CN112142754A - 异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接，由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子，进而实现对生物材料的检测。

Description

异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及化学合成领域，具体涉及一种制备异硫氰酸荧光素衍生物的的方法。
背景技术
异硫氰酸荧光素(FITC)是在荧光素的基础上通过化学反应增加异硫氰酸基团得到的。FITC中所含的硫氰酸基团可以和生物材料中氨基酸的氨基基团反应形成硫脲键，从而实现对生物材料的荧光标记。例如，FITC能和各种抗体分子中的氨基酸结合，形成FITC标记的抗体分子。在抗体与待检测生物材料中的抗原结合后，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。FITC是目前应用最广泛的荧光素，其在食品、医学、农学和畜牧等方面均有广泛的用途。
但是，FITC通常需要偶联在抗体等检测分子上才能使用，无法单独用于生物材料的检测。因此，期望能够有一种可以直接与生物材料中氨基酸连接，并能够实现荧光检测的新型标记物质。
发明内容
针对此问题，本发明提供了一种新型的异硫氰酸荧光素衍生物的制备方法。此方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸连接，由此形成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子，进而实现对生物材料的检测。
一方面，本发明提供了一种制备下式化合物8所示的异硫氰酸荧光素衍生物的方法，
Figure BDA0002107556130000011
其包括以下步骤：
(i)在-78℃下，加入化合物1和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂，1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物2；
Figure BDA0002107556130000021
(ii)将如下所示的化合物5a溶于乙酸/水溶剂，并在0℃下加入亚硝酸钠，反应15分钟后加入叠氮化钠，并继续反应2小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，并2M的盐酸和水相继洗涤粗产品，过柱分离纯化，可得到化合物5；
Figure BDA0002107556130000022
(iii)在1,5-环辛二烯氯化铱二聚体催化和氮气保护下，使化合物5与化合物2在室温反应12小时，得到如化合物8所示的异硫氰酸荧光素衍生物。
在一个实施方式中，在步骤(i)中，化合物1、正丁基锂和二甲基二硫醚的摩尔当量比为2:1:2。
在一个实施方式中，在步骤(ii)中,化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为1:1.5:2。
在一个实施方式中，在步骤(iii)中，化合物5、化合物2和1,5-环辛二烯氯化铱二聚体的摩尔当量比为2:2:1。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
在一个实施方式中，所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
另一方面，本发明提供了一种制备下式化合物2的方法，
Figure BDA0002107556130000023
其包括以下步骤：
(i)将如下所示的化合物1a、三乙基硅烷和三氟化硼乙醚络合物(BF3·OEt2)在二氯甲烷溶剂中混合并反应，得到如下所示的化合物1；
Figure BDA0002107556130000031
(ii)在-78℃下，加入化合物1和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂，1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物2
Figure BDA0002107556130000032
在一个实施方式中，在步骤(i)中，化合物1a、三乙基硅烷和三氟化硼乙醚络合物的摩尔当量比为1:2:2。
在一个实施方式中，在步骤(ii)中，化合物1、正丁基锂和二甲基二硫醚的摩尔当量比为1:2:1。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
在一个实施方式中，所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
另一方面，本发明提供了一种以下异硫氰酸荧光素衍生物，
Figure BDA0002107556130000033
另一方面，本发明提供了一种以下结构的化合物，
Figure BDA0002107556130000034
另一方面，本发明提供了一种以下异硫氰酸荧光素衍生物在制备荧光标记物中的用途：
Figure BDA0002107556130000041
在一个实施方式中，所述荧光标记物可以与氨基酸结合，优选与酪氨酸结合。
