CN115572335A - 一种用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域,具体涉及一种用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
甲醛(HCHO)是活性羰基物质之一,在生理和病理过程中扮演比较重要的角色。一方面,HCHO参与氨基酸、神经递质、蛋白质等的合成,通过DNA去甲基化循环对认知能力和记忆形成具有重要意义。另外,HCHO是一种基础化工原料,应用于塑料、化妆品和木材加工等各行各业。作为一类环境污染物和致癌物,HCHO水平的异常对生物体造成很大的危害。由于HCHO在代谢酶途径中的复杂稳态,生物系统中的HCHO水平维持在200-400mM 的范围内。正常生理系统中的内源性HCHO是由脱甲基化酶和碳代谢介导的N-甲基化氨基酸残基去甲基化产生的,HCHO可以在生物体内通过多种高效代谢途径分解,对生物体无害。但是,从环境中摄入过多的HCHO会对人体造成严重损害。例如,过量的HCHO对中枢神经系统有害,有引起阿尔茨海默病等神经退行性疾病的风险,并引发慢性肝病、癌症、糖尿病等疾病。为了研究HCHO稳态的复杂性,开发可靠且有效的方法来监测HCHO水平至关重要。
目前,HCHO的监测分析方法有比色测定法、气相色谱法、高效液相色谱法和选择离子流管质谱法等。然而,这些方法受到灵敏度差、操作复杂、时空分辨率损失和生物组织的侵入破坏性等问题的限制,并不适用于活体标本的HCHO检测和成像。光学成像是一种无创性成像技术,它可以使用荧光或化学发光探针以最小的干扰对生命系统中的HCHO进行成像。此外,该方法还具有灵敏度高、选择性好、易于操作、在活细胞或复杂生物标本中具有较高的时空分辨率等优点。近年来,已见有用于检测HCHO的荧光探针报道,此类探针可应用于细胞、斑马鱼活体、水质和食物等方面的HCHO检测,对于揭示HCHO在生物系统中的作用具有重要意义。然而,已报道的荧光探针中大多数是基于疏水共轭芳香类有机小分子染料,且具有较强的细胞毒性。因此检测HCHO的过程一般在具有挥发性和有毒的有机溶剂或混合水溶液中进行,这极大地制约了其实际应用。另外面临的一个主要问题是对HCHO响应时间长,这是由于在环境条件下开发的荧光探针与低浓度HCHO之间的化学反应相对较慢所致。
聚合物荧光传感材料的设计通常是在其侧链或主链上结合许多功能性染料分子来构建。因此,聚合物荧光探针可以利用多个识别位点的协同作用更有效地结合低浓度分析物,从而实现理想的信号放大和快速的荧光响应。因此,生物质聚合物探针有可能克服这些传统小分子探针的局限性。同时,通过修饰或共聚策略将疏水荧光分子引入具有水溶性功能的生物质聚合物中是可实现的,这就可以避免在分析物检测过程中使用有毒和挥发性有机溶剂,降低了毒性。
壳聚糖(CS)是一类无毒、可生物降解和生物相容性的天然多糖。改性壳聚糖更是具备优异的生物降解、抗菌、免疫、金属结合和金属吸附能力以及伤口愈合能力等生物特性。另外,壳聚糖是药物输送、食品包装和废水处理的优良候选物,也被用作细胞培养、基因传递和组织工程的支持对象。本专利通过点击化学反应形成的三唑结构将利用光致电子转移机制设计的荧光团和修饰后的CS连接起来,制备了一种壳聚糖基荧光探针聚合物(CS-FA),利用特定的甲醛-胺缩合反应来实现对HCHO的高选择性快速检测,该探针实现了细胞和斑马鱼的荧光成像。另外,将CS-FA制备成试纸条与水凝胶荧光传感器,应用于甲醛气体与水溶液的检测。
发明内容
本发明针对现有技术中甲醛分子荧光探针检测所面临的问题和现状,本发明通过合理设计,制备出一种具备响应时间快和较高选择性的壳聚糖基检测HCHO的荧光探针聚合物材料。
