CN112210513A

CN112210513A - 产褐藻胶裂解酶菌株及其应用

Info

Publication number: CN112210513A
Application number: CN202011103273.0A
Authority: CN
Inventors: 黄惠琴; 胡永华; 谷翰杰; 莫坤联; 吴清娟
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2040-10-15
Also published as: CN112210513B; WO2022078140A1

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及Neiella属菌株、褐藻胶裂解酶及其应用。本发明提供了一种产褐藻胶裂解酶菌株HB171785，该菌株分类归属于γ变形属纲Neiella属，保藏号为GDMCC No.61001，该菌株产生的褐藻胶裂解酶具有较好的温度稳定性。本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，上述菌株HB171785和褐藻胶裂解酶在褐藻胶降解以及褐藻寡糖的制备中具有应用潜力。

Description

产褐藻胶裂解酶菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及产褐藻胶裂解酶菌株及其应用。

背景技术

褐藻胶(alginate)广泛存在于海带、马尾藻、巨藻等褐藻的细胞壁中,是由α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronate)和其C5差向异构体β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate)通过1,4糖苷键随机连接而成的线性高分子多糖聚合物。褐藻胶分子量大、组成复杂、不易降解，这给褐藻的资源化利用造成了障碍。近年来，如何高效降解褐藻制备高活性的海藻提取物、海藻生物饲料或肥料成为海藻利用研究的热点。

研究表明，通过生物降解制备的由2-20个单糖聚合而成的褐藻寡糖具有多种生理活性，如促生长、增强免疫、神经保护、抗炎、抗病毒、抗氧化活性等，在食品、药品、农业、保健品、化妆品等领域具有广泛的应用潜力。与传统的酸解法相比，酶解法以其专一性高、反应条件温和、褐藻寡糖得率高等优点，受到越来越多的关注。

褐藻胶裂解酶是目前唯一有效的褐藻胶降解酶类，能专一作用于1,4糖苷键，通过β消去反应切断褐藻胶糖链降解为在非还原端具有双键的不饱和寡糖。褐藻胶裂解酶来源广泛，主要包括海洋藻类、软体动物、棘皮动物和多种微生物，海洋细菌是褐藻胶裂解酶的重要来源，如弧菌、黄杆菌、交替单胞菌、交替假单胞菌等。但是，产酶细菌普遍存在着酶活低、降解位点单一等缺陷，限制了褐藻胶裂解酶以及酶解法制备褐藻寡糖的发展。因此，寻找高效降解褐藻胶的新菌种，是开发利用褐藻胶裂解酶的高效途径之一。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株新的海洋细菌菌株Neiella sp.HB171785，菌株保藏号为GDMCC No.61001。本发明还涉及该菌株发酵产生的褐藻胶裂解酶及其制备方法与应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.，其保藏编号为GDMCCNo.610001。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.在制备褐藻胶裂解酶中的应用。

本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.在降解褐藻中的应用。

本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.发酵制得的褐藻胶裂解酶。

本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。

此外，本发明还提供了制备褐藻胶裂解酶的方法，采用所述产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.，发酵制得褐藻胶裂解酶。

在本发明的一些具体实施方案中，包括以下步骤：

步骤1、菌株活化：将如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化的菌株；

步骤2、液体培养：将所述活化的菌株接种于液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养至对数生长期，制成种子液；

步骤3、发酵培养：将所述种子液以2～5％的接种量转接于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶的粗酶液，纯化获得褐藻胶裂解酶。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述固体培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，琼脂粉18～20g/L，pH6.5～8.0。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述液体种子培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，pH6.5～8.0；将菌体从平板上刮下一环，接种到装有30mL种子培养基的摇瓶中，28～37℃、120～200r/min振荡培养，使OD₆₀₀控制在0.8～1.2之间。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述液体发酵培养基包括海藻酸钠5～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/L，七水合硫酸镁0.1～0.4g/L，pH 6.5～8.0；所述种子液接种浓度为OD₆₀₀＝0.05。

本发明提供了一种产褐藻胶裂解酶菌株HB171785，该菌株分类归属于γ变形属纲Neiella属，保藏号为GDMCC No.61001，保藏日期为2020年4月17日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。该菌株产生的褐藻胶裂解酶具有较好的温度稳定性。本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，上述菌株HB171785和褐藻胶裂解酶在褐藻胶降解以及褐藻寡糖的制取中具有应用潜力。

