CN112218648A - 提供二十碳五烯酸油组合物的新方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种通过使用简单技术和最少化精制步骤来制造具有按重量百分比计20％至70％的二十碳五烯酸的油组合物的方法。

Description

提供二十碳五烯酸油组合物的新方法

技术领域

本发明涉及衍生自眼点拟微球藻(N.Oculata)的藻类制剂的工业加工领域，提供包括约20至70％的天然形式或合成形式的EPA的二十碳五烯酸油组合物。这种油组合物可用于多种目的，包括食物补充剂或化妆品。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA)是包含20个碳原子和5个双键的脂肪酸，全部为顺式构型。双键位于5、8、11、14和17位且完整化学名称均为顺式5,8,11,14,17-二十碳五烯酸。常用缩写是EPA。

人体α-亚麻酸合成EPA，其为必需脂肪酸。因此，通常需要补充EPA。这可以通过从食物来源，比如油性鱼直接接收EPA，或通过含有包括EPA的油组合物的膳食补充剂来实现。

EPA可以以磷脂、甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯、酰胺、酯或许多其他类型、盐和/或其他化合物的形式从天然来源获得。在每种情况下，EPA部分通常可以从复杂分子裂解以产生游离酸形式，然后可以将其再次键合至其他复杂分子。这允许提供合成形式的EPA。

可以从天然来源，比如鱼、磷虾或藻类提供含有包括EPA的油组合物的膳食补充剂。

使用鱼和磷虾来获得这种油组合物。然而，微藻被认为是脂质生产的有前途的替代来源。通过相对简单控制微藻培养基的物理和化学性质，可以诱导几种微藻产生特定脂质和脂肪酸。微藻可产生和积累大量脂质(约占干重的20-50％)。脂质在微藻中的积累归因于糖的消耗速率高于细胞生成的速率，这促进过量糖转化成脂质。

另外，因为组合了下列优势，包括藻类的快速生长速率、二氧化碳消耗、与农业没有竞争和在海水中生长，藻类被认为是生物质、油和其他成分的可持续来源。

在用于获得脂肪酸和具体地EPA的许多藻类物种中，眼点拟微球藻被认为是有利的物种，因为其产生更高含量的EPA并且明显不产生二十二碳六烯酸(DHA)。具体而言，由眼点拟微球藻产生的超过三分之二的脂肪酸由EPA、棕榈酸和棕榈油酸组成。

存在许多方法可用于提供包括上述形式之一的EPA的油组合物。这些方法包括两个主要部分，即通常借助于溶剂从藻类中提取油，和通过下列方法的结合，比如脱胶、苛性碱中和、漂白、除臭、冬化来精制原油。相比于鱼油，藻类油包含大量的叶绿素，叶绿素的去除是与提供适合在食品补充剂、化妆品等中使用的EPA油组合物相关的重要步骤。还可以使用其他技术以提供具有提高的EPA含量的最终产物，例如硅胶色谱或尿素加合物的形成。

WO2014105576公开了用于提供高度生物利用度EPA制剂的方法。在这些制剂中，EPA可作为游离脂肪酸或糖脂或磷脂缀合物。如其中所公开的，提供了经历采用有机溶剂提取的藻类糊。在除去非脂质有机物的标准程序后，借助超临界CO₂从极性脂质提取和分离中性脂质，包括游离脂肪酸、甘油二酯和甘油三酯。随后使该提取物进行水解以提供游离脂肪酸，然后将游离脂肪酸分馏以产生EPA游离脂肪酸的浓缩物。在之后的步骤中将该浓缩物与之前分离的极性脂质结合以提供本专利申请的制剂。

可选地，本专利申请公开了与上述方法类似的方法，其中用乙醇提取藻类糊，用烷烃溶剂处理并且之后通过从硅胶吸附剂洗脱分离中性和极性脂质。同上，使中性脂质进行水解并从硅胶吸附剂进一步洗脱。

超临界二氧化碳和硅胶吸附剂的洗脱都是成熟且复杂的技术。换句话说，当油组合物包括按重量百分比计20-70％的EPA时，包括EPA的油组合物被公认为对于多种目的是有利和有用的。

