CN112198120A - 基于核酸适配的小麦粉中交链孢酚的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种基于核酸适配的小麦中交链孢酚的快速检测方法，利用适配体探针对交链孢酚进行特异性捕获，有效地提高了检测的稳定性和准确性。交链孢酚为小分子物质，与适配体结合后与纳米金形成竞争关系，通过纳米金的团聚情况，观察溶液颜色的变化，肉眼可区别，不需要使用复杂仪器进行检测，实现现场实时检测。本发明的方法用到的适配体探针具有可人工合成、便于修饰、合成周期短、成本低、稳定性好、批间差异小、可长期保存的优点，可大批量生产后进行保存，以此可以减少检测周期。同时，我们还可以根据溶液的颜色变化程度，实现对小麦中交链孢酚的可视化快速检测及半定量检测。

Description

基于核酸适配的小麦粉中交链孢酚的快速检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为小麦粉中交链孢酚快速检测方法。
背景技术
交链孢毒素是土壤、空气、工业材料上常见的腐生菌，主要是由交链孢属产生的一系列有毒的次生代谢产物。由于交链孢菌能在低温下生长繁殖，是造成贮运过程中农产品腐败变质的重要原因。目前已知的具有明显毒性的有7 0 多种，但是鲜有被报道与证实,其中1 0 种对动物和植物具有毒性作用。交链孢酚(Alternariol ,AOH)和交链孢酚单甲醚(Alternariol monomethyl ether ,AME)属于二苯并吡喃酮类毒素，是一类具有致突变性、基因毒性和致癌性等多种毒性的小分子化合物。EFSA在2011年和2016年进行两次风险评估结果表明，随膳食摄入的AOH和AME毒素对公众健康存在潜在风险。我国已于2017年将小麦及面粉中交链孢毒素污染列入国家食品污染物及有害因素的监控计划。
交链孢酚（AOH）可能通过多种途径引起细胞的癌变。AOH是一种致DNA 损伤的诱变剂，而DNA损伤作为一种信号，将诱导细胞应激反应，激活DNA修复系统基因，以修复损伤。AOH是污染水果、蔬菜和谷物等农产品的主要交链孢毒素，由于AOH在农产品的加工过程中稳定存在，因此，很多农产品的加工制品中也存在AOH。
随着国家对农产品质量安全的日益重视，精准快速检测技术也已成为检测方法中的热点问题，目前用于交链孢毒素的免疫学检测方法只有酶联免疫吸附测定技术，其检测主要采用实验室中的气相色谱(GC)、气质联用(GC-MS)、液相色谱(LC)、液质联用(LC-MS)等传统检测方法。然而，这些传统的检测方法通常需要大型、昂贵的仪器设备以及专业的技术人员，并且检测只能在实验室中进行，检测时间长，费时费力。所以，交链孢酚（AOH）快速检测方法的建立是一项紧迫而有意义的工作，这不仅能提高检测效率，降低检测成本与时间，同时也进一步推进解决国家日益严峻的农产品质量安全方面的工作。
脱氧核酶( DNAzyme或DNA酶)是一类具有高效催化活性和特异性识别功能的DNA分子，可以通过体外筛选方式从随机脱氧核苷酸单链库中获得，它具有催化效率高、特异性高、稳定性好、合成简单且修饰方便等优点。脱氧核酶与纳米材料的结合，既保留了脱氧核酶的催化特性和识别能力，又引入了纳米材料的信号转导功能，实现了识别与信号转导功能的一体化，大大促进了生物传感器的快速发展。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是利用对交链孢酚能特异性识别的核酸适配体，结合快速样品前处理技术，实现对小麦粉中交链孢酚的快速、灵敏的检测。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案。
一种基于核酸适配的小麦中交链孢酚的快速检测方法， 利用与交链孢酚有特异性强响应信号的脱氧核酶适配体5-20 DNAzyme 1，将其通过S-Au键共价修饰于纳米金颗粒表面，得到DNAzyme 1-纳米金探针，再将适配体的互补链DNAzyme 2通过S-Au键共价修饰于纳米金颗粒表面得到得到DNAzyme 2-纳米金探针。两者同时投入待测物溶液中，通过竞争法进行交链孢酚的可视化检测。其原理为：当待测物溶液中含有交链孢酚时，交链孢酚与适配体竞争性结合，使纳米金呈游离状态，在高盐度状态下，纳米金发生聚集，颜色由红色变成蓝色；当待测物溶液中不含有交链孢酚时，适配体与互补链通过碱基互补配对结合，使DNAzyme 1-纳米金探针和DNAzyme 2-纳米金探针呈稳定网络结构，在高盐度状态下，纳米金不发生聚集，颜色仍为红色。
在实际操作中，随着交链孢酚浓度的增大，纳米金的颜色就由红色逐渐变成蓝色，我们就可以根据溶液的颜色变化程度，实现对小麦中交链孢酚的可视化快速检测及半定量检测。
