CN112305223A

CN112305223A - 一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸

Info

Publication number: CN112305223A
Application number: CN202011268776.3A
Authority: CN
Inventors: 汪世华; 蔡培原; 王荣智; 凌素美; 贾坤志
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-11-13
Also published as: CN112305223B

Abstract

本发明属于免疫检测领域，涉及一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，所述检测细交链格孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸检测阈值（消除T线）为25 ng/mL，视觉检测限（vLOD）为0.39 ng/mL；与常规的胶体金试纸相比，检测阈值（消除T线）降低4倍，视觉检测限（vLOD）降低32倍。本发明提供一种细交链格孢菌酮酸的高灵敏快速检测方法。

Description

一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸。

背景技术

每年因真菌毒素污染所引发的人畜中毒安全事件屡见不鲜，真菌毒素污染所引起的粮食和食品的损失不胜枚举，受国际社会的普遍关注。真菌毒素是一种由真菌代谢产生次级代谢产物，目前自然界中至少存在约400种不同的真菌毒素，分子量从50 Da到大于500Da的一类杂环化合物。真菌毒素往往具有剧毒，急慢性毒性、潜在的致癌性甚至致死性。细交链格孢菌酮酸（Tenuazonic Acid，TA）是一种主要由链格孢霉属真菌产生的真菌毒素，具有强烈的毒性、潜在致癌性，能够导致组织出血、机体运动功能障碍乃致死亡。广泛污染粮食、食品、饲料乃至环境。因此，建立细交链格孢菌酮酸高灵敏的快速检测技术极具意义。

目前细交链格孢菌酮酸的普遍检测方法大致可分为，薄层色谱法、精密仪器分析法以及免疫学分析法等。其中，薄层色谱法设备简单，一般实验室都可以进行，但操作繁琐，组分干扰严重，不适于现场快速检测。精密仪器分析方法灵敏度高，可以精确的分析样品中毒素的含量，但是其设备昂贵、需要经过专业培训的人员操作，不利于现场批量检测，因此不适合推广。免疫分析法是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种分析方法，具有特异性好，灵敏度高，操作技术简单，成本低廉等优点，特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛普及应用于各种毒素的检测。

近十几年来发展起来的侧流免疫层析试纸法，作为免疫学分析方法的重要组成部分，在检测时间上有了极大地革新，能够在1小时内快速得到检测结果。同时，由于免疫层析试纸法在检测过程中不需要设备，只需通过肉眼判断即可判读检测结果。然而，胶体金免疫层析试纸也存在不足，其灵敏度除了受限于探针上的抗体的特性之外，关键受限于探针的信号，特别是竞争模式免疫层析试纸。由于细交链格孢菌酮酸是小分子，其免疫学分析方法均采用竞争模式，事实上，该模式其抗体与探针的用量越少，灵敏度越高，但容易造成信号不足而影响结果判读。本发明从探针信号角度出发，力求为竞争模式免疫层析试纸灵敏度低的问题提供一种解决方案，同时，建立一种细交链格孢菌酮酸的快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，可用于细交链格孢菌酮酸的高灵敏快速检测。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明提供的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸其原理是：基于竞争理论，当分析物中没有靶标细交链格孢菌酮酸（TA）的情况下，最大数量的免疫探针与包被在T线处的包被抗原（TA-O-BSA）结合并在T线被截留，截留探针催化沉淀型TMB（pTMB）使其聚集在探针表面，在T线处形成强烈的蓝紫色带；反之，当分析物中存在靶标TA时，免疫探针上的一部分抗原表位被游离的TA提前占据，其余的抗原表位将在TA和TA-O-BSA之间竞争性结合。在T线处截获的探针越少，催化聚集的pTMB沉淀越少，而出现越弱的色带，并在一定的孵育时间内，着色强度与TA浓度呈反比。当TA含量足够高，T线没有可见条带。过量的探针或者探针-TA复合物在C线处与二抗（GAMA）发生反应，催化pTMB聚集沉淀，C线信号的出现表明试验的有效性，否则无效。提高竞争型免疫试纸的灵敏度的一种策略是减少免疫探针的数量和抗原的匹配剂量。与常规竞争型免疫试纸相比，由于核壳型金铂合金探针具备催化性能，能够催化沉淀型TMB使其聚集在截留探针的表面，补偿因免疫试剂剂量减少而造成的信号（T线和C线）损失，形成便于视觉判断的信号增强。显然，降低免疫探针和匹配抗原的用量，导致了更激烈的竞争反应，从而提高检测的灵敏度。