因此，需要通过使用简单的技术仍然提供具有期望的EPA含量的最终产物的成本效益的方法来制造具有按重量百分比计20至70％的EPA的油组合物。

定义

如本文所使用的，术语“EPA”可指天然或合成形式的EPA。这些形式可以是EPA的酯、EPA的盐、甘油单酯EPA、甘油二酯EPA或甘油三酯EPA或游离酸形式的EPA。EPA的酯可以是与醇，特别是低级烷基醇的酯，更具体地是乙酯。EPA的盐可以是与氨基酸，特别是与赖氨酸的盐。EPA的盐也可以是碱金属或碱土金属的盐。甘油单酯EPA、甘油二酯EPA或甘油三酯EPA指在甘油分子的一个、两个或所有三个可用位置被一个或多个EPA分子酯化的甘油分子，视情况而定。

“EPA”的优选形式是EPA与低级烷基醇的酯、与氨基酸的盐、EPA的游离酸和甘油单酯EPA、甘油二酯EPA或甘油三酯EPA。更优选地是EPA与乙醇的酯或与赖氨酸的盐。

“酸”指包含氢并在水中或溶剂中离解以产生阳性氢离子的任何化合物，和路易斯酸，包括但不限于酸，比如盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、三卤乙酸(例如TEA)、溴化氢、马来酸、磺酸比如甲苯磺酸和樟脑磺酸、丙酸比如(R)-氢丙酸、邻苯二甲酸比如N-[(R)-1-(1-萘基)乙基]邻苯二甲酸、酒石酸比如L-酒石酸和二芐基-L-酒石酸、乳酸、樟脑酸、天冬氨酸、香茅酸、BCl₃、BBr₃等。因此，该术语包括弱酸，比如乙酸和硫化氢；强酸比如甲磺酸、三氟乙酸等。

当在本文中使用时，“碱”包括在水中或溶剂中接受质子的氢氧化物或醇盐、氢化物或化合物比如胺及其衍生物。因此，示例性碱包括但不限于碱金属氢氧化物和醇盐(即MOR，其中M是碱金属比如钾、锂或钠，和R是氢或烷基，如上面所定义的，更优选地，其中R是直链或支链C_1-5烷基，因此包括但不限于氢氧化钾、叔丁醇钾、叔戊醇钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、氢氧化锂等)；其他氢氧化物比如氢氧化镁(Mg(OH)₂)或氢氧化钙(Ca(OH)₂)、氢氧化钡(Ba(OH)₂)；碱金属氢化物(即MH，其中M如上面所定义，因此包括但不限于氢化钠、氢化钾和氢化锂)；烷基化的二硅叠氮化物，诸如例如六甲基二硅叠氮化钾和六甲基二硅叠氮化锂；碳酸盐比如碳酸钾(K₂CO₃)、碳酸钠(Na₂CO₃)、碳酸氢钾(KHCO₃)和碳酸氢钠(NaHCO₃)、氢氧化烷基铵比如氢氧化四丁胺(TBAH)等。水性碱包括金属氢氧化物，例如第1族/第2族金属，比如Li、Na、K、Mg、Ca等的氢氧化物(例如水性氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等)、烷基胺氢氧化物和水性碳酸盐。非水性碱包括但不限于胺及其衍生物，例如三烷基胺(例如Et₃N、二异丙基乙胺等)，和芳香胺(例如Ph-NH₂、PhN(Me)H等)；碱金属醇盐；碱金属氢化物；烷基化二硅叠氮化物；和非水性碳酸盐。

术语“脂质”可以指中性或极性脂质。极性脂质主要包括糖脂和磷脂。中性脂质主要包括脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯。二十碳五烯酸(EPA)可以是共轭的，并且是这些形式中任一种的一部分，或作为游离脂肪酸。

术语“重量百分比”是指每100克物质中EPA的量。通过气相色谱法测量重量百分比，并将结果提供为％w/w测定法(按原样)。

术语“纯度”用气相色谱法测量，并且是指每种色谱法观察到的脂肪酸乙酯的量相对于所有色谱法观察到的化合物的总量。它被提供为所检查的化合物的％纯度。

具体实施方式

本发明提供了用最少的一系列步骤处理眼点拟微球藻的微藻生物质的方法，从而提供包括按重量百分比计约20％至约70％的EPA的油组合物。

根据本发明的第一个实施方式提供了一种方法，其用于制备包括按重量百分比计约20％至约70％的来自眼点拟微球藻的二十碳五烯酸(EPA)的油组合物，包括以下步骤：

a)提供来自眼点拟微球藻的微藻生物质；

b)通过进行细胞壁的破碎，并用水相和有机相的混合物或有机相处理，从步骤a的微藻生物质提取脂质，提供包括EPA的原油提取物；

c)使来自步骤b的原油提取物经过酯交换条件，从而将EPA和其他脂肪酸酯交换为它们相应的乙酯，并且因此提供油相。

d)通过使来自步骤c的油相经历选自用漂白土处理、冬化、用尿素处理的一种或多种精制方法来精制来自步骤c的油相，以提供包括按重量百分比计约20％至约70％的EPA的油组合物；