在一个实施方式中，在辣根过氧化物酶催化下，所述荧光标记物与氨基酸结合，优选与酪氨酸结合。
另一方面，本发明提供了一种荧光检测试剂盒，其包含以下的异硫氰酸荧光素衍生物：
Figure BDA0002107556130000042
在一个实施方式中，所述试剂盒进一步包括辣根过氧化物酶，以及可选地使用说明书。
现有技术中尚未报道本发明的异硫氰酸荧光素衍生物及其制备方法。本发明制备方法所制备出的异硫氰酸荧光素衍生物可以直接与生物材料中氨基酸(例如酪氨酸)反应生成异硫氰酸荧光素衍生物标记的生物分子。这极大的方便了生物材料的荧光检测。而且，本发明方法制备出的异硫氰酸荧光素衍生物结构稳定，发光效果好。此外，本发明的制备异硫氰酸荧光素衍生物的方法方便简单，特异性高，产物纯度高。
而且，化合物2是制备化合物8的一种中间体，此中间体的结构及其制备方法尚未报道。由此中间体制备的化合物8结构稳定，发光效果好。
附图说明
图1:化合物2的NMR谱
图2:化合物8的NMR谱
图3:化合物8的发光检测
实施例
在本发明中，除非特殊说明，否则反应中所用的原料和试剂均是可以商业购买获得。可商购的化学试剂可由标准商业来源获得，本发明实施例中所用试剂来源包括AldrichChemical、Chemservice Inc.、Fisher Scientific Co.、Fisons Chemicals(Leicestershire UK)、Frontier Scientific(Logan UT)、国药集团化学试剂有限公司、北京化学试剂厂等。
实施例1
化合物1的制备方法
Figure BDA0002107556130000051
在氩气氛下，在干燥的玻璃器皿中进行反应。将起始4-(丁-3-炔-1-基)苯酚的醇(669mg，2.4mmol，1.0当量)溶解在无水二氯甲烷(10mL)中并用Et3SiH(773μL，563mg，4.8mmol，2.0当量)处理。将混合物冷却至0℃，然后加入BF3·OEt2(613μL，687mg，4.8mmol，2.0当量)并将反应在0℃下搅拌1小时。当TLC显示原料完全转化时，另外4当量BF3·OEt2(1.2mL，1.37g，9.6mmol，4.0当量)，将混合物温热至室温并搅拌18小时。TLC显示中间体完全转化为最终产物，混合物用二氯甲烷(50mL)稀释并用饱和NaHCO3(30mL)水溶液洗涤。水层用二氯甲烷(2×20mL)反萃取，合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，除去溶剂后，通过快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯95/5)纯化粗产物，得到252mg(71％)无色油状产物。
实施例2
化合物2的制备方法
Figure BDA0002107556130000052
100mL圆底烧瓶置换氮气三次。-78℃下加入化合物1(5mmol)、四氢呋喃(20mL)。搅拌均匀后，相同温度下，缓慢滴加正丁基锂(2.5M，己烷，4mL)。滴加完毕后1小时，加入二甲基二硫醚(5mmol)。反应液缓慢升至室温。TLC检测反应完毕后，加水淬灭，萃取，干燥，柱层析分离得到目标产物2。
1H NMR(400MHz，CDCl3):6.97(d,J＝8.0Hz,2H),6.65(d,J＝8.0Hz,2H),2.65(t,J＝8.0Hz,2H),2.42(d,J＝8.0Hz,2H),2.22(s,3H).
MS m/z(CI)calcd.for C11H12OS(M)+192.06,found 192.04.
实施例3
化合物5的制备方法
Figure BDA0002107556130000061
将5mmol化合物5-氨基荧光素(购自Aladdin，Lot No.H1801120)溶于100mL乙酸/水(2:1)，并在0℃下加入7.5mmol亚硝酸钠。反应15分钟后加入10mmol叠氮化钠，并继续反应2小时。反应结束后，旋蒸除去溶剂，并200mL浓度为2M的盐酸和1000mL水相继洗涤粗产品。TLC检测反应。通过柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝8：1)得到产物5。
实施例4
化合物8的制备方法
Figure BDA0002107556130000062
在充满氮气的手套箱中，向装有磁子的4mL棕瓶中加入化合物5(0.2mmol，74mg，1.0当量)、化合物2(0.2mmol，38.4mg，1.0当量)，甲醇(2mL)、1,5-环辛二烯氯化铱二聚体(5mg，0.5当量)，室温下搅拌12小时。TLC检测反应。通过柱色谱纯化(二氯甲烷：甲醇＝8：1)得到产物8。
1H NMR(400MHz，MeOH-d4):8.40(s,1H),7.90(d,J＝8.0Hz,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.05(d,J＝8.0Hz,2H),6.91(s,2H),6.80(d,J＝4.0Hz,4H),6.60-6.52(m,2H),3.08(t,J＝12Hz,2H),2.98(t,J＝12Hz,2H),2.00(s,3H).
HRMS m/z(CI)calcd.for C31H24N3O6S(M+H)+566.1386,found 566.1374.