生物保藏说明

生物材料Neiella sp.HB171785，分类命名：Neiella sp.于2020年4月17日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.61001。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明所述菌株HB171785的电镜照片；

图2示本发明所述菌株HB171785基于16S rDNA的系统发育树；

图3示不同温度对本发明所述菌株HB171785产生的粗酶液酶活力的影响。

具体实施方式

本发明公开了海洋细菌菌株Neiella sp.及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的在于提供一种Neiella属菌株HB171785，该菌株能够高效产生褐藻胶裂解酶，可作为一种新的褐藻胶裂解酶产生菌，也可直接用于褐藻生物降解的微生物资源。

本发明的目的还在于提供一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，该褐藻胶裂解酶能有效降解褐藻胶，且工艺成熟。

本发明的第三个目的在于提供上述Neiella属菌株HB171785及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶产生菌株HB171785，该菌株的分类为γ变形属纲Neiella属，暂命名为：Neiella sp.HB171785，保藏编号为：GDMCC No.61001，保藏日期为：2020年4月17日，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。

本发明所述的Neiella属菌株HB171785是从海南省文昌市淇水湾海域采集的沙土样品中分离筛选得到。经微生物多相分类鉴定，鉴定菌株HB171785属于细菌域、变形菌门、γ变形菌纲、交替单胞菌目、Neiella属的新种，暂命名为Neiella sp.HB171785。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶，采用上述的Neiella sp.HB171785GDMCC No.61001发酵制得。

上述的褐藻胶裂解酶的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)菌株活化：将上述的Neiella sp.HB171785接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化菌株；

(2)液体培养：从已纯化的平板上刮下一环菌体，接入30mL液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养12～15h至对数生长期，制成种子液；

(3)发酵培养：将种子液按体积百分含量为2～10％接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，8000r/min离心10min，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液。

在该褐藻胶裂解酶的制备方法中：

步骤(1)中所述的固体培养基配方为：海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，琼脂粉18～20g/L，pH 6.5～8.0，以蒸馏水配制。

步骤(2)中所述的液体种子培养基组成为：海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，pH 6.5～8.0，以蒸馏水配制。

步骤(3)中所述的液体发酵培养基组成为：海藻酸钠5～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/L，七水合硫酸镁0.1～0.4g/L，pH 6.5～8.0，以蒸馏水配制。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的Neiellasp.HB171785以及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。褐藻包括海带、马尾藻等褐藻种类。

本发明提供的海洋细菌菌株Neiella sp.及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1产酶菌株HB171785 GDMCC No.61001的分离筛选

沙土样品采集于海南省文昌市淇水湾海域。取10g样品，稀释成10^-3～10^-6的悬液，吸取系列悬液0.1mL，涂布于褐藻胶裂解酶分离培养基，置于30℃培养箱倒置培养2～5d。

待菌落长出时，根据菌落形状、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等表型特征，挑取生长好、形态不同的菌落进行划线纯化。

对分离获得的菌株进行褐藻胶裂解酶活力测定，筛选出酶活性较强的菌株HB171785。

具体过程如下：

挑取待检测菌株点接到褐藻胶裂解酶活性检测培养基上，30℃培养2～3d。待平板上长出明显的菌落后，测量菌落直径(d)。在平板中加入1mol/L的CaCl₂溶液，静置30～60min。待平板上显现出酶解圈后，测量酶解圈直径(D)，以酶解圈直径和菌落直径的比值(D/d)作为初筛指标。

其中菌株HB171785的酶解圈直径达到26mm，D/d值为10，活性明显。

所用培养基配方如下：

褐藻胶裂解酶分离培养基：海藻酸钠5g，蛋白胨5g，酵母粉1g，磷酸高铁0.01g，NaCl 20g，琼脂18g，以蒸馏水定容至1L，pH 7.6。

褐藻胶裂解酶活性检测培养基：海藻酸钠5g，(NH₄)₂SO₄ 5g，K₂HPO₄ 2g，NaCl 20g，MgSO₄·7H₂O 1g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂18g，以蒸馏水定容至1L，pH 7.6。