本发明提供的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸由试纸卡和显色液两部分组成；其中所述试纸卡包括塑料外壳，所述的塑料外壳内含有PVC底板，PVC底板上分别依次粘贴有样品垫，免疫探针结合垫，硝酸纤维膜和吸水纸垫四种粘合物，贴合间隔2mm，干燥封装，4℃保存；所述的显色液为市售沉淀型TMB显色液，4℃保存。

所述的核壳型金铂合金纳米是以20nm胶体金为核，通过抗坏血酸还原氯铂酸法，控制金与铂摩尔比为0.4的核壳型金铂合金，记为Au@Pt_0.4 hybrid nano- particle, Au@Pt_0.4HNP。

所述的免疫探针是核壳型金铂合金Au@Pt_0.4 HNP与单克隆抗体6D5通过静电吸附产生的偶联物，位于所述的免疫探针结合垫上。

所述单克隆抗体6D5由杂交瘤细胞株6D5分泌产生。所述杂交瘤细胞株6D5为抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体杂交瘤细胞株6D5，已于2020年10月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.21001。

所述的核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP的制备方法是：取相同体积的20nm胶体金（gold nano-particle，GNP）溶液，分别加入1/10体积的30mM抗坏血酸（L-AA），混合均匀，按照体系中铂与金的摩尔比（r = n _Pt /n _Au）为0，0.04，0.08，0.12，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8和1分别加入1% H₂PtCl₆，剧烈搅拌30min，得到不同摩尔比（r）的核壳型金铂合金纳米（Au@Pt_rhybrid nano- particle, Au@Pt_r HNP）；用ddH₂O定容至相同体积，对其催化性能进行以TMB进行测试，以摩尔比（r）为横坐标，以OD450nm为纵坐标，绘制曲线，以确定催化活性（OD450nm）增加的线性部分最大值所对应的摩尔比（r’），得到摩尔比为0.4的核壳型金铂合金Au@Pt_0.4 HNP，为最大程度保留胶体金的性质同时兼备TMB催化性能。

所述免疫探针是核壳型金铂合金Au@Pt_0.4 HNP与单克隆抗体的偶联物，其制备方法为：取核壳型金铂合金Au@Pt_0.4 HNP用0.1M K₂CO₃调节pH值，用氯化钠滴定法确定最适标记pH值；用自制的或者市售的单克隆抗体经过除盐，取所述Au@Pt_0.4 HNP，按氯化钠滴定法确定该最适标记抗体量；取所述的Au@Pt_0.4 HNP用 K₂CO₃调整至最适标记pH值，持续搅拌，缓慢滴加最适标记量的抗体，持续搅拌1h，紫外可见光谱扫描分析单克隆抗体吸附情况；加入终浓度为1%的牛血清白蛋白，持续搅拌30min，加入终浓度为0.5%的PEG20000，持续搅拌30min，平衡过夜。采用分段离心分离纯化探针。用探针复溶液/稀释液重悬复溶，得到免疫探针。

所述的检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸的制备过程是：取抗细交链孢菌酮酸单克隆抗体6D5（1.56mg/mL），标记所述Au@Pt_0.4，制备得到免疫探针；样品垫采用玻纤GL-b02，免疫探针结合垫采用聚酯MA0280，封闭液配方为1% BSA + 0.5%PEG20000 + 0.5% Tween 20 in 1× PBS（pH7.4），置37 ℃孵育封闭60 min，干燥，剪成4mm × 15 mm，置4℃备用；硝酸纤维膜（Sartorius CN140，2.5 cm × 30 cm）固定到卡式底板 DB-6（6.0 cm × 30 cm），检测抗原为细交链格孢菌酮酸完全抗原TA-O-BSA（BCA法定量3.20mg/mL）以 1×PBS（pH7.4）按1/16进行稀释，羊抗小鼠IgG（GAMA，1 mg/mL）以 1× PBS（pH7.4）按1/4进行稀释，分别在硝酸纤维膜上按照1.5 μL/cm进行划线，置37 ℃恒温箱干燥24 h。将探针以稀释液（配方：0.5% BSA + 0.5% Glycine + 5% Trehalose + 0.5%Tween20 in 0.01M pH7.4 PBS）按3/10进行稀释，分别取10 μL加到免疫探针结合垫上，冷冻干燥，组装试纸。沉淀型TMB采用商用溶液置4℃保存，使用时催化时间为15-45min。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明提供的一种检测细交链格孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸检测阈值（消除T线）为25ng/mL，视觉检测限（vLOD）为0.39 ng/mL。

