刺激性实验
参照OECD 439欧盟标准测试方法，方法如下：
实验组：将实施例1～19提供的乌发组合物局部接触约0.38cm2的皮肤模型表面15min；阴性对照组为PBS，阳性对照组为SDS(十二烷基磺酸钠)，处理方法与实验组相同。
接触15min后用PBS冲洗皮肤模型，浸入维持培养基(2mL)中，在饱和湿度、37℃、5％CO2条件下孵育42h；然后浸入MTT溶液(2mL，0.3mg/mL，溶剂为测试培养基)中，饱和湿度、37℃、5％CO2条件下孵育3h；MTT反应完成后的皮肤模型浸入500μL酸化异丙醇的离心管中，混匀后在室温避光条件下过夜，然后从离心管中取出200μL液体样品置于96孔板中，在酶标仪570nm处读取各孔的OD值，以酸化异丙醇溶液作为空白对照；取3次测试结果的平均值进行计算，相对细胞活力百分比＝OD实验/OD阴性对照。
(3)人体斑贴皮肤刺激性
将实施例1～19提供的乌发组合物制成乌发精华液，用于人体斑贴皮肤刺激性的测试；乌发精华液的配方如表3所示。
表3
Figure BDA0002753513310000181
将上述乌发精华液(25μL)分别滴加于斑试器所附的滤纸片上，置于斑试器内；将滴加有乌发精华液的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的前臂曲侧，用于手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h；去除受试斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应。如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次；封闭型斑贴试验的皮肤反应评判标准如表4所示。
表4
Figure BDA0002753513310000182
Figure BDA0002753513310000191
30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或2级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例3级或3级以上皮肤不良反应时，判定为对人体有皮肤不良反应。
选570名皮肤健康的18～50岁的志愿者，随机分成19组，分别使用实施例1～19提供的乌发组合物制成的乌发精华液，记录封闭型斑贴试验的评分，得到人体斑贴皮肤刺激性实验结果。
按照上述实验方法从细胞毒性、3D皮肤刺激性和人体斑贴皮肤刺激性三个方面对实施例1～19提供的乌发组合物进行安全性测试，结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002753513310000192
Figure BDA0002753513310000201
根据表5的数据可知，本发明实施例1～19提供的乌发组合物不影响HaCaT细胞的生长增殖，对3D皮肤模型温和无刺激，在人体斑贴皮肤刺激性实验中表现出良好的安全性，证明通过本发明提供的乌发组合物对于人体皮肤温和无刺激性，可安全使用。
测试例3
对实施例1～19、对比例1～5提供的乌发组合物进行体外和细胞水平的乌发功效性测试，方法如下：
(1)酪氨酸酶激活率
配制0.5mg/mL的L-酪氨酸溶液(溶剂为磷酸缓冲液)，配制35mg/mL的蘑菇酪氨酸酶溶液(溶剂为磷酸缓冲液)，用丙二醇为溶剂配制1mg/mL的待测样品溶液(分别测试实施例1～19、对比例1～5提供的乌发组合物)作为对比测试组)。
按照如下比例配制4组溶液：
A：0.7mL的L-酪氨酸溶液+0.7mL纯丙二醇+0.6mL磷酸缓冲液；
B：0.7mL纯丙二醇+1.3mL磷酸缓冲液；
C：0.7mL的L-酪氨酸溶液+0.7mL待测样品的丙二醇溶液+0.6mL磷酸缓冲液；
D：0.7mL待测样品的丙二醇溶液+0.6mL磷酸缓冲液；