实施例2菌株HB171785 GDMCC No.61001的鉴定

菌株HB171785 GDMCC No.61001在2216E琼脂培养基上生长良好，培养2d后可见清晰菌落，菌落呈圆形，奶油色至灰黄色，边缘整齐，表面光滑湿润，中央微凸起，直径2～3mm。电镜下观察，细胞呈长杆状，长2.2-4.5μm，宽0.4-0.7μm，有1-2根极生或侧生鞭毛。革兰氏染色呈阴性。

通过PCR扩增、测序获得HB171785的16S rDNA序列1459bp，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。将该序列与EzBioCloud数据库中的序列进行比对，发现菌株HB171785与Neiellamarina J221^T同源性最高(98.2％)。选择同源性高的相关菌株，利用软件MEGA7.0采用Neighbor-joining法构建系统发育树(图2)，可以看出，菌株HB171785与Neiella marinaJ221^T处于同一分支上，二者亲缘关系较近。比较二者的基因组平均核苷酸相似性ANI值，仅为83.0％，小于国际细菌系统分类学委员会规定的95％的种的界限。

比较两株菌的形态学、生理生化与分子特征，鉴定本发明中的菌株HB171785(GDMCC No.61001)为Neiella属的一个新种，暂命名为Neiella sp.HB171785。

该菌株已于2020年4月17日在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为GDMCC No.61001。保存地址为广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。

实施例3褐藻胶裂解酶及其制备方法

本发明中的褐藻胶裂解酶是由实施例1中的保藏编号为GDMCC No.61001的Neiella sp.HB171785发酵制成的，具体方法包括以下步骤：

(1)菌株活化：将实施例1中的菌株HB171785接种于固体培养基，于30℃培养48h，得活化菌株；

(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于30℃、180r/min振荡培养15h，制成种子液；使OD₆₀₀控制在0.8～1.2之间；

(3)发酵培养：将种子液接种于液体发酵培养基中，于30℃、180r/min振荡培养40h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液；种子液接种浓度为OD₆₀₀＝0.05。

步骤(1)中的固体培养基组成为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，氯化钠20g/L，琼脂粉18g/L，pH 7.0，以蒸馏水配制。

步骤(2)中的液体种子培养基为：海藻酸钠3g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉1.5g/L，氯化钠20g/L，pH 7.0，以蒸馏水配制。

步骤(3)中的液体发酵培养基为：海藻酸钠7g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉1.5g/L，氯化钠20g/L，三水合磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，pH 7.0，以蒸馏水配制。

实施例4褐藻胶裂解酶酶活测定

褐藻胶裂解酶酶活测定采用紫外吸收法进行。过程如下：

收集发酵液，离心，以实施例3中的发酵上清液作为粗酶液。

取1.8mL底物(3.0g海藻酸钠溶于1L50mM pH7.0磷酸盐缓冲液)于40℃预热5min，加入0.2mL待测粗酶液，40℃温浴10min，以灭活的酶液体系为空白对照，测定反应体系在OD₂₃₅下的紫外吸收值。定义在上述酶活测定方法下OD₂₃₅紫外吸收值每分钟增加0.01的酶量为酶的一个活力单位(1U)。

不同发酵时间对菌株HB171785产酶活力的影响如表1所示，菌株HB171785发酵36h时褐藻胶裂解酶酶活力最大，为148.6U/mL。

表1不同发酵时间对菌株HB171785产酶活力的影响

实施例5褐藻胶裂解酶的最适温度及温度稳定性

实验1：将粗酶液在不同温度(4、20、30、40、50、60、70、80℃)条件下保持1h后，分别测定褐藻胶裂解酶剩余活性，确定该酶稳定性大小。定义4℃保存的粗酶液酶活力为100％。

实验2：测定粗酶液在含3g/L海藻酸钠的50mM pH7.0的磷酸缓冲液中不同温度条件下的酶活性，确定最适反应温度。定义最适反应温度下测得的相对酶活力为100％。

结果显示，粗酶液在低于40℃条件下保持1h，剩余酶活力均达到90％以上。60℃条件下保持1h，酶活仍保留52.4％，可见该酶温度稳定性较好。粗酶液在50℃时反应酶活力最高，在40～60℃区间内酶反应活性在80％以上。当低于40℃或高于60℃时酶活力急剧降低。