（2）本发明提供的一种核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸与常规的胶体金试纸相比，检测阈值（消除T线）降低4倍，视觉检测限（vLOD）降低32倍。

附图说明

图1 是本发明杂交瘤细胞株6D5染色体分析图。

图2 是本发明杂交瘤细胞株6D5分泌的单克隆抗体的亚型鉴定图。

图3 是本发明杂交瘤细胞株6D5分泌的单克隆抗体的纯化结果鉴定图。泳道M：Maker；泳道1和2：腹水总蛋白；泳道3和4：纯化后的6D5单克隆抗体。

图4 是本发明杂交瘤细胞株6D5所产生的腹水及其纯化后抗体的效价测定图。

图5 是本发明杂交瘤细胞株6D5所产生的单克隆抗体亲和力检测结果图。

图6 是本发明杂交瘤细胞株6D5所产生的单克隆抗体的特异性分析图。

图7 是本发明杂交瘤细胞株6D5所产生的单克隆抗体的交叉反应性分析图。

图8 是本发明6D5单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线图。

图9 是本发明6D5单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线直线图。

图10 是本发明核壳型金铂合金纳米Au@Pt_rHNP（胶体体系中铂比金的摩尔比r，r = n _Pt /n _Au，分别等于0，0.04，0.08，0.12，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8和1）的颜色对比图。

图11是本发明核壳型金铂合金纳米Au@Pt_rHNP（胶体体系中铂比金的摩尔比r，r = n _Pt /n _Au，分别等于0，0.04，0.08，0.12，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8和1）的TMB催化活性图。

图12 是本发明摩尔比为0.4的核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP与20nm胶体金的对照图。

图13 是本发明核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP的紫外可见光谱分析图。

图14是本发明核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP透射电镜STEM模式暗场像。

图15 是本发明核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP高清透射电镜HRTEM图。

图16 是本发明免疫探针（Au@Pt_0.4-mAb）制备过程的紫外可见光谱分析图。

图17是本发明核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4HNP的数量与TMB的信号响应关系曲线图。

图18是本发明细交链格孢菌酮酸免疫探针（Au@Pt_0.4-mAb）的数量与TMB的信号响应关系曲线图。

图19是本发明细交链格孢菌酮酸核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP免疫层析试纸显色过程的最佳工作时间范围分析图。

图20是本发明细交链格孢菌酮酸核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP免疫层析试纸的灵敏度测试图。

图21是本发明细交链格孢菌酮酸核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP免疫层析试纸的特异性测试图。

图22是本发明细交链格孢菌酮酸核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4 HNP免疫层析试纸的实际样品检测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1杂交瘤细胞株6D5的制备

1、人工完全抗原的制备

取0.5 mg TA溶解于1mL吡啶，加入1.5mg的羧甲基羟胺半盐酸盐（CMO），混合均匀后，在室温下低速搅拌24 h，氮气吹干，随后溶解于1 mL二甲基甲酰胺（DMF），依次加入0.6 mgNHS和0.75 mg DCC，迅速混合均匀后，室温避光低速搅拌反应12 h，得到半抗原活化液；将5mg 血蓝蛋白KLH溶解于8 mL的10× PBS（pH 7.4），低速搅拌下，将活化液逐滴加入，低速搅拌避光反应6 h。将反应液移至12000 r/min进行离心30 min，用1×PBS（pH 7.4）透析三天，每4h更换一次透析液，透析后PEG20000进行浓缩，得到免疫抗原TA-O-KLH。检测抗原TA-O-BSA制备过程同上。