或者

c’)通过使来自步骤b的油相经历选自用漂白土处理、冬化、用尿素处理的一种或多种精制方法来精制来自步骤b的油相，以提供包括按重量百分比计约20％至35％的EPA的油组合物；

d’)使来自步骤c’的原油提取物经历酯交换条件，从而将EPA和其他脂肪酸酯交换为它们相应的乙酯，并且因此提供油相；

e)任选地，使油组合物经历进一步处理，以将EPA乙酯转化为其他形式的EPA，并且因此提供其他油组合物。

可以根据本领域已知的标准技术将步骤a中提供的眼点拟微球藻的微藻生物质冷冻干燥、冻干或加工。微藻生物质的有用形式可以是干燥粉末的形式。

干燥微藻生物质有利于进一步加工。干燥是指从主要完整的生物质除去游离的表面水分/水或从均质(例如通过微粉化)生物质的浆料除去表面水。在一些情况下，干燥生物质可促进更有效的微藻油提取过程。可通过技术人员已知的方法来干燥微藻生物质。干燥方法对于本发明的性能不是关键的。

步骤b进行的提取来自微藻生物质的脂质通过破坏细胞壁并用有机相或水相与有机相的混合物处理细胞碎片来实现。

存在许多本领域可用的以及技术人员众所周知的藻类细胞的细胞破碎的方法。这些方法的实例是机械挤压、声波振荡、微波辐射、渗透冲击、珠粒打浆、高压均质化、共混(固体剪切破坏)、激光、酶消化、使用溶剂和任何后面的方法的组合。

通过用有机相或水相和有机相的混合物处理破碎的细胞，细胞壁的破碎有利于脂质的提取。水相可以是无机盐比如氯化钠的水溶液。适合于该目的的其他水相是含有螯合剂比如EDTA或螯合剂与无机盐比如氯化钠等的混合物的那些。有机相可包括一种有机溶剂或有机溶剂的混合物。用于从藻类提取脂质的示例性溶剂是二氯甲烷、氯仿、甲醇、异丙醇、乙氧基乙烷、丙酮、2-乙氧基乙醇、乙醇。

步骤b通常通过进行如上所述的细胞壁的破碎，并使它们与有机相或水相与有机相的混合物接触来执行。

步骤b可任选地包括使用抗氧化剂以防止提取的油在过程期间氧化。用于该目的的合适的抗氧化剂是生育酚、BHT(丁基化的羟基甲苯)、卵磷脂、牛至提取物、迷迭香提取物、柠檬酸和/或抗坏血酸。

提取的脂质部分主要包含如上面定义的脂质，以及微量组分蛋白质、碳水化合物、矿物质和生物质纤维。

在从微藻生物质提取脂质后，混合物经过标准程序比如过滤和/或离心，并用一种或多种水相进一步处理以除去未溶解的固体和上面提到的其他微量组分。有机相的分离和有机溶剂的去除提供原油提取物。

步骤b获得的原油提取物包含包括脂肪酸等化合物的脂质，该脂肪酸为包括EPA的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯和游离酸的形式。该混合物经过步骤c的酯交换条件，从而将以游离脂肪酸或上面定义的其他形式存在的所有脂肪酸转化为相应的乙酯。在这样的条件下，EPA也被转化为其相应的乙酯。技术人员众所周知的酯交换条件可包括在升高的温度或室温下，在大量过量的乙醇存在下用催化量的强碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾，或任何其他碱金属氢氧化物处理，这导致脂肪酸甘油三酯转化为相应的乙酯。酯交换也可以用酸性催化剂实现。当转化完成时，淬灭、提取、过滤并除去溶剂提供油相。在该步骤，还除去了由酯交换反应形成的甘油。

