CN112180009B - 一种人血浆及尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人血浆及尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，属于药物分析技术领域。为解决现有氟乙酸检测方法前处理复杂、检测时间长、灵敏度低的问题，本发明提供了一种人血浆及尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，具体步骤包括确定LC‑LS/MS检测条件、配制氟乙酸及内标碘乙酸标准工作液、建立血浆及尿液中氟乙酸浓度标准曲线及回归方程、对待测血浆及尿液进行前处理，所得样本进行LC‑LS/MS检测并利用相应回归方程计算得出血浆及尿液中氟乙酸的浓度。本发明建立了简单的人血浆及尿液前处理方法，提高了氟乙酸检测灵敏度，能够在短时间内准确检测出血浆或尿液中氟乙酸的浓度，为临床有机氟中毒的快速诊断及解救提供重要参考。

Description

一种人血浆及尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及一种人血浆及尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法。
背景技术
有机氟类杀鼠剂主要成分包括氟乙酸钠和氟乙酰胺等，由于其具有剧毒，目前已被世界许多国家和地区禁止生产及使用。但近年来，由于误服或投毒导致的有机氟中毒事件仍时有发生，有机氟类杀鼠剂也是急诊科常见的易中毒物质之一。
有机氟类杀鼠剂在人体内可迅速代谢成氟乙酸，通过氟乙酸阻断机体正常的三羧酸循环，引起机体一系列毒性反应，包括神经系统损伤及心脏损伤等，严重可危及患者的生命。有机氟杀鼠剂中毒后可以引起患者恶心、呕吐、抽搐、昏迷，重度中毒可致心力衰竭。中毒患者入院后往往意识不清，医生仅根据症状难以对患者进行诊断。此外，有机氟中毒后的症状与癫痫难以区分，缺乏经验的医生可能会误诊为癫痫，延误中毒患者的抢救及治疗。
因此，快速准确地测定中毒患者血浆及尿液中氟乙酸的浓度，对于医生临床救治中毒患者具有重要的参考价值。目前，文献中报道的氟乙酸检测方法多数通过GC来进行检测，但该方法需要衍生化，前处理复杂，检测分析时间长。也有文献通过LC-MS/MS进行分析，由于氟乙酸是分子量小的极性物质，在普通C18色谱柱上不保留，需要复杂的流动相增加氟乙酸在色谱柱上的保留行为，这些缺陷限制了LC-MS/MS法检测氟乙酸的推广。
发明内容
为解决现有氟乙酸检测方法前处理复杂、检测时间长、灵敏度低的问题，本发明提供了一种人血浆及尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法。
本发明的技术方案：
一种人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，包括如下步骤：
步骤一、确定LC-LS/MS检测条件：
LC-LS/MS的色谱条件为：
色谱柱为HILIC色谱柱；流动相体积比为：乙腈:5mmol甲酸铵＝90:10；
流动相总流速0.4mL/min；进样量20μL；柱温为40℃；
LC-LS/MS的质谱条件为：
离子源采用ESI电喷雾离子源，扫描模式为负离子MRM扫描；
步骤二、配制标准工作液：
分别配制不同浓度的氟乙酸标准工作液和内标碘乙酸标准工作液；
步骤三、建立血浆中氟乙酸浓度标准曲线及回归方程：
将空白血浆分别与步骤二配制的不同浓度氟乙酸标准工作液混匀，得到不同浓度的血浆氟乙酸校准样本，按体积比分别向不同浓度血浆氟乙酸校准样本中加入内标碘乙酸标准工作液混匀，沉淀蛋白、离心、过滤后得到不同浓度的血浆氟乙酸标准样本，所得各浓度血浆氟乙酸标准样本分别按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测；
以不同浓度血浆氟乙酸峰面积与内标碘乙酸峰面积的比值为纵坐标y，以氟乙酸在血浆中的浓度为横坐标x，得到血浆中氟乙酸浓度的标准曲线，进行直线回归，得血浆中氟乙酸浓度的回归方程；
步骤四、待测血浆前处理：
按体积比向待测血浆中加入步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，混匀、沉淀蛋白、离心、过滤后得到待测血浆样本；
步骤五、待测血浆样本检测与数据处理：
将步骤四所得待测血浆样本按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用步骤三得出的回归方程计算得出血浆中氟乙酸的浓度。
进一步的，步骤一中LC-LS/MS的质谱条件还包括，氟乙酸的母离子：m/z＝77，定量子离子m/z＝57，定性子离子m/z＝32，碘乙酸母离子m/z＝184.8，子离子m/z＝126.8。
进一步的，步骤二配制的氟乙酸标准工作液的浓度依次为2.5、5、10、20、50、100、200、500和1000μg/mL；内标碘乙酸标准工作液的浓度为200μg/mL。