2、动物免疫

以人工完全抗原TA-O-KLH为免疫抗原，免疫6周龄Bal b/c小鼠。取完全抗原TA-O-KLH与等体积弗氏完全佐剂混匀，用漩涡振荡器与注射器抽吸结合乳化完全后，以每只80μg/200μL的量于小鼠颈背部皮下多点注射。第一加强免疫与首次免疫间隔28天，取相同批次的完全抗原TA-O-KLH与等体积弗氏不完全佐剂混匀，按每只40μg/200μL的量皮下多点注射。其余加强免疫间隔为21天，免疫剂量与方式与第一次加强免疫相同。第四次开始每次免疫后5-7天内，尾部静脉取血，分离血清，采用间接ELISA法检测小鼠血清效价。第六次免疫开始每次免疫后5-7天，尾部静脉取血，分离血清，采用间接ELISA法检测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清IC50。选择效价及IC50均相对较好的小鼠，用2倍于前一次免疫剂量的免疫抗原TA-O-KLH以生理盐水稀释至500μL，腹腔注射，进行最后一次冲击免疫。上述间接ELISA和间接竞争均为常规的ELISA操作。

3、细胞融合

冲击免疫后4天取小鼠的脾细胞，采用50%聚乙二醇1450（PEG1450）作为融合剂，脾细胞与SP2/0按照10：1的细胞个数混合于20mL新鲜的1640不完全培养基，轻柔混合均匀后，置1100 rpm，7min，离心，弃上清，轻扣离心管使底部细胞松散，随后将离心管置37℃水浴，于1min内先慢后快地滴加1 mL 于37℃预热的50%PEG1450，边加边晃动离心管，促进细胞接触，静置0.5min，随后在第1min内缓慢加入1 mL 1640不完全培养液，在2min内先慢后快补加1640不完全培养液至40mL，终止PEG的作用；1000 rpm离心10min，弃去上清，加入5mL新鲜培养基轻柔混匀，将细胞悬液转入95mL含2%HAT的完全培养基（含20%FBS的1640培养基），混合混匀，随后铺板至预先铺好饲养层细胞的96孔板（每孔约3000个饲养层细胞含10%FBS的1640培养基，每孔100μL），每孔100μL；融合14天后更换1%HT的完全培养基。

4、细胞株的筛选及亚克隆

待细胞生长至融合后第5-7天，每孔吸取100μL上清，补加120μL含1%HAT的完全培养基（完全培养基为含20%FBS的1640培养基），于融合10-12天，采用ELISA方法分两步进行筛选，第一步采用间接ELISA法筛选出抗细交链格孢菌酮酸（TA）而不抗载体蛋白的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出来的阳性孔以TA作为竞争抗原进行间接竞争ELISA；选择吸光值和灵敏度均较高的孔（此处的吸光值，指同一个细胞孔的第一步检测结果；此处的灵敏度，指抑制率为50%时的竞争抗原浓度，即同一个细胞孔的第二步检测结果），采用有限稀释法进行亚克隆。第一次亚克隆后10-12天采用同样的两步筛选进行检测，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，其余亚克隆后10-12天改为仅用间接ELISA法进行检测，选择吸光值较高的孔，重复亚克隆2-3次后，直至阳性率为100%为止，获得杂交瘤细胞株6D5。

5、染色体分析

用0.1%秋水仙素处理对数生长期细胞6 h后重悬，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.075 mol/L KCl 5 mL重悬细胞，静置20 min；加入1 mL新鲜的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1），混匀后静置5 min，1000 r/min离心10 min，弃上清；再加入5 mL固定液，重悬，置4℃静置过夜；1000 r/min离心10 min，弃上清，加入300 μL固定液，混匀，在预冷的载玻片上滴加1-2滴细胞悬液，干燥，经过Giemsa染色，结果如图1所示，计算处于分裂中期的杂交瘤细胞的染色体数目为106±6条，杂交瘤细胞的染色体数目接近于两个亲本的染色体数目之和，证明该阳性杂交瘤细胞为骨髓瘤细胞与脾细胞融合而成。

6、抗体亚型鉴定

用市售亚型测定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株6D5分泌的抗细交链格孢菌酮酸（TA）的单克隆抗体，鉴定结果如图2所示，该抗体为IgG2b亚型抗体。

实施例2抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体的制备与性质鉴定

1、腹水的制备与纯化

1）腹水的制备：将处于对数生长期的杂交瘤细胞株6D5按1×10⁶ cell/只注射到弗氏不完全佐剂致敏过的8周龄Bal b/c雌鼠腹腔，一周后观察小鼠，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，置2500 r/min离心5 min，去除细胞等，取上清置4℃、12000 r/min离心20min，离心后分为三层（由下向上依次为聚集物，含有大量抗体的中间层，脂质层），取中间层。