具体的，所述脱氧核酶适配体 DNAzyme 1的序列为5’SH-ATACTCAGGTACGCTTGATCGATCGATCGCTAGATGCAT-3’,所述的脱氧核酶互补链 DNAzyme 2的序列为5’SH-TATGAGTCCATGCGAACTAGCTAGCTAGCGATCTACGTA-3’。
具体的，所述纳米金的制备方法的步骤如下。
（1）将1ml的1%HAuCl4溶液稀释至100ml，加热至沸腾，7-10min后，迅速加入4ml 的1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。
（2）停止加热，继续搅拌10-15min，冷却至室温，过滤，干燥，即得粒径为15nm的纳米金颗粒。
具体的DNAzyme 1-纳米金探针制备方法的步骤如下。
（1）用上步制备的纳米金颗粒溶于dd水中制成0.1-1%的纳米金溶液。
（2）将脱氧核酶适配体DNAzyme 1与DTT混合活化1h，两者的摩尔比为1:80。
（3）将活化后的DNAzyme 1加入上述纳米金溶液中，室温搅拌2h。
（4）在上述溶液中加入SDS，调整SDS的终浓度为0.01%。
（5）溶液中少量多次加入0.5mol/L的NaCl溶液，使NaCl的终浓度为20-30mM/L，室温搅拌2h。
（6）将步骤5处理后的溶液在8000rmp/min转速下离心20min，吸出上清液，加入等量PB缓冲液重悬，重复离心重悬操作两次，以除去未与纳米金结合的DNAzyme 1，即得到所述DNAzyme 1-纳米金探针。
具体的，所述PB缓冲液的配方为10mmol/L Na2PO4、2mmol/L KH2PO4，pH值为7.4。
具体的DNAzyme 2-纳米金探针制备方法的步骤如下。
（1）用上步制备的纳米金颗粒溶于dd水中制成0.1-1%的纳米金溶液。
（2）将脱氧核酶互补链DNAzyme 2与DTT混合活化1h，两者的摩尔比为1:80。
（3）将活化后的DNAzyme 2加入上述纳米金溶液中，室温搅拌2h。
（4）在上述溶液中加入SDS，调整SDS的终浓度为0.01%。
（5）溶液中少量多次加入0.5mol/L的NaCl溶液，使NaCl的终浓度为20-30mM/L，室温搅拌2h。
（6）将步骤5处理后的溶液在8000rmp/min转速下离心20min，吸出上清液，加入等量PB缓冲液重悬，重复离心重悬操作两次，以除去未与纳米金结合的DNAzyme 2，即得到所述DNAzyme 2-纳米金探针。
具体的，所述PB缓冲液的配方为10mmol/L Na2PO4、2mmol/L KH2PO4，pH值为7.4。
具体的，所述DNAzyme 1-纳米金探针、DNAzyme 2-纳米金探针、待测物溶液的体积比为1:1:1,37℃孵育1h。
具体的DNAzyme 1-纳米金探针、DNAzyme 2-纳米金探针、待测物溶液混合后加入一定量的NaCl，使NaCl为70-100mmol/L。
本发明的优点是：本发明的交链孢酚快速检测方法利用适配体探针对交链孢酚进行特异性捕获，有效地提高了检测的稳定性和准确性。交链孢酚为小分子物质，与适配体竞争性结合后，使纳米金呈游离状态，通过纳米金的团聚情况，观察溶液颜色的变化，肉眼可区别，不需要使用复杂仪器进行检测，实现现场实时检测。本发明的方法用到的适配体探针具有可人工合成、便于修饰、合成周期短、成本低、稳定性好、批间差异小、可长期保存的优点，可大批量生产后进行保存，以此可以减少检测周期，实现交链孢酚的快速、可视化的现场检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，此外，凡是在本发明的精神和原则夏金乡的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
实施例1。
1. 合成脱氧核酶DNAzyme 1及与其互补的脱氧核酶DNAzyme 2。
脱氧核酶适配体DNAzyme 1序列为5’SH-ATACTCAGGTACGCTTGATCGATCGATCGCTAGATGCAT-3’。
脱氧核酶互补链DNAzyme 2的序列为5’SH-TATGAGTCCATGCGAACTAGCTAGCTAGCGATCTACGTA-3’。
2. 制备纳米金。
（1）将1ml的1%HAuCl4溶液稀释至100ml，加热至沸腾，10min后，迅速加入4ml 的1%柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸10min出现透明的橙红色。
（2）停止加热，继续搅拌15min，冷却至室温，过滤，50℃干燥6h。
3. 制备DNAzyme 1-纳米金探针。
（1）取2ml的离心管，将上步制备的纳米金颗粒5mg溶于1ml的dd水中制成0.5%的纳米金溶液。
