CN112213427B - 一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法，涉及利用动物性生物样品的生物监测和组织脏器的毒理学研究领域。收集动物性海产品和啮齿类实验动物器官等生物样品，将样品内的塑料颗粒通过碱液消解释放，利用消解产物本身的性质对纳米塑料进行表面修饰，再利用固相吸附剂吸附、包裹混凝沉淀等作用萃取纳米塑料；最终用Pyr‑GC‑MS联用平台检测塑料特异性指示化合物浓度，并将指示化合物质量浓度转换为纳米塑料的质量。解决了常规膜过滤提取组织样品中塑料时因滤膜孔径不同及滤膜阻塞等带来的问题。为纳米塑料导致的健康问题以及人群暴露风险研究提供一种痕量和超痕量的污染分析手段。方法简单、成本低、效益高且适用范围广。

Description

一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法

技术领域

本发明涉及生物监测和组织脏器的毒理学领域，特别是涉及一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法。

背景技术

自20世纪中叶塑料领域开始发展以来，全世界的塑料产量成指数型增长，塑料制品因其价廉、耐用等优势在各个领域广泛使用，特别是一次性塑料制品使用量的大量增加，直接导致了塑料废弃物的逐年上升。由于塑料垃圾的管理不善，海洋便成为了大多数塑料垃圾的最终归宿。这些塑料垃圾在海洋环境中的大量出现，直接影响了海洋生物的生存和生长。除了大颗粒的塑料垃圾外，经过物理和化学作用产生的，可进入体液循环的纳米塑料是人群通过摄食海产品等食物暴露塑料污染的主要来源。

已有研究表明微纳米塑料存在于整个海洋环境中，并对海洋生物造成威胁。这些污染降低或影响了海洋生物的运动能力、觅食行为和免疫系统功能，改变了脂质代谢并产生了神经毒性([1]Barbosa F,etal.A critical viewpoint on current issues,limitations,and future research needs on micro-and nanoplastic studies:Fromthe detection to the toxicological assessment.Environmental research 2020；182:109089；[2]Barria C,et al.Effect of nanoplastics on fish health andperformance:A review.Marine pollution bulletin 2020；151:110791.)；造成内分泌失调、营养不良、炎症、化学中毒、生长受阻、生育力下降等([1]Barbosa F,etal.A criticalviewpoint on current issues,limitations,and future research needs on micro-and nanoplastic studies:From the detection to the toxicologicalassessment.Environmental research 2020；182:109089；[3]Peng L,etal.Micro-andnano-plastics in marine environment:Source,distribution and threats-AreviewScience of the Total Environment 2020；698:12；[4]Sussarellu R,etal.Oyster reproduction is affected by exposure to polystyrene microplastics.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2016；113:2430-2435；[5]von Moos N,etal.Uptake andEffects of Microplastics on Cells and Tissue of the Blue Mussel Mytilusedulis L.after an Experimental Exposure.Environ.Sci.Technol.2012；46:11327-11335；[6]Marsden P,et al.Microplastics in drinking water；9241516194；WorldHealth Organization2019.)；也会由于个体、器官、组织、细胞和分子水平的机械损伤而引起死亡风险等([3]Peng L,etal.Micro-and nano-plastics in marine environment:Source,distribution and threats-A review.Science of the Total Environment2020；698:12；[7]Ivleva N,et al.Microplastic in Aquatic Ecosystems.Angew.Chem.-Int.Edit.2017；56:1720-1739；[8]Nanoplastic should be betterunderstood.Nat.Nanotechnol.2019；14:299-299.)。然而，关于海洋生物样品中纳米塑料的提取和定量方法仍是空白。为了更好地评估纳米塑料可能造成的人类健康风险并为其治理提供参考依据，需要填补该研究空白。