本发明提出了一种具有亲水性的壳聚糖基聚合物荧光探针,即肼基-萘酰亚胺官能化壳聚糖(CS-FA)聚合物,它能够在水溶液中快速、有选择性地检测HCHO。该发明中荧光基团的设计是基于HCHO和肼基之间的特定化学反应,以触发萘酰亚胺荧光团的“开启”荧光响应。CS-FA是接枝有大密度肼-萘酰亚胺识别位点的亲水无规卷曲壳聚糖链,因此,该聚合物探针能够利用多个识别位点之间的协同作用,通过弱超分子相互作用“富集”无规卷曲壳聚糖链周围的低浓度HCHO,从而显著加速HCHO与肼基之间的化学反应,进而提高了探针的灵敏度。探针CS-FA还实现了细胞和斑马鱼活体中的外源性甲醛的荧光成像。
本发明所设计荧光探针的荧光发射机制如图9所示。
本发明采用的技术方案为:
一种用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针,探针分子的结构式为:
一种用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针的制备方法,包括以下制备步骤:
(1)化合物CS-N3的合成:称取2.5g壳聚糖和5.5g邻苯二甲酸酐,溶于盛有50mLDMF的反应瓶中,氮气条件下将体系加热至130℃持续6小时,反应结束后将反应液迅速倒入冰水,有沉淀析出,过滤后用甲醇萃取12小时,过滤并用去离子水洗涤3 次,样品经冷冻干燥后得到3g黄褐色粉末;
(2)将步骤(1)黄褐色粉末加入另一个反应瓶中,然后在氮气气氛下加入47.5mLDMF 和2.5mL水,搅拌加热至110℃保持5小时,再将反应液倒入冰水中进行沉淀,沉淀经抽滤后用甲醇提取12小时,过滤后用去离子水洗涤,样品经冷冻干燥处理后,得到浅黄褐色粉末CS-PA;
(3)将0.5g CS-PA分散于盛有25mL DMF的茄形瓶中,加入0.52g二氮杂二环和0.94g二苯基磷酰叠氮化物,在70℃和N2的条件下反应12小时,再将反应液自然冷却至室温,倒入100mL无水乙醇静置,有沉淀生成;再将该沉淀用无水乙醇和去离子水洗涤三次,再用去离子水透析2天,最终经真空冷冻干燥得到化合物黄色粉末CS-N3,产物CS-N3应储存在-20℃条件下;
(4)化合物NA的合成:将1g 4-溴-1,8-萘二甲酸酐和398mg炔丙胺加入到100mL 反应烧瓶中,量取38mL无水乙醇或乙酸乙酯加入反应瓶中,在80℃条件下加热回流,结束将反应液冷却后,将溶液倒入冰水中,沉淀物过滤,然后用去离子水和丙酮洗净,将沉淀物真空冷冻干燥得到淡黄色粉末NA;
(5)将化合物157mg NA和169mg CS-N3在氮气保护下溶20mL无水二氯甲烷中;再向该溶液中加入38mg四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐和50μL DIEA,并用锡箔纸包裹反应瓶室温反应2天;反应结束,将反应液转移到截留分子量为3500D的透析袋中,在质量浓度为50%的DMSO水溶液中透析24小时,然后转移至去离子水中透析2天,最后,将袋中的物料冷冻干燥,得到化合物CS-NA;
(6)目标探针化合物CS-FA的合成:将化合物200mg CS-NA分散于20mL无水乙醇溶液中,在氩气条件下加热至溶剂回流,加入0.1mL、质量浓度为80%的水合肼,反应12小时,反应结束待反应液冷却后过滤,滤渣用无水乙醇洗涤3次,将滤渣真空冷冻干燥得到目标探针化合物CS-FA,置于-20℃条件下保存。
本发明探针的合成路线如下:
一种用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针的应用,该荧光探针应用于水环境和离体生物细胞体系中甲醛的含量传感检测;所述的传感检测包含荧光检测,目视定性检测,细胞成像检测。
有益效果