将上述4组溶液在37℃水浴中恒温10min后，各加入0.3mL酪氨酸酶溶液，反应5min后，迅速移入比色皿中，在475nm处测吸光度值(OD值)，记录OD值，并按照公式计算酪氨酸酶激活率＝100％×((ODC-ODD)-(ODA-ODB))/(ODA-ODB)；其中，(ODA-ODB)代表没有激活剂条件下的反应液的OD值改变，(ODC-ODD)代表有激活剂(实施例1～19、对比例1～5提供的乌发组合物)条件下的反应液的OD值改变。
(2)黑色素含量测试
将B16黑色素瘤细胞悬液的密度调成1×105个/mL，每孔1mL接种于12孔板，使细胞密度为5×104个/孔，置于培养箱(37℃、5％二氧化碳)培养24h。取出12孔板，抽除培养基，加入1mL含待测样品(实施例1～19、对比例1～5提供的乌发组合物，浓度为1mg/mL)的培养基，空白对照组和调零组加入1mL不含待测样品的培养基，继续置于培养箱培养12h后，抽除培养基。实验组和调零组每孔加入1mL用RPMI 1640培养基配制1μM的α-MSH溶液，空白组加入1mL不含α-MSH的培养基，置于培养箱培养36h后。分别用1mL PBS洗两次，每孔加入100μL1N含10％DMSO的NaOH溶液(用PBS配置)，在80℃的水浴锅中水浴1h后，将12孔板中各组的细胞溶出物转移到96孔板中，在酶标仪475nm处测定各孔的吸光度OD值。计算胞内黑色素含量的公式为：黑色素含量＝100％×(OD1-OD3)/(OD2-OD3)，其中，OD1为实验组的吸光度值，OD2为空白对照组的吸光度值，OD3为调零组的吸光度值。
按照上述实验方法分别测试实施例1～19、对比例1～5提供的乌发组合物对酪氨酸酶激活率和黑色素含量的影响，具体测试数据如表6所示。
表6
Figure BDA0002753513310000221
Figure BDA0002753513310000231
根据表6的数据可知，相比于常规乌发活性物质黑芝麻素，本发明实施例1～14提供的乌发组合物对酪氨酸酶的激活率可以达到15～23％，使B16黑色素瘤细胞内的黑色素含量提升至7.2～8％，证明其对于黑色素的生成具有显著的促进作用，即具有良好的乌发功效，且效果优于常规的乌发组分黑芝麻素。
对比实施例1～7的数据可知，本发明所述乌发组合物中，樱花花提取物与甘草亭酸的质量比为1:1～3:1范围内时，对酪氨酸酶和黑色素的促进作用可以达到最佳，如果超出上述范围，则会使所述乌发组合物的促黑色素生长效果有所下降。而且，本发明特异性地筛选出樱花花提取物作为所述乌发组合物的核心组分，如果乌发组合物中樱花花提取物的含量过低(实施例5)，则会显著影响促黑色素的生成。
结合表6中实施例1、实施例8～19的数据、表2以及制备例1～13中的浸提取方法可知，本发明所述乌发组合物中，樱花花提取物通过小分子多元醇、乙醇和水的组合物作为提取剂进行浸提时，能够使樱花花瓣中不同极性和溶解性的组分充分浸出，使得到的樱花花提取物中含有更多的有效成分，促黑色素生长的效果最优。如果混合提取剂并非小分子多元醇、乙醇和水的组合、或提取剂中小分子多元醇的占比过低(实施例14～19)，都会影响樱花花瓣中有效组分的浸出，进而导致乌发组合物的促黑色素生成功效有所下降。
本发明提供的乌发组合物中，樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物和女贞子提取物四种有效成分协同复配，赋予了所述乌发组合物激活酪氨酸酶和促进黑色素生成的功效，四种成分缺一不可，任一组分的缺失都会导致组合物的功效性降低，甚至不具有激活酪氨酸酶的性能(对比例1～4)。
测试例4
对所述乌发组合物进行动物水平的乌发功效检测，方法如下：
(1)建立动物模型
取健康黑花色豚鼠45只，用剪刀剪去背部黑毛区长毛，不可损伤皮肤；按体重随机分为3组(A组：乌发组合物组；B组：模型对照组；C组：正常对照组)，每组15只，每组均用5％过氧化氢外涂豚鼠受试区40天，每天2次，每次用2mL，使其毛发变为白色。造模成功后，每组随机取一只豚鼠切取适当大小的实验区皮肤组织做病理切片，观察皮肤组织和毛囊的黑色素变化。
(2)实验方法
以上3组豚鼠造模成功后，A组涂抹本发明实施例1提供的乌发精华液(精华液配方与测试例2中的表3相同)，B组涂抹不含有乌发组合物的安慰剂(将表3中的乌发组合物用水替换)，C组不做处理；每日涂抹1次，每次2mL，连续涂抹15天，在1天、5天、10天和15天分别进行观察。