在步骤d实现了从步骤c获得的油相中除去一些其他不期望的油相杂质，即叶绿素和其他色素、极性脂质比如磷脂、氧化副产物和其他不期望的极性化合物。就多不饱和脂肪酸含量和杂质含量而言，油的类型面临该技术的效率和所使用的方法的脱色效率的挑战。

因此，步骤c获得的油相经历一种或多种精制方法，选自用漂白土处理、冬化和用尿素处理。

用合适的漂白剂进行漂白。常用漂白剂是天然粘土或土、活化粘土或土和碳。如果油容易被漂白，则使用天然粘土；如果油不容易被漂白，则使用酸活化的粘土。膨润土、海泡石、硅镁土、富勒土、蒙脱石是用于油精制方法的容易得到的漂白剂。

冬化或分馏是当油处于零下温度时，依赖于去除在受控结晶中形成的固体的技术。由于每种脂肪酸的不饱和度和特定构型引起的熔点和溶解度上的差异彼此不同允许油在多不饱和脂肪酸中的纯化或富集。

尿素结晶是依赖于在醇溶液中尿素与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸之间形成络合物的技术。络合物结晶并通过过滤去除，同时游离的非络合的脂肪酸保持为可溶的，因而溶液被富集。夹杂物分馏取决于脂肪酸的不饱和度而不是它们的物理性质，例如熔点、溶解性等。

可选地，其中使用一种或多种上述精制方法的精制步骤可以在步骤b后直接进行，因此为步骤c’。在这种情况下，酯交换步骤，即d’，在精制步骤后立即进行。在步骤c或d’的酯交换和步骤d或c’的精制处理后提供了一种油组合物，其包括由气相色谱法测定的按重量百分比计约20％至约70％的以其乙酯形式存在的EPA。

步骤e是任选的，并且可进一步包括处理以将油组合物中包含的EPA的乙酯转化为另一种形式，例如其他酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、盐或游离酸。因此，通过该进一步处理可提供另外的油组合物。这包括技术人员众所周知的标准方法，并且如果另一种甘油酯是期望的，在包括能够与羧基形成酯键的基团的化合物比如醇、甘油或氨基酸的存在下可包括酸或碱处理。可选地，其可以包括用碱处理以提供EPA的盐或其游离脂肪酸形式。

实施例

使用十二烷酸酯作为内标，通过气相色谱测定和测量纯度，。

实施例1：提取富含二十碳五烯酸的甘油三酯

在装备有机械搅拌器的5L 2-颈圆底烧瓶中装入400g眼点拟微球藻、650mgα-生育酚、1.2L D.M.水、0.4L 20％wt.的氯化钠溶液、1.6L二氯甲烷和0.8L甲醇。将混合物用氩气冲洗并在20-25℃下搅拌2小时。通过过滤分离出固体并收集滤液。之后，添加2L二氯甲烷/甲醇2：1的混合物并用3L 1％wt.的氯化钠溶液洗涤该混合物。小心地分离形成的两层，并且将下部有机层在1g无水硫酸钠上通过搅拌干燥30min。在减压下蒸馏出溶剂，并且油状残留物在高真空下干燥3-5小时，以得到110g富含二十碳五烯酸的甘油三酯，呈粘性黑绿色油(作为脂肪酸甲酯的EPA纯度：28.9％)。

实施例2：富含二十碳五烯酸的乙酯粗混合物

在惰性气氛下在装备有磁力搅拌棒、温度计和冷凝器的1L 2-颈圆底烧瓶中装入100g富含二十碳戊烯酸的甘油三酯和0.3L无水乙醇。之后，在20-25℃下在惰性气氛下以一锅法添加1.5g氢氧化钾，并将反应物料在相同温度下继续搅拌达2-3小时。通过添加30mlD.M.水淬灭反应物料。在减小的压力下从反应物料去除过量的溶剂至～0.2L的最终体积。将残留物用1L环己烷稀释并与0.4L D.M.水和0.1L 20％wt.的氯化钠溶液一起转移到3L分液漏斗中。洗涤有机层，并且然后分离出，并放在一边。水层用2×0.2L环己烷洗涤。将提取物和洗涤液合并(pool)并在无水硫酸钠上干燥。在旋转蒸发仪中蒸馏出溶剂，并在高真空中将油性残留物干燥3-5小时以得到85g富含二十碳五烯酸的乙酯粗混合物，呈黑绿色油(EPA纯度：30.3％；EPA GC-测定法：20.8％)。