尽管近5年塑料研究飞速发展，并有研究尝试从生物监测层面研究塑料颗粒的暴露，但是检测技术仅局限于表征微米级粒径的塑料，且各研究之间由于采取的提取和定量方法不一，使得各种结果之间缺乏可比性([9]Li P,et al.Analytical methods andenvironmental processes of nanoplastics.Environ.Sci.2020；94:88-99.)，导致各种检测技术推广性差，并且缺乏组织样品中纳米塑料颗粒的定性和定量方法。因此，亟需研发一种符合经济效益、操作简单，适用性广、且通用的组织样品中纳米塑料的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于为了直观了解纳米塑料在不同动物性生物样品(或组织、器官)中的分布，提供一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法。

本发明包括如下步骤：

1)样品预处理：取适量冷冻生物样品室温解冻；

2)碱液消解：将10％KOH溶液加入到玻璃瓶中，配套聚四氟乙烯瓶盖后将其放入预热的水浴锅中水浴消解后取出，在通风橱内将消解瓶中的消解液转移到玻璃离心管中；

3)固-固萃取：将固相吸附剂煅烧预处理后加入消解液中，超声震荡混匀；待其自然沉降，再离心去除上层液体至固-液分界面；最后离心管中加入甲醇，洗脱粘在瓶壁上的固相物质残留，得固体沉积物；

4)干燥、均质：将步骤3)所得固体沉积物干燥后均质；

5)将步骤4)收集的固相均质放入裂解杯中称重，选择合适的色谱柱，在仪器抽真空完成后，将称量好的样品进样，在设置好裂解温度和升温程序的Pyr-GC-MS进行分析。

在步骤1)中，所述生物样品选自脂肪含量低或适中的动物性生物样品和动物组织脏器(如动物肝脏等)；所述冷冻动物性样本可置于-20℃冰箱内保存。

在步骤2)中，动物性生物样品和KOH溶液的质量体积比可为1︰8～10，所述水浴温度可为45℃，消解的时间可为60～72h；消解产物氨基酸和少量脂肪酸盐对PS进行表面修饰，K⁺的存在增加溶液稳定性，增加硅酸盐和PS的异质聚集沉淀。

在步骤3)中，所述固相吸附剂采用7μm的具有团聚效应的硅藻土进行固-固吸附，包裹共沉淀；所述固-固萃取的具体步骤可为：将7μm固相硅藻土700～800℃煅烧1～2h，向每5mL消解液中添加0.02g硅藻土超声震荡，使充分混匀充满整个溶液中，待其自然沉降1h左右，再以1000g的离心力离心5min后去除上层液体至固-液分界面，离心管中加入400μL甲醇，利用表面活性剂修饰的原理洗脱粘在瓶壁上的固相PS及其聚合物。

在步骤4)中，所述干燥是置于80℃烘箱中完全干燥；所述均质可利用铁质长柄耳勺将干燥后的样品均质，使目标待测物均匀分散在固相吸附剂上。

在步骤5)中，硅藻土作为固相吸附剂可有效充当纳米PS粒子的载体，准确称量质量后再进行Pyr-GC-MS分析使结果更可靠，上机分析是利用Pyr-GC-MS对被硅藻土吸附的纳米塑料裂解，并定性和定量检测指示性裂解产物的分子离子；所述合适的色谱柱可采用Frontier的UA5-30M-0.25F不锈钢色谱柱；所述裂解温度为600℃，界面温度300℃，气相箱体升温程序为50℃保持2min,20℃/min升温至300℃，300℃保持10min。

本发明提供一种评估纳米塑料暴露后不同组织内纳米塑料的提取和定量检测方法。本发明收集了动物性海产品和啮齿类实验动物器官等生物样品，将样品内的塑料颗粒通过碱液消解释放，利用消解产物本身的性质对纳米塑料进行表面修饰，再利用固相吸附剂吸附、包裹混凝沉淀等作用萃取纳米塑料；最终用Pyr-GC-MS联用平台检测塑料特异性指示化合物浓度，并将指示化合物质量浓度转换为纳米塑料的质量。