(1)用于甲醛检测的亲水性肼基-萘酰亚胺官能化壳聚糖聚合物(CS-FA)的合成只需要四步就可以完成,操作简单且检测时减少了有机溶剂的使用;
(2)本发明实现了探针对甲醛分子的快速选择性检测,相较于小分子荧光探针具有更短的平衡响应时间;
(3)以壳聚糖为载体制备的探针(CS-FA)具备了生物相容性和可生物降解特性,减轻了对生物体的毒性作用;
(4)该探针进行检测时用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化,伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化,是一种具有生色传感功能的荧光探针。基于其特异性且显著的颜色变化,该试剂可作为显示水溶液中和细胞内甲醛分子存在的专一性指示剂,可进行实时定性及定量的目视比色法检测。因此,本发明是一种简单,快速,灵敏的甲醛分子特异性检测试剂,能够以多种形式实现对环境中甲醛的检测,在生物分子检测领域也具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是探针CS-FA的X射线光电子能谱和红外吸收光谱图,其中,(a)为CS、CS-N3、CS-NA 和CS-FA的XPS光谱,(b)为CS-N3、CS-NA和CS-FA的FTIR光谱;
图2是探针CS-FA对甲醛响应的紫外吸收光谱和荧光发射光谱图,其中,(a)为探针CS-FA 水溶液(10μg/mL)的紫外吸收光谱,插图为探针溶液变化照片;(b)为探针CS-FA水溶液在 552nm处对甲醛浓度的依赖性荧光光谱,插图为其365nm紫外光溶液荧光颜色照片;
图3是探针CS-FA对甲醛响应的时间依赖性和选择性光谱图,其中,(a)为探针CS-FA水溶液(10μg/mL)在552nm处对甲醛的时间依赖性荧光响应;(b)为探针CS-FA水溶液在干扰物质存在时对甲醛的荧光响应;
图4是不同浓度探针CS-FA和NA对于细胞毒性的测试图;
图5是探针CS-FA应用于细胞中对外源性HCHO进行荧光成像图,其中,(a1-a3)为加入 10μg/mL CS-FA孵育细胞20min后明场、绿色通道和叠加场成像图;(b1-b3)为用探针孵育后,加入200ppm HCHO孵育20min后的明场、绿色通道和叠加场成像图;比例尺:30μm;
图6是探针CS-FA应用于斑马鱼活体对外源性HCHO进行荧光成像图,其中,(a1-a3)为加入10μg/mL CS-FA孵育斑马鱼20min后明场、绿色通道和叠加场成像图;(b1-b3)为用探针孵育后,加入200ppm HCHO孵育10min后的明场、绿色通道和叠加场成像图,比例尺:500 μm;
图7是探针CS-FA琼脂凝胶应用于甲醛溶液的检测图,其中,(a-b)为探针CS-FA琼脂凝胶与不同干扰物质接触后的视觉颜色和视觉荧光颜色图,干扰物质分别为1-Cys,2-Leu,3- H2O2,4-Cu2+,5-S2-,6-S2O3 2-,7-Fe3+,8-HCHO,9-I-,10-ClO-,11-SO3 2-,12-SO4 2-,13-Zn2+, 14-NO2 -,15-PBS;(c-d)为探针CS-FA琼脂凝胶暴露于不同浓度HCHO后的视觉颜色和视觉荧光颜色图,HCHO浓度分别为:A-20%,B-10%,C-5%,D-1%;
图8是探针CS-FA测试条应用于空气甲醛的检测图,其中,(a)为CS-FA测试条在水和甲醛上方的视觉颜色图,(b)为CS-FA测试条在水和甲醛上方的觉荧光颜色图;
图9为本发明所设计荧光探针的荧光发射机制图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但不限于此。
实施例1
1)壳聚糖的改性(CS-N3的合成):