进一步的，步骤三所述血浆氟乙酸校准样本的浓度依次为0.25、0.5、1、2、5、10、20、50和100μg/mL，步骤三所述血浆氟乙酸校准样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为10:1；步骤三所得血浆中氟乙酸浓度的回归方程为y＝0.00943x+0.00936，r2＝0.9962。
进一步的，步骤四所述待测血浆样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为10:1。
一种人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，包括如下步骤：
步骤一、确定LC-LS/MS检测条件：
LC-LS/MS的色谱条件为：
色谱柱为HILIC色谱柱；流动相体积比为：乙腈:5mmol甲酸铵＝90:10；
流动相总流速0.4mL/min；进样量20μL；柱温为40℃；
LC-LS/MS的质谱条件为：
离子源采用ESI电喷雾离子源，扫描模式为负离子MRM扫描；
步骤二、配制标准工作液：
分别配制不同浓度的氟乙酸标准工作液和内标碘乙酸标准工作液；
步骤三、建立尿液中氟乙酸浓度标准曲线及回归方程：
将空白尿液分别与步骤二配制的不同浓度氟乙酸标准工作液混匀，得到不同浓度的尿液氟乙酸校准样本，按体积比分别向不同浓度尿液氟乙酸校准样本中加入内标碘乙酸标准工作液混匀，加入高氯酸混匀，以乙酸乙酯重复萃取两次，合并萃取液后氮气吹干，以流动相溶解后过滤，得到不同浓度的尿液氟乙酸标准样本，所得各浓度尿液氟乙酸标准样本分别按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测；
以不同浓度尿液氟乙酸峰面积与内标碘乙酸峰面积的比值为纵坐标y，以氟乙酸在尿液中的浓度为横坐标x，得到尿液中氟乙酸浓度的标准曲线，进行直线回归，得尿液中氟乙酸浓度的回归方程；
步骤四、待测尿液前处理：
按体积比向待测尿液中加入步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，混匀、加入高氯酸混匀，以乙酸乙酯重复萃取两次，合并萃取液后氮气吹干，以流动相溶解后过滤，得到待测尿液样本；
步骤五、待测尿液样本检测与数据处理：
将步骤四所得待测尿液样本按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用步骤三得出的回归方程计算得出尿液中氟乙酸的浓度。
进一步的，步骤一中LC-LS/MS的质谱条件还包括，氟乙酸的母离子：m/z＝77，定量子离子m/z＝57，定性子离子m/z＝32，碘乙酸母离子m/z＝184.8，子离子m/z＝126.8。
进一步的，步骤二配制的氟乙酸标准工作液的浓度依次为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL；内标碘乙酸标准工作液的浓度为200μg/mL。
进一步的，步骤三所述尿液氟乙酸校准样本的浓度依次为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，步骤三所述尿液氟乙酸校准样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为20:1；所述高氯酸的体积浓度为50％，所述乙酸乙酯的萃取体积为2mL，所述流动相溶解所用体积为200μL；步骤三所得尿液中氟乙酸浓度的回归方程为y＝0.00836x+0.0102，r2＝0.9983。
进一步的，步骤四所述待测尿液样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为20:1，所述高氯酸的体积浓度为50％，所述乙酸乙酯的萃取体积为2mL，所述流动相溶解所用体积为200μL。
本发明的有益效果：
本发明提供的人血浆及尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，具体为一种利用LC-LS/MS法检测人血浆及尿液中氟乙酸浓度的方法，具有灵敏度高、精确度及准确度好的优点。该方法采用HILIC色谱柱进行分离，利用高有机相的前处理与HILIC色谱柱进行结合，增加了氟乙酸在色谱柱上的保留，提高了氟乙酸检测灵敏度，解决了氟乙酸敏度低、操作复杂的检测难点。
本发明建立了简单的人血浆及尿液前处理方法，避免了衍生化等复杂的前处理过程，能够在短时间内检测出血浆或尿液中氟乙酸的浓度，能够实现临床人血浆及尿液中氟乙酸的快速准确检测，为临床有机氟中毒的快速诊断、中毒程度判断、解救及预后情况的判断提供重要参考，为中毒患者的抢救争取宝贵时间，提高中毒患者的生存几率。
附图说明
图1为实施例1所得LC-LS/MS法检测人血浆中氟乙酸浓度的标准曲线；
图2为实施例2浓度为20μg/mL的加标血浆样本进行LC-LS/MS检测所得色谱图；