本发明的关键点在于利用消解产物(氨基酸、脂肪酸盐)自身性质作为修饰纳米塑料的表面活性剂和稳定剂。同时，硅藻土在碱性条件下表面生成结晶状的硅酸盐，此时修饰后的硅藻土同样被消解产物修饰，利用修饰后的硅藻土自身性质对修饰后的PS进行同源吸附、异质聚集、以及包裹作用等达到共沉降的目的。这种固-固萃取(PS-SSE)技术极大地简化了提取组织样品中纳米塑料的流程，最后通过Pyr-GC-MS联用仪器平台检测富集的纳米塑料。通过目标聚合物PS的三聚体来定性，利用三聚体的峰面积进行定量。本发明填补了组织样品中纳米塑料提取方法的空白，首次根据异质聚集的原理利用固相吸附剂对固相纳米PS进行提取，解决了常规膜过滤提取组织样品中塑料时因滤膜孔径不同及滤膜阻塞等带来的问题。将为纳米塑料导致的健康问题以及人群暴露风险研究提供一种痕量和超痕量的污染分析手段。本发明的核心保护点在于提供简单的、成本低、效益高且适用范围广的针对不同动物组织生物样品中纳米塑料进行检测技术。

因此，本发明具有如下突出的技术效果：

1.本发明基于传统热裂解-气相色谱质谱分析平台，其推广性强。

2.本发明利用动物性组织样品，弥补了动物性生物体内纳米塑料提取和定量的空白。

3.本发明可以对同一生物体内不同组织中的纳米塑料进行分析，揭示纳米塑料在同一生物组织或不同器官之间的迁移转化。

附图说明

图1为70nm的1μg/μL PS的Pyr-GC-MS定量离子提取色谱图。

图2为体系的理化特性对吸附效果影响的柱状图(消解液、KOH溶液和纯水体系)。

图3为70nm和2μm PS在不同尺寸硅藻土存在下吸附效果的柱状图(0.07μm和2μm)。

图4为牡蛎实际样品中目标物PS的Pyr-GC-MS定量离子提取色谱图。

图5为70nm暴露小鼠胃肠道中PS的Pyr-GC-MS定量离子提取色谱图。

图6为70nm暴露小鼠肾脏中PS的Pyr-GC-MS定量离子提取色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明实施例包括以下步骤：

(1)样品预处理：所述生物样品选自脂肪含量低或适中的动物性生物样品；所述冷冻动物性样本可置于-20℃冰箱内保存；取适量冷冻生物样品，放入洁净的通风橱内室温解冻；

(2)水浴碱液消解：按照每g组织(湿重)添加8～10mL 10％KOH溶液加入到80mL肖特耐碱玻璃瓶中，配套聚四氟乙烯瓶盖后将其放入预热的水浴锅中，45℃水浴消解60～72h后取出消解玻璃瓶，在通风橱内将消解瓶中的消解液转移到玻璃离心管中；动物性生物样品和氢氧化钾(KOH)溶液的质量体积比为1︰(8～10)，所述水浴温度为45℃，消解的时间为60～72h。消解产物氨基酸和少量脂肪酸盐对PS进行表面修饰，K⁺的存在增加溶液稳定性，增加修饰后的硅酸盐和PS的异质聚集的可能；

(3)固-固萃取：固相吸附剂采用7μm的具有团聚效应的硅藻土进行固-固吸附，包裹共沉淀；所述固相7μm硅藻土700～800℃煅烧1～2h，向每5mL消解液中添加0.02g硅藻土超声震荡，充分混匀充满整个溶液中，待其自然沉降1h左右，再以1000g的离心力离心5min后去除上层液体至固-液分界面，离心管中加入400μL甲醇，利用表面活性剂修饰的原理洗脱粘在瓶壁上的固相PS及其聚合物；

(4)干燥、均质：所述干燥的条件是80℃烘箱干燥；均质使目标待测物均匀分散在固相吸附剂中；

(5)Pyr-GC-MS分析：将步骤(4)收集的固相均质放入裂解杯中称重，选择合适的色谱柱，在仪器抽真空完成后，将称量好的样品进样，在设置好裂解温度和升温程序的Pyr-GC-MS进行分析。固相硅藻土吸附剂可有效充当纳米PS粒子的载体，使准确称量质量后的Pyr-GC-MS分析更可靠，上机分析是利用Pyr-GC-MS对经过固相吸附后的纳米粒子进行定性定量检测，色谱柱可采用Frontier的UA5-30M-0.25F不锈钢色谱柱；所述裂解温度为600℃，界面温度300℃，升温程序为50℃保持2min,20℃/min升温至300℃，300℃保持10min。