对以上3组的改善效果进行观察，选取用药部位中心9cm2处为观察单位判定效果，A组在用药15天后黑毛＞80％，对白毛的改善效果十分显著；B组和C组在处理15天后效果相当，黑毛比例均明显小于A组，B组的黑毛约为25～30％，对白毛的改善效果不明显；A组(实验组)和B组(模型对照组)的光学图片如图1所示。由此可见，本发明提供的乌发组合物能够有效乌发，改善白发和灰发，逆转了因外界氧化因素导致的白发产生。
测试例5
对应用所述乌发组合物制备成的精华液的豚鼠背部的皮肤进行免疫荧光染色和Western Blot蛋白检测，获得乌发通路靶点的表达水平，水剂精华液的配方与测试例2中的表3相同；具体测试方法如下：
(1)免疫荧光检测
按照测试例3所记载的动物模型建立方法和实验方法构建动物实验模型，用药15天实验结束后，切取适当大小的实验区皮肤组织，用10％甲醛固定，进行常规组织脱水，石蜡包埋，切片进行β-catenin免疫荧光检测。
β-catenin：在毛囊形成和毛发生长过程中，离不开许多信号通路和信号分子的相互调控。在各种信号通路和相关信号分子的协助或者拮抗作用下，控制毛囊的再生、周期、发育。β-catenin通过与细胞核内淋巴细胞增强因子(Lef)/T细胞转录因子结合，激活相关靶基因的转录，促进毛囊干细胞的再生、增殖和分化；另外，研究表明，毛色形成也有β-catenin的参与。
切片经过画圈血清封闭、加一抗、二抗、DAPI复染细胞核、淬灭组织自发荧光、封片后，于荧光显微镜下观察并采集图像，DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的绿光，得到的免疫荧光结果图如图2所示，根据图2可知，实施例1所述乌发组合物制成的精华液处理后的荧光强度显著高于不含乌发组合物的模型对照组，证明本发明所述乌发组合物能够促进β-catenin表达。
(2)豚鼠皮肤组织Western Blot检测β-catenin蛋白水平
按照性能测试3所记载的动物模型建立方法和实验方法构建动物实验模型(A组：涂抹实施例1所述乌发组合物的精华液；B组：不含乌发组合物的安慰剂对照组；C组：涂抹对比例5所述乌发组合物的精华液)，用药15天实验结束后，切取适当大小的实验区皮肤组织，充分研磨粉碎后，加入RIPA裂解液进行裂解、提取蛋白；向获得的蛋白样品中加入SDS-PAGE上样缓冲液，置于沸水中加热10min；然后采用浓度为10％的SDS-PAGE分离蛋白，并通过湿转法将蛋白转至PVDF膜上；一抗二抗免疫反应，化学发光显影与凝胶图象分析，具体操作按说明书进行，得到本发明所述乌发组合物对β-catenin蛋白水平的测试结果图，如图3所示。从图3中可知，与涂抹不含乌发组合物的安慰剂对照组相比，使用实施例1提供的乌发组合物制成的精华液能够显著增加β-catenin蛋白水平，且其效果优于常规乌发组分黑芝麻素(对比例5)。
通过上述实验结果可以得知，本发明提供的乌发组合物能能够促进β-catenin表达，从黑色素形成通路上进行促进黑色素细胞的修复和生长，从根源上促使黑色素细胞再生，令毛囊恢复生产黑色素的功能，从而让白发重新变黑，逆转了因外界氧化因素导致的白发产生。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的乌发组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种乌发组合物，其特征在于，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.05～10重量份、甘草亭酸0.01～7重量份、人参提取物0.1～8重量份和女贞子提取物0.01～5重量份。
2.根据权利要求1所述的乌发组合物，其特征在于，所述樱花花提取物采用如下方法提取得到，所述方法包括：采用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂包括C3～C6小分子多元醇、乙醇和水的组合物；