2）抗体纯化：采用辛酸-硫酸铵法粗提与Protein G亲和层析法精提相结合进行纯化，以10%SDS-PAGE凝胶电泳检测验证抗体的纯度，如图3所示，纯化后的抗体在25 kDa及50kDa处均有条带，分别对应IgG抗体的轻链和重链，而且几乎没有杂带，表明纯化效果良好。用超纯水透析完全后，冷冻干燥，收集冻干粉，即得抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体6D5，将抗体置-20℃冰箱中备用。

3）效价测定：采用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测定腹水的效价及纯化后抗体的效价，结果如图4所示，腹水的效价超过2.048×10⁶，纯化后抗体效价超过1.024×10⁶，表明经过纯化后抗体依然保持较高活性。

2、单克隆抗体的特性鉴定

1）亲和力测定：根据Beatty的方法，用间接ELISA进行单克隆抗体亲和力常数Kaff的测定。用包被缓冲液将TA-O-BSA稀释成10、5、2.5 、1.25μg/mL包被酶标板，其余步骤按常规间接ELISA操作。利用Origin8.0进行分析，如图5所示，按下面公式计算抗体的亲和力常数，计算结果为1.72×10¹⁰ L/mol，为高亲和力抗体。

式中：[Ab] 表示抗原浓度为[Ag] 时，在IC50处的抗体浓度；

[Ab]t表示抗原浓度为[Ag]t时，在IC50处的抗体浓度；

n=[Ag]/[Ag]t

2）特异性分析

按终浓度5μg/mL稀释血蓝蛋白（KLH）、TA的KLH完全抗原（TA-O-KLH）、牛血清蛋白（BSA）、TA的BSA完全抗原（TA-O-BSA）、黄曲霉毒素B1的BSA完全抗原（AFB1-O-BSA）、人血清蛋白（HSA）、黄曲霉毒素B1的HSA完全抗原（AFB1-O-HSA）以及卵清蛋白（OVA）共8种不同的包被抗原包被酶标板，用常规的间接ELISA方法进行测定，实验结果如图6所示，所制抗体仅与TA的两种完全抗原TA-O-KLH和TA-O-BSA发生反应。

3）交叉反应性分析

检测抗原TA-O-BSA以1 μg/mL包被酶标板，黄曲霉毒素B1、橘青霉素、赭曲霉毒素A、青霉酸、展青霉素、细交链孢菌酮酸六种标准品分别作为竞争抗原，分别将六种标准品按1000ng/mL倍比稀释，抗体6D5按1:64k稀释，采用常规的间接竞争ELISA法进行交叉反应性的鉴定，结果如图7所示，所制抗体能够特异性识别TA，与其他几种毒素均没有交叉反应。

4）抗体灵敏度测定

用常规的间接竞争ELISA法鉴定其对细交链格孢菌酮酸（TA）的灵敏度，绘制标准竞争曲线，结果如图8所示，曲线方程为y = -0.014 + (1.0215+0.014)/[1+ (x/2.5082)^0.7978]，R²=0.99901，其中IC₅₀= 2.50 ng/mL，IC₉₀ = 0.17 ng/mL，在IC₂₀ ~ IC₈₀之间呈现良好的线性关系，线性部分直线方程为y = 0.6697-0.4188x，R²=0.9944，结果如图9所示，线性范围 0.49-13.39 ng/mL，LOD为0.17 ng/mL。

实施例3核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4的制备与表征

1、核壳型金铂合金纳米的制备与优化

以柠檬钠还原氯金酸法制备20nm胶体金（gold nano-particle，GNP），取100mL ddH₂O，加热至沸腾，加入2mL 1%柠檬酸三钠，混匀，一次性快速加入1mL 1% HAuCl₄，持续沸腾搅拌至颜色稳定，室温冷却，ddH₂O定容至100mL。制备200mL上述胶体金，分成10等份，每份20mL，各加入2.00 mL 30 mM 抗坏血酸（L-AA），混匀，25℃剧烈搅拌下，按照体系中铂比金的摩尔比（r = n _Pt /n _Au）为0，0.04，0.08，0.12，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8和1，分别加入不同体积（0、10、20、30、50、75、100、150、200、250μL）的1% H₂PtCl₆，持续搅拌30min，分别定容至24mL，记为Au@Pt_r hybrid nano-particle，Au@Pt_r HNP（r = n _Pt /n _Au，分别等于0，0.04，0.08，0.12，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8和1）。