以下给出具体实施例。

本实施例设计基于动物性生物样品组织器官中PS浓度的检测，其具体步骤如下：

一、实际环境中小鼠食源性暴露70nm PS实验和实际环境中的牡蛎样品

为探索人类通过饮食暴露微纳米塑料的健康风险，采用超市购买的牡蛎，按照食用标准进行清洗后放在玻璃瓶中，-20℃冰箱中短期冻存备用。为验证提取方法的可行性，通过饮食暴露将70nm PS均匀混入饲料中进行饮食暴露小鼠。

二、牡蛎样品的消解

消解前，牡蛎样品在通风橱中解冻；小鼠暴露9个月后处死，取各种组织脏器。以上动物性生物样品称重后以1︰(8～10)的质量体积比加入10％KOH后装入肖特玻璃瓶中，密封后放入水浴锅中，45℃消解60～72h。

三、固-固吸附

700～800℃煅烧硅藻土后，按照每5mL消解液加入0.02g硅藻土，通过超声、震荡使硅藻土均匀分散在消解液中。静止1h左右，待整个PS-SSE异质聚集物沉降完全，再以1000g离心力离心5min确保固体全在离心管底部，将离心管取出后去除上层液体至分层界面，加入低沸点的400μL甲醇冲洗整个瓶壁。

四、干燥、均质

将上述步骤得到的物质放入80℃烘箱中干燥完全，再利用长柄耳勺捣碎均质，裂解前将其放入裂解杯中进行称重。

五、目标物的检测

使用热裂解-气相色谱质谱连用平台检测PS聚合物，使用美国安捷伦公司单四极杆气质联用系统，在全扫描模式和选择离子扫描模式下，通过MassHunter软件进行保留时间校正、获取特征峰离子质谱以及样品相关的离子信息。

测试前通过1μg/μL 70nm PS的5个重复测量的日变化来评估仪器稳定性，并且在测试中根据标准品的浓度梯度峰面积比对仪器衰减造成的峰变化来进行校正。

本实施例1μg/μL目标物的Pyr-GC-MS定量离子提取色谱图见图1；萃取体系的理化特性对吸附效果影响的定量离子提取色谱图见图2；70nm和2μm不同粒径PS在不同尺寸硅藻土存在下的提取柱状图见图3；牡蛎实际样品中目标物的Pyr-GC-MS定量离子提取色谱图见图4；小鼠暴露70nm的PS后，胃肠道和肾脏中PS的Pyr-GC-MS定量提取柱状图见图5和6。从图1标准品的目标物的色谱质谱图可以看出标准品PS的色谱、质谱峰可获得基线分离，且峰形对称。尽管PS的裂解产物有多个产物峰，但由于苯乙烯等产物的特异性较差，因此常选择三聚体作为PS定性和定量的指标，提取离子为m/z91。从图2可以看出，在KOH和水溶液中吸附率明显下降，利用牡蛎消解产物的存在，显著增加了PS的回收率，并且空白处理后发现了牡蛎消解产物的存在不影响PS的峰。从图中可以看出，对牡蛎消解产物的目标物定性和定量，选三聚体作为特异性指示化合物是合适的。从图3不同粒径的硅藻土对不同粒径PS吸附的Pyr-GC-MS定量结果显示：吸附效果受粒径效应的影响且存在显著差异；从图4牡蛎实际样品中目标物的Pyr-GC-MS定量离子提取色谱图中可看出实际样品中PS的峰存在。对于更复杂的生物基质，需要将特异性指示化合物的特征离子信息和色谱保留时间信息结合来定性相应的目标物，根据指示化合物的色谱峰面积来定量。从图5和6小鼠暴露70nm的PS结果看，胃肠道和肾脏中PS的Pyr-GC-MS定量结果可以证明该发明可以有效提取小鼠组织/脏器中蓄积的纳米塑料颗粒。