实施例5
化合物8的荧光检测
1.1.1实验试剂
1，CD4抗体(ZM0418,中衫金桥)
2，OpalTM 7-色荧光染色试剂盒(Lot Number:2306158)(Boston,MA,02118USA)，主要组成如下：
1)试剂盒组分包括：
a)抗体稀释液和封闭液
b)抗原修复液(pH9.0)
c)1×酪氨酸信号放大液
d)Ms+Rb HRP-二抗
e)DAPI染色剂
3.荧光染料
Figure BDA0002107556130000071
实验品代号ALP8-0
4.其他常用试剂
无水乙醇(生产厂家国药集团化学试剂有限公司)
二甲苯(生产厂家国药集团化学试剂有限公司)
TritonX-100(生产厂家sigma)
Tween 20(生产厂家sigma)
TBST液(生产厂家北京宝瑞杰科技有限公司)
防淬灭剂(生产厂家北京雷根生物技术有限公司，货号IH0252，Lot0525A17)
1.1.2实验仪器
1，RM2235型石蜡切片机，Leica，德国；
2，电热恒温培养箱，生产厂上海一恒科学仪器有限公司
3，微波炉，生产厂家美的
4，医用离心机，生产厂商安徽中科中佳科学仪器有限公司
5，染色摇床，生产厂商江苏天翎仪器有限公司
6，多光谱成像系统(型号：Vectra，PerkinElmer Boston,MA,02118USA)Inform2.3.0软件。
7，其他常用设备
染色缸、染色架、免疫组化用湿盒、防水笔等
1.1.3实验样本
实验样本
人扁桃体切片
1.1.4研究方法
1.1.4.1免疫荧光检测
基本原理
催化信使沉积法(CARD，catalyzed reporter deposition)是一种创新的信号放大标记技术。它通过一个分析物依赖性酶激活体系将标记物沉积在固相的分析表面上，而这些标记物可以被直接或间接检测出来。这种方法可以实现检测信号放大和提高检测限。CARD法中可用的可检测标记物有多种类型，如荧光探针，有机染料，化学发光染料等。
本实验采用免疫组织化学基本原理，利用一抗定位抗原，二抗引入辣根过氧化物酶(HRP)，再利用CARD法使得染料结合在抗原上从而实现标记和抗原检测。
实验步骤
1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟；
2.脱蜡和水化：二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95％乙醇(5min×2)→90％(5min)→85％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)；
3.蒸馏水冲洗2次5min；
4.抗原修复：用试剂盒内抗原修复液微波修复，预热5min，高火2min，中低火15min；
5.室温自然冷却；
6.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
7.封闭：用试剂盒内封闭液，室温封闭10min；
8.一抗孵育：滴加一抗CD4(一抗工作液100μl)，37℃孵育1h；
9.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
10.二抗孵育：滴加试剂盒内二抗，37℃孵育10min；
11.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
12.荧光显色：滴加稀释后的荧光染色100μl(本发明化合物“ALP8-0”)，室温10min；
13.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
14.微波处理：重复步骤4)到步骤6)；
15.DAPI染色，室温5～10min；
16.洗涤：TBST洗3次,5min/次；
17.封固：防淬灭剂封片；
18.连续光谱成像，图像分析定量和统计分析。
附表：抗体染色表
抗体测试表
抗体 CD4 DAPI
货号 ZM0418 —
一抗种属 兔
一抗 100μl —
修复条件 AR9
一抗孵育条件 37℃1hr 5min
染料 ALP8-0 DAPI
1.1.5图像及分析数据示例如下:
染色图像拍摄后，使用Nuance分析软件进行阳性信号分析
染料 *阳性信号平均强度(Scaled counts/s)
ALP8-0 0.71
*计算方法：统计阳性信号的总强度(Total counts)、阳性信号面积(pixels)和曝光时间(s)，然后再计算平均值。Scaled counts/s＝Total counts/(Pixels*s)
图3为ALP8-0染色图像。从肉眼观测的图像结果可以看出ALP8-0染料(化合物8)可以与待检测物抗原结合并进行染色。Nuance分析软件测定计算出ALP8-0染料的阳性信号平均强度为0.71。

Claims (6)

1.一种制备下式化合物8所示的异硫氰酸荧光素衍生物的方法，
Figure FDA0002107556120000011
其包括以下步骤：
(i)在-78℃下，加入化合物1和四氢呋喃溶剂，相同温度下，滴加正丁基锂，1小时后，加入二甲基二硫醚，将温度升至室温反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，过柱分离纯化，得到如下所示的化合物2；
Figure FDA0002107556120000012
(ii)将如下所示的化合物5a溶于乙酸/水溶剂，并在0℃下加入亚硝酸钠，反应15分钟后加入叠氮化钠，并继续反应2小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，并2M的盐酸和水相继洗涤粗产品，过柱分离纯化，可得到化合物5；
Figure FDA0002107556120000013
(iii)在1,5-环辛二烯氯化铱二聚体催化和氮气保护下，使化合物5与化合物2在室温反应12小时，得到如化合物8所示的异硫氰酸荧光素衍生物。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)中，化合物1、正丁基锂和二甲基二硫醚的摩尔当量比为2:1:2。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(ii)中,化合物5a、亚硝酸钠和叠氮化钠的摩尔当量比为1:1.5:2。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，化合物5、化合物2和1,5-环辛二烯氯化铱二聚体的摩尔当量比为2:2:1。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对反应后的分离纯化步骤。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述分离纯化步骤使用柱层析进行。
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