分别各取200μL至酶标孔观察颜色变化，如图10所示，观察结果为：随着摩尔比的增加，Au@Pt_rHNP的颜色逐渐加深；分别各取5μL置酶标孔，设三个重复，用12通道移液器同时分别加入200μL TMB，避光孵育3min，随后用2M H₂SO₄终止，每孔50 μL，检测OD450nm；以摩尔比（r）为横坐标，OD450nm为纵坐标，通过ORIGIN 8.0拟合曲线确定Au@Pt_r HNP的最佳摩尔比（r’）。如图11所示，随着r的增加，粒子表面Pt逐渐增加，从摩尔比0到0.4，催化活性（OD450nm）趋于线性增加，在0.4到1逐渐趋于饱和，因此确定最佳摩尔比为0.4。

2、核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4HNP的表征

以20nm胶体金（即核）作为对照，用肉眼观察，由图12可知，Au@Pt_0.4 HNP由于表层铂的纯在，颜色更深，酒红色偏黑，紫外-可见光谱扫描，如图13所示，Au@Pt_0.4 HNP的最大吸收峰从519nm移至513nm，最大吸附峰的峰高略有降低，整体峰形变宽，在550-900 nm对应峰高增加。如图14所示，透射电镜STEM模式的暗场像可观察到，Au@Pt_0.4的表层存在小亮点为所吸附的铂微粒；如图15所示，高清透射电镜HRTEM观测结果为，在标尺100 nm可观察到：粒径均一，形貌接近球形；在标尺5nm可观察到，铂微粒的晶格约2 nm，近球形。

实施例4基于核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4的免疫探针制备

1、单克隆抗体的准备

取制备获得的抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体6D5（亲和力常数Kaff为1.72×10¹⁰ L/mol，IC50为2.50 ng/mL，由Protein G亲和层析法纯化所得，用于制备胶体金免疫层析试纸于100 ng/mL消除T线，视觉检测限（vLOD）为12.5 ng/mL），经过ddH₂O（18.25）透析除盐，浓度为1.56 mg/mL。

2、最适标记条件

1）最适标记pH值：用氯化钠滴定法确定最适标记pH值，具体操作为，分别取200μL Au@Pt_0.4，依次加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μL的0.1M K₂CO₃，平衡pH，随后分别加入6 μL抗体，混合均匀，孵育45min，随后加入10% NaCl，混合均匀，确定颜色趋于稳定的第一个孔对应的体积，为8μL K₂CO₃ / 200μL Au@Pt_0.4 HNP。

2）最适标记抗体量：以氯化钠滴定法确定最适标记抗体量，具体操作为，分别取200μL Au@Pt_0.4并用0.1M K₂CO₃调pH至最适，依次加入0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8μL抗体，其余操作与所述1）最适标记pH值的确定类似。结果为1.5μL mAb 6D5 / 200μL Au@Pt_0.4。

3、免疫探针（Au@Pt_0.4-mAb）的制备

取20mL Au@Pt_0.4调pH至最适，维持冰水浴低速搅拌，按最适标记抗体量逐滴加入mAb6D5，孵育1h，取1mL进行紫外可见光谱扫描，结果见图16，波峰从513nm移至518nm，说明抗体成功吸附。按终浓度1% BSA，孵育30min；按终浓度0.5%加入PEG20000，孵育30min，进行封闭。置4℃静置过夜。

4、免疫探针（Au@Pt_0.4-mAb）的纯化

采用分段离心纯化免疫探针，具体操作为：4℃、3000 r/min离心10 min，弃沉淀；将上清置4℃、6500 r/min离心5 min，保留沉淀；将上清置4℃下、7000 r/min离心10 min，保留沉淀；重复离心分别于8000 r/min离心15 min，9000 r/min离心20 min，10000 r/min离心30 min，保留沉淀；汇集沉淀，按2mL加入重悬液稀释重悬，置4℃备用。重悬液配方为：0.5%BSA + 0.5% Glycine + 5% Trehalose + 0.5% Tween20 in 1× PBS（pH7.4）。