综上，本发明实施例以双壳类生物样品和暴露于70nm聚苯乙烯(PS-NP)的小鼠组织脏器为例，将生物样品消解成分子态，释放出纳米粒子，再利用硅藻土对其进行混凝吸附，利用热裂解-气相色谱质谱(Pyr-GC-MS)联用平台检测所吸附纳米塑料的浓度，最终利用目标塑料的特异性指示化合物进行定性、定量。利用强碱性条件消解生物样品，利用消解产物氨基酸、脂肪酸盐等来维持纳米聚苯乙烯(PS-NP)在溶液中的稳态。基于胶体性质的PS-NP表面被消解产物修饰后与硅藻土之间的吸附、同源聚集和包裹共沉淀等混凝机制，实现了对目标分子的吸附，同时组织消解产物本身也促进了PS-NP同硅藻土的异质聚集。利用该种固-固(PS-SSE)混凝吸附萃取技术极大地简化了提取动物性生物样品中痕量纳米塑料的流程，最后通过Pyr-GC-MS联用平台直接检测干燥的吸附有PS的硅藻土，进而通过PS三聚体指示化合物计算所吸附的PS质量浓度。

本发明利用固-固萃取吸附技术，通过吸附、异质聚集以及包裹等过程萃取生物样品中的PS，为检测生物组织样本中纳米塑料污染提供了新方法。相较于其它塑料颗粒提取和定量技术，本发明简化了样品前处理流程，提高了聚苯乙烯纳米颗粒检测的准确性，为组织样品中纳米塑料的提取和定量提供了新的方案和技术支持。填补了动物性组织样品中纳米塑料提取和定量检测的空白。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)样品预处理：取适量冷冻生物样品室温解冻；

2)碱液消解：将10％KOH溶液加入到玻璃瓶中，配套聚四氟乙烯瓶盖后将其放入预热的水浴锅中水浴消解后取出，在通风橱内将消解瓶中的消解液转移到玻璃离心管中；动物性生物样品和KOH溶液的质量体积比为1︰8～10；所述水浴温度为45℃，消解的时间为60～72h；

3)固-固萃取：将固相吸附剂煅烧预处理后加入消解液中，超声震荡混匀；待其自然沉降，再离心去除上层液体至固-液分界面；最后离心管中加入甲醇，洗脱粘在瓶壁上的固相物质残留，得固体沉积物；

所述固-固萃取的具体步骤为：将7μm固相硅藻土700～800℃煅烧1～2h，向每5mL消解液中添加0.02g硅藻土超声震荡，使充分混匀充满整个溶液中，待其自然沉降1h，再以1000g的离心力离心5min后去除上层液体至固-液分界面，离心管中加入400μL甲醇，利用表面活性剂修饰的原理洗脱粘在瓶壁上的固相PS及其聚合物；

4)干燥、均质：将步骤3)所得固体沉积物干燥后均质；

5)将步骤4)收集的固相均质放入裂解杯中称重，选择合适的色谱柱，在仪器抽真空完成后，将称量好的样品进样，在设置好裂解温度和升温程序的Pyr-GC-MS进行分析；

所述合适的色谱柱采用Frontier的UA5-30M-0.25F不锈钢色谱柱；所述裂解温度为600℃，界面温度300℃，气相箱体升温程序为50℃保持2min，20℃/min升温至300℃，300℃保持10min。

2.如权利要求1所述一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述生物样品选自脂肪含量低或适中的动物性生物样品和动物组织脏器。

3.如权利要求1所述一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述冷冻生物样品置于-20℃冰箱内保存。

4.如权利要求1所述一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述固相吸附剂采用7μm的具有团聚效应的硅藻土进行固-固吸附，包裹共沉淀。

5.如权利要求1所述一种动物性生物样品中纳米级塑料颗粒的检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述干燥是置于80℃烘箱中完全干燥；所述均质是利用铁质长柄耳勺将干燥后的样品均质，使目标待测物均匀分散在固相吸附剂上。

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