图3为实施例7有机氟中毒患者血浆样本按实施例1提供的LC-LS/MS法进行检测所得色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所用水溶液均为经过0.45μm滤膜过滤后的超纯水，所用有机试剂均为色谱级。
实施例1
本实施例提供了一种人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，具体为一种利用LC-LS/MS法检测人血浆中氟乙酸浓度的方法，包括如下步骤。
步骤一、确定LC-LS/MS检测条件：
LC-LS/MS的色谱条件为：
色谱柱为HILIC色谱柱，100×2mm,3μm；
流动相由乙腈和5mmol甲酸铵组成，两者体积比为：乙腈：5mmol甲酸铵＝90：10，其中甲酸铵中含有体积浓度0.2％的甲酸；
流动相总流速0.4mL/min；进样量20μL；柱温为40℃；
LC-LS/MS的质谱条件为：离子源采用ESI电喷雾离子源，扫描模式为负离子MRM扫描，氟乙酸的母离子：m/z＝77，定量子离子m/z＝57，定性子离子m/z＝32，碘乙酸母离子m/z＝184.8，子离子m/z＝126.8，离子源如表1所示。
表1
Figure BDA0002706346390000051
步骤二、配制标准工作液：
配制氟乙酸标准工作液：
精密称取氟乙酸标准品10mg，移入10mL容量瓶中，用甲醇与水等体积混合液定容至刻度，得到1000μg/mL的氟乙酸标准储备液，以纯甲醇进行逐级稀释，得到浓度依次为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的氟乙酸标准工作液；
配制内标碘乙酸标准工作液：
精密称取内标碘乙酸标准品10mg，移入10mL容量瓶中，用甲醇与水等体积混合液定容至刻度，得到1000μg/mL的碘乙酸标准储备液，以纯甲醇进行稀释，得到浓度为200μg/mL的内标碘乙酸标准工作液；将配制好的标准工作液均置于-20℃冰箱中保存备用。
步骤三、建立血浆中氟乙酸浓度标准曲线及回归方程：
分别精密吸取空白血浆180μL置于1.5mL离心管中，向各离心管分别加入步骤二配制的各浓度氟乙酸标准工作液20μL，涡旋混匀，得到浓度依次为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的血浆氟乙酸校准样本。向所得各浓度血浆氟乙酸校准样本中分别加入20μL步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，旋涡30s，再分别加入600μL乙腈沉淀蛋白，旋涡振荡30s，将混匀后的样本放入低温离心机中4℃条件下15000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，过滤所得各浓度血浆氟乙酸标准样本按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件分别进行检测。
以不同浓度血浆氟乙酸峰面积与内标碘乙酸峰面积的比值为纵坐标y，以氟乙酸在血浆中的浓度为横坐标x，得到图1所示LC-LS/MS法检测人血浆中氟乙酸浓度的标准曲线，进行直线回归，得血浆中氟乙酸浓度的回归方程y＝0.00943x+0.00936，r2＝0.9962。
该回归方程在线性范围为0.25-100μg/mL内线性良好，最低定量下限为0.25μg/mL，最低检出限为0.1μg/mL，方法灵敏度高。
步骤四、待测血浆前处理：
精密量取待测血浆200μL置于1.5mL EP管中，加入20μL步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，旋涡混匀后加入600μL乙腈，旋涡振荡1min，4℃条件下15000r/min离心5min，取上清液过滤后用0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测血浆样本；
步骤五、待测血浆样本检测与数据处理：
将步骤四所得待测血浆样本按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用步骤三得出的回归方程计算得出血浆中氟乙酸的浓度。
实施例2
本实施例验证了实施例1提供的人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，即利用LC-LS/MS分析检测人血浆中氟乙酸浓度的方法的精密度与回收率。精密度与回收率通过测定空白人血浆中加入已知量氟乙酸标准液制备的质控标准品而得出，具体方法为：
步骤1、加标血浆样本前处理：