5、免疫探针（Au@Pt_0.4-mAb）数量与TMB信号响应的关系

取不同数量的探针Au@Pt_0.4分别加入酶标孔，每孔设三个重复，分别加入TMB孵育3min，随后用2M H₂SO₄终止，检测OD450nm值，以探针用量为横坐标、OD450nm为纵坐标，考察探针用量与TMB信号关系，结果见图17，探针用量与TMB信号呈线性相关，方程为y=0.02755 +0.06869x，R²=0.9991。随后将免疫探针（Au@Pt_0.4-mAb）稀释10倍，取不同数量已稀释的免疫探针分别以不同的3min、9min、15min TMB孵育时间，结果见图18，在不同孵育时间下，免疫探针与TMB信号相应均为线性关系。

实施例5细交链格孢菌酮酸核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸及其测试

1、原理

基于竞争理论，当分析物中没有靶标细交链格孢菌酮酸（TA）的情况下，最大数量的免疫探针与包被在T线处的包被抗原（TA-O-BSA）结合并在T线被截留，截留探针催化沉淀型TMB（pTMB）使其聚集在探针表面，在T线处形成强烈的蓝紫色带；反之，当分析物中存在靶标TA时，免疫探针上的一部分抗原表位被游离的TA提前占据，其余的抗原表位将在TA和TA-O-BSA之间竞争性结合。在T线处截获的探针越少，催化聚集的pTMB沉淀越少，而出现越弱的色带，并在一定的孵育时间内，着色强度与TA浓度呈反比。当TA含量足够高，T线没有可见条带。过量的探针或者探针-TA复合物在C线处与二抗（GAMA）发生反应，催化pTMB聚集沉淀，C线信号的出现表明试验的有效性，否则无效。提高竞争型免疫试纸的灵敏度的一种策略是减少免疫探针的数量和抗原的匹配剂量。与常规竞争型免疫试纸相比，由于核壳型金铂合金探针具备催化性能，能够催化沉淀型TMB使其聚集在截留探针的表面，补偿因免疫试剂剂量减少而造成的信号（T线和C线）损失，形成便于视觉判断的信号增强。显然，降低免疫探针和匹配抗原的用量，导致了更激烈的竞争反应，从而提高检测的灵敏度。

2、工作方式

1）核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4免疫层析试纸的工作过程分为层析反应和显色反应两个过程。

2）层析过程为：取100 μL待测液，滴加至试纸卡的样品垫，结合垫上的免疫探针随液体流动而泳动，在侧流层析过程中免疫探针依据抗原抗体反应被截留在T线和C线处。

3）显色过程为：取出试纸，弃去样品垫、金标垫、吸水垫，保留已截留免疫探针的硝酸纤维膜及底板，插入沉淀型TMB显色液中，避光孵育15-45min。

4）结果判读：T线C线都正常显色，且颜色接近，为阴性，说明待测液中不含靶标；T线消失，C线正常显色，为阳性，说明待测液中含有靶标，且浓度高于检测阈值；T线显色明显浅于C线显色，为阳性，说明待测液含有靶标。

3、组成

核壳型金铂合金纳米Au@Pt_0.4免疫层析试纸由试纸卡和显色液两部分组成。

1）试纸卡的组装：

样品垫采用玻纤GL-b02，免疫探针结合垫采用聚酯MA0280，封闭液配方采用1% BSA +0.5% PEG20000 + 0.5% Tween 20 in 1× PBS（pH7.4），置37 ℃孵育封闭60 min，干燥，剪成4 mm × 15 mm，置4℃备用；硝酸纤维膜（Sartorius CN140，2.5 cm × 30 cm）固定到卡式底板 DB-6（6.0 cm × 30 cm），检测抗原为细交链格孢菌酮酸完全抗原TA-O-BSA（BCA法定量3.20mg/mL）以 1×PBS（pH7.4）按1/16进行稀释，羊抗小鼠IgG（GAMA，1 mg/mL）以 1×PBS（pH7.4）按1/4进行稀释，分别在硝酸纤维膜上按照1.5 μL/cm进行划线，置37 ℃恒温箱干燥24 h。将探针以稀释液（配方：0.5% BSA + 0.5% Glycine + 5% Trehalose + 0.5%Tween20 in 0.01M pH7.4 PBS）按3/10进行稀释，分别取10 μL加到免疫探针结合垫上，冷冻干燥，组装试纸卡。