优选地，所述C3～C6小分子多元醇包括1,2-己二醇、1,2-戊二醇、1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、甲基丙二醇、异戊二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为1,2-己二醇和甲基丙二醇的组合；
优选地，所述提取剂中C3～C6小分子多元醇的质量百分含量为35～55％；
优选地，所述提取剂中乙醇的质量百分含量为15～40％；
优选地，所述提取剂按照质量百分含量包括：C3～C6小分子多元醇35～55％，乙醇15～40％，余量为水；
优选地，所述浸提的温度为60～100℃；
优选地，所述浸提的时间为0.5～3h；
优选地，所述樱花花瓣与提取剂的质量比为1:(40～80)；
优选地，所述樱花花瓣为经过干燥处理和/或粉碎处理的樱花花瓣。
3.根据权利要求1或2所述的乌发组合物，其特征在于，所述樱花花提取物中包括总黄酮、多酚、多糖和皂苷；
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中总黄酮的质量为5.5～7％；
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多酚的质量为0.7～1％；
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中多糖的质量为1.2～1.6％；
优选地，以待提取的樱花花瓣的质量为100％计，所述樱花花提取物中皂苷的质量为0.4～0.6％。
4.根据权利要求1～3任一项所述的乌发组合物，其特征在于，所述樱花花提取物与甘草亭酸的质量比为(1～3):1；
优选地，以所述樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物和女贞子提取物的总质量为100％计，所述樱花花提取物的质量为30～60％，进一步优选为40～50％；
优选地，所述乌发组合物中还包括溶剂；
优选地，所述溶剂为水，或水与醇类溶剂的混合物。
5.根据权利要求1～4任一项所述的乌发组合物，其特征在于，所述乌发组合物按照重量份计包括：樱花花提取物0.5～10重量份、甘草亭酸0.1～5重量份、人参提取物0.1～5重量份和女贞子提取物0.1～5重量份；
所述樱花花提取物采用如下方法提取得到，所述方法包括：采用提取剂浸提樱花花瓣，得到所述樱花花提取物；所述提取剂按照质量百分含量包括：C3～C6小分子多元醇35～55％，乙醇15～40％，余量为水。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的乌发组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将樱花花提取物、甘草亭酸、人参提取物、女贞子提取物与溶剂混合均匀，得到所述乌发组合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水，或水与醇类溶剂的混合物；
优选地，所述醇类溶剂包括乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1,3-丁二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种乌发化妆品，其特征在于，所述乌发化妆品包括如权利要求1～5任一项所述的乌发组合物；
优选地，所述乌发化妆品包括乌发精华液、乌发精油、乌发喷雾、乌发乳液、洗发水、护发素或发膜中的任意一种。
9.一种乌发精华液，其特征在于，所述乌发精华液包括如权利要求1～5任一项所述的乌发组合物。
10.根据权利要求9所述的乌发精华液，其特征在于，所述乌发精华液中乌发组合物的质量百分含量0.1～55％；
优选地，所述乌发精华液中还包括溶剂、保湿剂、pH调节剂、稳定剂、增溶剂、抗氧化剂、增稠剂、防腐剂、增溶剂或芳香剂中的任意一种或至少两种的组合。
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