按实施例1步骤二提供的方法分别配制浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，分别取空白血浆180μL置于1.5mL离心管中，向各离心管分别加入20μL浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，得到浓度为5μg/mL、20μg/mL和80μg/mL的加标血浆样本，再向样本中分别加入20μL浓度为200μg/mL的内标碘乙酸标准工作液，混匀后分别加入600μL乙腈进行沉淀蛋白，涡旋混匀后4℃条件下15000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，得到三种浓度氟乙酸加标血浆样本；
步骤2、加标血浆样本的LC-LS/MS检测：
三种浓度氟乙酸加标血浆样本各5份平行，在一天内按实施例1确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，并利用实施例1步骤三得到的回归方程进行数据计算，所得的结果用于计算回收率和日内精密度；连续测定5天，所得的结果用于计算日间精密度，用相对标准偏差来表示精密度，结果见表2。
表2
Figure BDA0002706346390000071
由表2数据可知，实施例1提供的利用LC-LS/MS分析检测人血浆中氟乙酸浓度的方法具有较好的精密度和回收率，可用于精确的定量分析。
实施例3
本实施例验证了实施例1提供的人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，即利用LC-LS/MS分析检测人血浆中氟乙酸浓度的方法的稳定性。稳定性通过测定人空白血浆中加入已知量氟乙酸标准液制备的质控标准品得出，具体方法为：
步骤1、加标血浆样本前处理：
按实施例1步骤二提供的方法分别配制浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，分别取空白血浆180μL置于1.5mL离心管中，向各离心管分别加入20μL浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，得到浓度为5μg/mL、20μg/mL和80μg/mL的加标血浆样本，再向样本中分别加入20μL浓度为200μg/mL的内标碘乙酸标准工作液，混匀后分别加入600μL乙腈进行沉淀蛋白，涡旋混匀后4℃条件下15000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，得到三种浓度氟乙酸加标血浆样本；
每个浓度氟乙酸加标血浆样本分成三组，分别置于三种处置条件下：
(a)进样室中室温放置8h；
(b)反复冻融3次；
(c)-80℃保存30天。
按实施例1确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，并利用实施例1步骤三得到的回归方程进行数据计算，所得的结果用于计算血浆加标样本稳定性RSD％，结果见表3。
表3
Figure BDA0002706346390000081
本领域中，血浆加标样本的稳定性所得结果的RSD小于15％时，可认为样本稳定。由表3数据可知，实施例1提供的LC-MS/MS方法的稳定性符合标准，能够实现临床人血浆中氟乙酸的快速准确检测，为临床有机氟中毒的快速诊断及解救提供重要参考。
实施例4
本实施例提供了一种人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，具体为一种利用LC-LS/MS分析检测人尿液中氟乙酸浓度的方法，包括如下步骤。
步骤一、确定LC-LS/MS检测条件：
LC-LS/MS的色谱条件为：
色谱柱为HILIC色谱柱，100×2mm,3μm；
流动相由乙腈和5mmol甲酸铵组成，两者体积比为：乙腈：5mmol甲酸铵＝90：10，其中甲酸铵中含有体积浓度0.2％的甲酸；
流动相总流速0.4mL/min；进样量20μL；柱温为40℃；
LC-LS/MS的质谱条件为：离子源采用ESI电喷雾离子源，扫描模式为负离子MRM扫描，氟乙酸的母离子：m/z＝77，定量子离子m/z＝57，定性子离子m/z＝32，碘乙酸母离子m/z＝184.8，子离子m/z＝126.8，离子源如表4所示。
表4
Figure BDA0002706346390000082
步骤二、配制标准工作液：
配制氟乙酸标准工作液：
精密称取氟乙酸标准品10mg，移入10mL容量瓶中，用甲醇与水等体积混合液定容至刻度，得到1000μg/mL的氟乙酸标准储备液，以纯甲醇进行逐级稀释，得到浓度依次为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的氟乙酸标准工作液；
配制内标碘乙酸标准工作液：
精密称取内标碘乙酸标准品10mg，移入10mL容量瓶中，用甲醇与水等体积混合液定容至刻度，得到1000μg/mL的碘乙酸标准储备液，以纯甲醇进行稀释，得到浓度为200μg/mL的内标碘乙酸标准工作液；将配制好的标准工作液均置于-20℃冰箱中保存备用。
步骤三、建立尿液中氟乙酸标准曲线及回归方程：