实施例3：通过用蒙脱石K10漂白土处理来纯化粗乙酯混合物

在装备有机械搅拌器的3L 3-颈圆底烧瓶中装入85g富含二十碳五烯酸的乙酯粗混合物、0.85L环己烷和425g蒙脱石K10。用氩气冲洗混合物，并在环境温度下在惰性气氛中搅拌30分钟-1小时。然后，通过使混合物在减小的压力下通过425g蒙脱石K10滤垫来过滤出固体。用0.85L环己烷洗涤滤垫，并将滤液和洗涤液合并。在旋转蒸发仪中去除溶剂，并且在高真空下干燥油状残留物，以得到56g富含二十碳五烯酸的乙酯混合物，呈浅黄色油(EPA纯度：28.9％；EPA GC-测定法：25.6％)。

实施例4：通过冬化第一次富集乙酯混合物中的EPA

在装备有磁力搅拌棒的100ml圆底烧瓶中装入50g富含二十碳五烯酸的乙酯粗混合物和2.5ml己烷。将溶液冷却并在-20℃下搅拌5小时。然后通过冷却过滤分离出形成的结晶。在旋转蒸发仪中在减压下浓缩滤液，得到23.8g富含二十碳五烯酸的乙酯混合物，呈黄色油(48.9％；EPA GC-测定法：46.6％)。

实施例5：通过尿素处理第二次富集乙酯混合物中的EPA

在装备有磁力搅拌器的250ml圆底烧瓶中装入69ml EtOH和46g尿素。在搅拌下将该混合物加热到高达50-55℃，直到产生澄清溶液。然后，缓慢加入23g富含二十碳五烯酸的乙酯混合物，同时在惰性气氛下在50-55℃下搅拌。然后，将该混合物从加热移开，并允许缓慢达到环境温度(20-22℃)。在惰性气氛下搅拌，维持20小时。接下来，用3×200ml己烷提取该混合物。合并上层己烷层，并用200mL DM水洗涤。将水相用2×50ml己烷反洗涤，并将来自提取物和洗涤液的己烷层合并并在1g无水硫酸钠上干燥。在旋转蒸发仪中在减压下蒸馏出溶剂，并且在高真空下将油状残留物干燥3小时，以得到7.4g高度富集EPA的乙酯混合物，呈黄色油(EPA纯度：83.5％；EPA GC-测定法：70.2％)。

Claims (7)

1.一种用于制备油组合物的方法，所述油组合物包括按重量百分比计约20％至约70％的来自眼点拟微球藻的二十碳五烯酸(EPA)，所述方法包括下列步骤：

a)提供来自眼点拟微球藻的微藻生物质；

b)通过进行所述细胞壁的破碎并用水相或有机相的混合物或用有机相处理，从步骤a的微藻生物质提取脂质，提供包括EPA的原油提取物；

c)使来自步骤b的所述原油提取物经历酯交换条件，从而将EPA和其他脂肪酸酯交换为它们相应的乙酯，并且因此提供油相；

d)通过使来自步骤c的油相经历选自用漂白土处理、冬化和用尿素处理的一种或多种精制方法精制来自步骤c的油相，以提供包括按重量百分比计约20％至约70％的EPA的油组合物；

或者

c’)通过使来自步骤b的油相经历选自用漂白土处理、冬化和用尿素处理的一种或多种精制方法精制来自步骤b的油相，以提供包括按重量百分比计约20％至约70％的EPA的油组合物；

d’)使来自步骤c’的所述原油提取物经历酯交换条件，从而将EPA和其他脂肪酸酯交换为它们相应的乙酯，并且因此提供油相；和

e’)任选地，使油组合物经历进一步处理，以将EPA乙酯转化为其他形式的EPA，并且因此提供其他油组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述按重量百分比计约20％至约70％的二十碳五烯酸(EPA)是选自酯、盐、酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯或其混合物的形式。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述按重量百分比计约20％至约70％的二十碳五烯酸(EPA)是选自低级烷基醇、氨基酸盐、游离酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯及其组合的形式。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酯是乙酯。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述盐是与赖氨酸的盐。

6.根据权利要求3-5所述的方法，其中步骤b的处理通过使用水相和油相的混合物进行。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法可以获得的油组合物。