表2 pH值对本发明所述菌株HB171785产生的粗酶液酶活力的影响

实施例6 Neiella sp.HB171785对褐藻藻体的降解

将海带(Laminaria japonica)、马尾藻(Sargassum oligocystum)浸泡4～5h，清洗干净，剪成1cm×1cm的小块，分别加入250mL锥形瓶中，并加入适量无机盐水溶液，其成份是：(NH₄)₂SO₄ 5g，K₂HPO₄ 2g，NaCl 20g，MgSO₄·7H₂O 1g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蒸馏水1L，pH7.5。得到含有不同种类的褐藻培养液。

接入按实施例3制备的Neiella sp.HB171785种子液，接种浓度为OD₆₀₀＝0.1，180rpm，30℃培养，观察培养基的浑浊度及海藻形状的变化。

观察发现，随着培养时间的延长，8h时海藻逐渐溶解，无色培养液颜色逐渐加深变为褐色，溶液开始变浑浊，海带、马尾藻固体重量分别剩余85.6％、90.3％；20h时海藻块变小，碎屑增多，溶液浊度加深，变得不透明，海带、马尾藻固体重量分别剩余54.1％、62.7％；40h时海带、马尾藻完全被降解，溶液变为浊液，固体海藻块完全消失。菌株HB171785能在短时间内高效降解海带和马尾藻，可用于褐藻资源化利用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 产褐藻胶裂解酶菌株及其应用

<130> MP2019527

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac ggtaacggga agaagcttgc 60

ttctttgccg acgagtggcg gacgggtgag taatgcttag ggatctgccc agaggtgggg 120

gacaacagtt ggaaacgact gctaataccg catgatgcct acgggccaaa gggggcttcg 180

gctctcgcct ttggaggaac ctaagtgaga ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca 240

aggcgacgat ctctagctgg tctgagagga tgatcagcca cactggaact gagacacggt 300

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggggaaa ccctgatgca 360

gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagc agtgaggaaa 420

ggttgttagt taatacctga caactgtgac gttaactgca gaagaagcac cggctaactc 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcgagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 540

agcgcatgca ggcggttgcg taagccagat gtgaaagccc ggggcttaac ctcggaatag 600

catttggaac tgcgtaacta gagtcttgta gaggggggta gaatttcagg tgtagcggtg 660

aaatgcgtag agatctgaag gaataccagt ggcgaaggcg gccccctgga caaagactga 720

cgctcagatg cgaaagcgtg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgatgtc aactagttgc ttgtggcttt tacgctgtgg gtgacggagc taacgcatta 840

agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc 900

gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt accatccctt 960

gacatccaga gaactttcta gagatagatt ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct 1020

gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080

ccttgtcctt atttgccagc acttcgggtg ggaactttaa ggagactgcc ggtgataaac 1140

cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat catggccctt acgggatggg ctacacacgt 1200

gctacaatgg caggtacaga gtgctgcgag ctcgcgagag ttagcgaatc acttaaagct 1260

tgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc 1320

gcagatcaga atgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380

atgggagtgg gttgctccag aagtggttag tctaaccttc ggggggacga tcaccacgga 1440

gtgattcatg actggggtg 1459

Claims

1.产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.，其特征在于，其保藏编号为GDMCC No.610001。

2.如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.在制备褐藻胶裂解酶中的应用。

3.如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.在降解褐藻中的应用。

4.如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.发酵制得的褐藻胶裂解酶。

5.如权利要求4所述的褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。

6.制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Neiella sp.，发酵制得褐藻胶裂解酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1中所述固体培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，琼脂粉18～20g/L，pH 6.5～8.0。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2中所述液体种子培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，pH 6.5～8.0；将菌体从平板上刮下一环，接种到装有30mL种子培养基的摇瓶中，28～37℃、120～200r/min振荡培养，使OD₆₀₀控制在0.8～1之间。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3中所述液体发酵培养基包括海藻酸钠5～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/L，七水合硫酸镁0.1～0.4g/L，pH 6.5～8.0；所述种子液接种浓度为OD₆₀₀＝0.05。