分别精密吸取空白尿液900μL置于1.5mL离心管中，向各离心管分别加入步骤二配制的各浓度氟乙酸标准工作液100μL，涡旋混匀，得到浓度依次为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的尿液氟乙酸校准样本。向所得各浓度尿液氟乙酸校准样本中分别加入50μL步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，旋涡30s，再分别加入100μL体积浓度为50％的高氯酸，旋涡混匀后，加入2mL乙酸乙酯萃取，涡旋2min，离心后取上清液作为萃取液保留，下层水相再次用2mL乙酸乙酯重复萃取，离心后取上清液作为萃取液保留，合并两次所得萃取液，混匀后用氮气吹至近干，用200μL流动相溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤，过滤所得各浓度尿液氟乙酸标准样本分别按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测。
以不同浓度尿液氟乙酸峰面积与内标碘乙酸峰面积的比值为纵坐标y，以氟乙酸在尿液中的浓度为横坐标x，得到LC-LS/MS法检测人尿液中氟乙酸浓度的标准曲线，进行直线回归，得尿液中氟乙酸浓度的回归方程y＝0.00836x+0.0102，r2＝0.9983。
该回归方程在线性范围为0.25-100μg/mL内线性良好，最低定量下限为0.25μg/mL，最低检出限为0.1μg/mL，方法灵敏度高。
步骤四、待测尿液前处理：
精密量取待测尿液1mL置于1.5mL EP管中，加入50μL步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，加入100μL体积浓度为50％的高氯酸，旋涡混匀后，加入2mL乙酸乙酯萃取，涡旋2min，离心后取上清液作为萃取液保留，下层水相再次用2mL乙酸乙酯重复萃取，离心后取上清液作为萃取液保留，合并两次所得萃取液，混匀后用氮气吹至近干，用200μL流动相溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测尿液样本；
步骤五、待测尿液样本检测与数据处理：
将步骤四所得待测尿液样本按步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用步骤三得出的回归方程计算得出尿液中氟乙酸的浓度。
实施例5
本实施例验证了实施例4提供的人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，即利用LC-LS/MS分析检测人尿液中氟乙酸浓度的方法的精密度与回收率。精密度与回收率通过测定空白人尿液中加入已知量氟乙酸标准液制备的质控标准品而得出，具体方法为：
步骤1、加标尿液样本前处理：
按实施例4步骤二提供的方法分别配制浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，分别取空白尿液900μL置于1.5mL离心管中，向各离心管分别加入100μL浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，得到浓度为5、20和80μg/mL的加标尿液样本，再向样本中分别加入50μL浓度为200μg/mL的内标碘乙酸标准工作液，加入100μL 50％高氯酸，旋涡混匀后，加入2mL乙酸乙酯萃取，涡旋2min，离心后取上清液作为萃取液保留，下层水相再次用2mL乙酸乙酯重复萃取，离心后取上清液作为萃取液保留，合并两次所得萃取液，混匀后用氮气吹至近干，用200μL流动相溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤，得到三种浓度氟乙酸加标尿液样本；
步骤2、加标尿液样本的LC-LS/MS检测：
三种浓度氟乙酸加标尿液样本各5份平行，在一天内按实施例4确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，并利用实施例4步骤三得到的回归方程进行数据计算，所得的结果用于计算回收率和日内精密度；连续测定5天，所得的结果用于计算日间精密度，用相对标准偏差来表示精密度，结果见表5。
表5
Figure BDA0002706346390000101
由表5数据可知，实施例4提供的利用LC-LS/MS分析检测人尿液中氟乙酸浓度的方法具有较好的精密度和回收率，可用于精确的定量分析。
实施例6
本实施例验证了实施例4提供的人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，即利用LC-LS/MS分析检测人尿液中氟乙酸浓度的方法的稳定性。稳定性通过测定人空白尿液中加入已知量氟乙酸标准液制备的质控标准品得出，具体方法为：
步骤1、加标尿液样本前处理：