2）显色液及其最佳工作时间

显色液为商用的沉淀型TMB，置4℃保存，最佳工作时间的确定为15-45min。如图19所示，层析反应15min后，取下试纸，依次间隔15min置沉淀型TMB中避光孵育，随时间延长，T线和C线颜色越来越深，在15min-45min范围内，颜色基本满足肉眼对结果的判读。

4、灵敏度测试

用含有不同浓度的细交链格孢菌酮酸标准品的PBS溶液，鉴定所述核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，结果如图20所示，该试纸在25 ng/mL消除T线，即检测阈值为25 ng/mL；在细交链格孢菌酮酸浓度为0.39 ng/mL时仍可明显地观察到T线颜色浅于C线颜色，在0.195ng/mL时T线与C线颜色相当。因此，视觉检测限（vLOD）为0.39 ng/mL。

基于单克隆抗体6D5的20nm胶体金免疫层析试纸100ng/mL消除T线，视觉检测限（vLOD）为12.5 ng/mL。因此，与常规的胶体金试纸相比，检测阈值（消除T线）降低4倍，视觉检测限（vLOD）降低32倍。

5、特异性测试

用不同毒素标准品黄曲霉毒素B1（AFB1）、橘青霉素（CTN）、赭曲霉毒素A（OTA）、赭曲霉毒素B（OTB）、青霉酸（PA）、展青霉素（PAT）、杂色曲霉素（ST）、T-2毒素、细交链格孢菌酮酸（TA）测试所述核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸的特异性，结果如图21所示，仅加入TA的试纸T线被消除，其余试纸的T线与C线均正常显色。

实施例6细交链孢菌酮酸核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸的应用

1、实际样品前处理：随机购买的市售苹果汁和番茄酱各两份作为实际样品检测材料。苹果汁样品的处理方法是：用三倍体积的乙酸乙酯分三次萃取，离心，收集有机相，冷冻干燥；番茄酱样品的处理方法是：加入等体积的ddH2O稀释番茄酱，用三倍体积的乙酸乙酯分三次萃取，离心，收集有机相，冷冻干燥。

1）核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸检测：用5%甲醇-PBS复溶经过前处理的样品，以实施例5中试纸工作过程，进行检测。结果如图22所示。

2）UPLC-MS/MS对结果的验证：为了让检测落在UPLC-MS/MS的线性范围内，用70%甲醇/ddH2O为溶剂，将经过前处理的样品浓缩10倍，进行UPLC-MS/MS检测，将检测结果还原成原体积浓度。设备为：三重四极杆液质联用仪Waters ACQUITY UPLC- XEVO TQ-S MS），色谱柱型号ACQUITY UPLC BEH C18 （2.2×100 mm，1.7 μm）；设备所在单位：福建农林大学海峡联合研究院园艺植物生物学及代谢组学研究中心。

样品1：为苹果汁，核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸检测结果为未检出，UPLC-MS/MS检测结果为0.051 ng/mL。

样品2：为苹果汁，核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸检测结果为未检出，UPLC-MS/MS检测结果为0.073 ng/mL。

样品3：为番茄酱，核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸检测结果为未检出，UPLC-MS/MS检测结果为0.037 ng/mL。

样品4：为番茄酱，核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸检测结果为阳性，UPLC-MS/MS检测结果为5.815 ng/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，其特征在于，以通过核壳型金铂合金纳米与单克隆抗体6D5的偶联物为免疫探针，截留在T线和C线的免疫探针催化沉淀型TMB聚集在探针表面提供检测信号。

2.根据权利要求1所述的一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，其特征在于，所述核壳型金铂合金纳米，以20nm胶体金为核，通过抗坏血酸还原氯铂酸法，控制体系中铂比金的摩尔比为0.4的核壳型金铂合金纳米，记为Au@Pt_0.4 HNP。

3.根据权利要求1所述一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，其特征在于：所述单克隆抗体6D5由杂交瘤细胞株6D5分泌产生。

4.根据权利要求2所述一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，其特征在于：所述杂交瘤细胞株6D5为抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体杂交瘤细胞株6D5，已于2020年10月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.21001。

5.根据权利要求1所述的一种检测细交链孢菌酮酸的核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸，其特征在于，所述免疫探针的制备方法，用单克隆抗体标记核壳型金铂合金Au@Pt_0.4HNP形成偶联物。

6.根据权利要求1所述核壳型金铂合金纳米免疫层析试纸在检测细交链格孢菌酮酸中的应用。