（2）取50μl 10μmol/L的脱氧核酶适配体DNAzyme 1置入1.5ml离心管中，加入40μl10mmol/L的DTT和50μl 10mmol/L的PB缓冲液混合活化1h。
（3）将活化后的DNAzyme 1加入上述纳米金溶液中，室温搅拌2h。
（4）在上述溶液中加入11.4μl 的1%的SDS溶液，调整SDS的终浓度为0.01%。
（5）少量多次地将68.4μl 0.5mol/L的NaCl溶液加入溶液中，使NaCl的终浓度为30mM/L，室温搅拌2h。
（6）将步骤5处理后的溶液在8000rmp/min转速下离心20min，吸出上清液，加入等量PB缓冲液（pH7.4）重悬，重复离心重悬操作两次，以除去未与纳米金结合的DNAzyme 1，即得到所述DNAzyme 1-纳米金探针。
4. 制备DNAzyme 2-纳米金探针。
（1）取2ml的离心管，将上步制备的纳米金颗粒5mg溶于1ml的dd水中制成0.5%的纳米金溶液。
（2）取50μl 10μmol/L的脱氧核酶适配体DNAzyme 2置入1.5ml离心管中，加入40μl10mmol/L的DTT和50μl 10mmol/L的PB缓冲液混合活化1h。
（3）将活化后的DNAzyme 2加入上述纳米金溶液中，室温搅拌2h。
（4）在上述溶液中加入11.4μl 的1%的SDS溶液，调整SDS的终浓度为0.01%。
（5）少量多次地将68.4μl 0.5mol/L的NaCl溶液加入溶液中，使NaCl的终浓度为30mM/L，室温搅拌2h。
（6）将步骤5处理后的DNAzyme 2-纳米金探针在8000rmp/min转速下离心20min，吸出上清液，加入等量PB缓冲液（pH7.4）重悬，重复离心重悬操作两次，以除去未与纳米金结合的DNAzyme 2，即得到所述DNAzyme 2-纳米金探针。
5. 交链孢酚的检测。
（1）取100μl DNAzyme 1-纳米金探针、100μl DNAzyme 2-纳米金探针、100μl不同浓度的交链孢酚溶液和50μlPB和缓冲液，置于1.5ml离心管中,37℃孵育1h。
（2）加入17.25μl 2mol/L的NaCl溶液，使NaCl浓度达到100mmol/L，观察溶液的颜色变化，并根据颜色的深浅验证本方法的准确性。
实施例2。
1. 适配体-纳米金探针及互补链纳米探针的制备方法同实施例1。
2. 交链孢酚的检测。
（1）取10g小麦，研磨后加入2ml dd水中，振荡均匀过滤，取滤液为待测溶液备用。
（2）取100μl DNAzyme 1-纳米金探针、100μl DNAzyme 2-纳米金探针、100μl待测溶液和50μlPB和缓冲液，置于1.5ml离心管中,37℃孵育1h。
（2）加入17.25μl 2mol/L的NaCl溶液，使NaCl浓度达到100mmol/L，观察溶液的颜色变化，并根据溶液颜色的深浅判断小麦中交链孢酚的含有情况及大致含量。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 浙江科德生物科技有限公司
<120> 基于核酸适配的小麦粉中交链孢酚的快速检测方法
<130> 2019
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atactcaggt acgcttgatc gatcgatcgc tagatgcat 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatgagtcca tgcgaactag ctagctagcg atctacgta 39

Claims (5)

1.一种基于核酸适配的小麦中交链孢酚的快速检测方法，其特征在于：利用与交链孢酚有特异性强响应信号的脱氧核酶适配体5-20 DNAzyme1及其互补链的DNAzyme2，将其修饰在纳米金表面；将两者与待测物溶液混合，待测物中的交链孢酚会与适配体竞争性结合，使纳米金变回游离状态，检测者可以通过纳米金的团聚情况，观察溶液的颜色变化程度，实现对小麦中交链孢酚的可视化快速检测及半定量检测。
2.根据权利要求1所述的脱氧核酶适配体5-20 DNAzyme1的序列为5’SH-ATACTCAGGTACGCTTGATCGATCGATCGCTAGATGCAT-3’。
3.根据权利要求1所述的脱氧核酶互补链5-20 DNAzyme2的序列为5’SH-TATGAGTCCATGCGAACTAGCTAGCTAGCGATCTACGTA-3’。
4.根据权利要求1所述DNAzyme 1-纳米金探针、DNAzyme 2-纳米金探针、待测物溶液的体积比为1:1:1。
5.根据权利要求1所述待测物溶液与探针溶液混合后加入一定量的NaCl，形成高盐度环境，其NaCl的浓度为70-100mmol/L。
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