按实施例4步骤二提供的方法分别配制浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，分别取空白尿液900μL置于1.5mL离心管中，向各离心管分别加入100μL浓度为50μg/mL、200μg/mL和800μg/mL的氟乙酸标准工作液，得到浓度为5μg/mL、20μg/mL和80μg/mL的加标尿液样本，再向样本中分别加入50μL浓度为200μg/mL的内标碘乙酸标准工作液，加入100μL 50％高氯酸，旋涡混匀后，加入2mL乙酸乙酯萃取，涡旋2min，离心后取上清液作为萃取液保留，下层水相再次用2mL乙酸乙酯重复萃取，离心后取上清液作为萃取液保留，合并两次所得萃取液，混匀后用氮气吹至近干，用200μL流动相溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤，得到三种浓度氟乙酸加标尿液样本；
每个浓度氟乙酸加标尿液样本分成三组，分别置于三种处置条件下：
(a)进样室中室温放置8h；
(b)反复冻融3次；
(c)-80℃保存30天。
按实施例4确定的LC-LS/MS检测条件进行检测，并利用实施例4步骤三得到的回归方程进行数据计算，所得的结果用于计算尿液加标样本稳定性RSD％，结果见表6。
表6
Figure BDA0002706346390000111
本领域中，尿液加标样本的稳定性所得结果的RSD小于15％时，可认为样本稳定。由表6数据可知，实施例4提供的LC-MS/MS方法的稳定性符合标准，能够实现临床人尿液中氟乙酸的快速准确检测，为临床有机氟中毒的快速诊断及解救提供重要参考。
实施例7
本实施例利用实施例1提供的人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，即利用LC-LS/MS分析检测人血浆中氟乙酸浓度的方法检测有机氟中毒患者入院后的血浆中氟乙烯浓度。具体方法为：
急诊科有机氟中毒患者入院后静脉采血2mL，离心得到待测血浆，按实施例1步骤四对所得待测血浆进行前处理得到待测血浆样本，将所得待测血浆样本按实施例1步骤一确定的LC-LS/MS检测条件进行检测。
图3为本实施例有机氟中毒患者血浆样本进行LC-LS/MS检测所得色谱图，由峰面积定量，保留时间定性，利用实施例1步骤三得出的回归方程计算得出该患者血浆中氟乙酸的浓度为11.25μg/mL。

Claims (10)

1.一种人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、确定LC-MS/MS检测条件：
LC-MS/MS的色谱条件为：
色谱柱为HILIC色谱柱；流动相体积比为：乙腈:5mmol甲酸铵＝90:10，其中甲酸铵中含有体积浓度0.2％的甲酸；
流动相总流速0.4mL/min；进样量20μL；柱温为40℃；
LC-MS/MS的质谱条件为：
离子源采用ESI电喷雾离子源，扫描模式为负离子MRM扫描；
步骤二、配制标准工作液：
分别配制不同浓度的氟乙酸标准工作液和内标碘乙酸标准工作液；
步骤三、建立血浆中氟乙酸浓度标准曲线及回归方程：
将空白血浆分别与步骤二配制的不同浓度氟乙酸标准工作液混匀，得到不同浓度的血浆氟乙酸校准样本，按体积比分别向不同浓度血浆氟乙酸校准样本中加入内标碘乙酸标准工作液，旋涡30s，再分别加入600μL乙腈沉淀蛋白，旋涡振荡30s，将混匀后的样本放入低温离心机中4℃条件下15000r/min离心10min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤得到不同浓度的血浆氟乙酸标准样本，所得各浓度血浆氟乙酸标准样本分别按步骤一确定的LC-MS/MS检测条件进行检测；
以不同浓度血浆氟乙酸峰面积与内标碘乙酸峰面积的比值为纵坐标y，以氟乙酸在血浆中的浓度为横坐标x，得到血浆中氟乙酸浓度的标准曲线，进行直线回归，得血浆中氟乙酸浓度的回归方程；
步骤四、待测血浆前处理：
精密量取待测血浆200μL置于1.5mL EP管中，加入20μL步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，旋涡混匀后加入600μL乙腈，旋涡振荡1min，4℃条件下15000r/min离心5min，取上清液过滤后用0.22μm微孔滤膜过滤，得到待测血浆样本；
步骤五、待测血浆样本检测与数据处理：
将步骤四所得待测血浆样本按步骤一确定的LC-MS/MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用步骤三得出的回归方程计算得出血浆中氟乙酸的浓度。
2.根据权利要求1所述一种人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤一中LC-MS/MS的质谱条件还包括，氟乙酸的母离子：m/z＝77，定量子离子m/z＝57，定性子离子m/z＝32，碘乙酸母离子m/z＝184.8，子离子m/z＝126.8。
3.根据权利要求1或2所述一种人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤二配制的氟乙酸标准工作液的浓度依次为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL；内标碘乙酸标准工作液的浓度为200μg/mL。
4.根据权利要求3所述一种人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤三所述血浆氟乙酸校准样本的浓度依次为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，步骤三所述血浆氟乙酸校准样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为10:1；步骤三所得血浆中氟乙酸浓度的回归方程为y＝0.00943x+0.00936，r2＝0.9962。
5.根据权利要求4所述一种人血浆中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤四所述待测血浆样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为10:1。
6.一种人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、确定LC-MS/MS检测条件：
LC-MS/MS的色谱条件为：
色谱柱为HILIC色谱柱；流动相体积比为：乙腈:5mmol甲酸铵＝90:10，其中甲酸铵中含有体积浓度0.2％的甲酸；
流动相总流速0.4mL/min；进样量20μL；柱温为40℃；
LC-MS/MS的质谱条件为：
离子源采用ESI电喷雾离子源，扫描模式为负离子MRM扫描；
步骤二、配制标准工作液：
分别配制不同浓度的氟乙酸标准工作液和内标碘乙酸标准工作液；
步骤三、建立尿液中氟乙酸浓度标准曲线及回归方程：
将空白尿液分别与步骤二配制的不同浓度氟乙酸标准工作液混匀，得到不同浓度的尿液氟乙酸校准样本，按体积比分别向不同浓度尿液氟乙酸校准样本中加入内标碘乙酸标准工作液混匀，加入高氯酸混匀，以乙酸乙酯重复萃取两次，合并萃取液后氮气吹干，以流动相溶解后过滤，得到不同浓度的尿液氟乙酸标准样本，所得各浓度尿液氟乙酸标准样本分别按步骤一确定的LC-MS/MS检测条件进行检测；
以不同浓度尿液氟乙酸峰面积与内标碘乙酸峰面积的比值为纵坐标y，以氟乙酸在尿液中的浓度为横坐标x，得到尿液中氟乙酸浓度的标准曲线，进行直线回归，得尿液中氟乙酸浓度的回归方程；
步骤四、待测尿液前处理：
按体积比向待测尿液中加入步骤二配制的内标碘乙酸标准工作液，混匀、加入高氯酸混匀，以乙酸乙酯重复萃取两次，合并萃取液后氮气吹干，以流动相溶解后过滤，得到待测尿液样本；
步骤五、待测尿液样本检测与数据处理：
将步骤四所得待测尿液样本按步骤一确定的LC-MS/MS检测条件进行检测，由峰面积定量，保留时间定性，利用步骤三得出的回归方程计算得出尿液中氟乙酸的浓度。
7.根据权利要求6所述一种人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤一中LC-MS/MS的质谱条件还包括，氟乙酸的母离子：m/z＝77，定量子离子m/z＝57，定性子离子m/z＝32，碘乙酸母离子m/z＝184.8，子离子m/z＝126.8。
8.根据权利要求6或7所述一种人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤二配制的氟乙酸标准工作液的浓度依次为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL；内标碘乙酸标准工作液的浓度为200μg/mL。
9.根据权利要求8所述一种人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤三所述尿液氟乙酸校准样本的浓度依次为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，步骤三所述尿液氟乙酸校准样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为20:1；所述高氯酸的体积浓度为50％，所述乙酸乙酯的萃取体积为2mL，所述流动相溶解所用体积为200μL；步骤三所得尿液中氟乙酸浓度的回归方程为y＝0.00836x+0.0102，r2＝0.9983。
10.根据权利要求9所述一种人尿液中氟乙酸浓度的快速检测方法，其特征在于，步骤四所述待测尿液样本与内标碘乙酸标准工作液的体积比为20:1，所述高氯酸的体积浓度为50％，所述乙酸乙酯的萃取体积为2mL，所述流动相溶解所用体积为200μL。
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