合成路线如下:
在对壳聚糖进行修饰之前对其进行了去乙酰化和降解的处理。壳聚糖的去乙酰化是指从葡糖胺中去除乙酰基,暴露出更多的氨基(-NH2)基团,脱乙酰度由大分子链上的氨基含量决定,壳聚糖的生物活性又与其葡萄糖环上的氨基有重要关系。因此,CS的脱乙酰化处理可以有效提高其生物活性。尽管壳聚糖的一些优良特性已在食品和医药中得到广泛应用,但壳聚糖在水溶液和常见有机溶剂中的溶解度仍然是限制其应用的重要因素。在碱性条件下经过降解处理后的壳聚糖分子量具有一定程度的降低,这将有助于壳聚糖溶解性的提高。
具体合成步骤为:
称取2.5g壳聚糖CS和5.5g邻苯二甲酸酐,溶于盛有50mL DMF的反应瓶中。氮气条件下将体系加热至130℃持续6小时。反应结束后将反应液迅速倒入冰水中,有沉淀析出,过滤后用甲醇萃取12小时,过滤并用去离子水洗涤3次。样品经冷冻干燥后得到3g黄褐色粉末。由于邻苯二甲酸酐也能与壳聚糖C6上的羟基发生反应,所以这部分邻苯二甲酰基应通过水解反应除去。
将上述粉末加入另一个反应瓶中,然后在氮气气氛下加入47.5mL DMF和2.5mL水。搅拌加热至110℃保持5小时。将反应液倒入冰水中进行沉淀。沉淀经抽滤后用甲醇提取12小时,过滤后用去离子水洗涤多次。样品经冷冻干燥处理后得到2.5g浅黄褐色粉末CS-PA,颜色比上一步反应产物略浅。
将化合物CS-PA(0.5g)分散于盛有25mL DMF中的茄形瓶中。加入二氮杂二环(0.52g,3.44mmol)和二苯基磷酰叠氮化物(0.94g,3.44mmol),在70℃和N2的条件下反应12 小时。将反应液自然冷却至室温,倒入100mL无水乙醇静置,有沉淀生成。将该沉淀用无水乙醇和去离子水洗涤三次,再用去离子水透析2天。最终经真空冷冻干燥得到化合物CS-N3(0.55g)为黄色粉末。产物应储存在-20℃条件下。
2)化合物NA的合成:
将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(1g,3.61mmol,1eq)和炔丙胺(398mg,7.22mmol,2eq)加入100mL反应烧瓶中。量取38mL无水乙醇或乙酸乙酯加入反应瓶,在80℃条件下加热回流,结束后将反应液冷却后将溶液倒入冰水中,沉淀物过滤,然后用去离子水和丙酮洗净。将沉淀物真空冷冻干燥得到化合物NA,为淡黄色粉末(961mg,3.10mmol)。产率为85.9%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67–8.50(m,2H),8.36(d,J=7.8Hz,1H),8.23(d,J= 7.8Hz,1H),8.01(dd,J=8.5,7.3Hz,1H),4.78(d,J=2.5Hz,2H),3.20(t,J=2.5Hz,1H); HRMS(ESI)m/zcalcd for C15H8BrNO2[M]:313.9738;Found 313.9806.
3)化合物CS-NA的合成:
将化合物NA(157mg,0.5mmol,1.0eq)和CS-N3(169mg,0.5mmol,1.0eq)在氮气保护下溶于无水二氯甲烷(20mL)中。向该溶液中加入四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐(38mg,0.1mmol,20mol%)和DIEA(50μL,0.28mmol,0.57eq.)并用锡箔纸包裹反应瓶室温反应2天。将反应液转移到截留分子量为3500D的透析袋中,在50%的DMSO水溶液中透析24小时,然后转移至去离子水中透析2天。最后,将袋中的物料冷冻干燥,得到化合物CS-NA,为黄褐色粉末(274mg,产率:84%)。
4)化合物CS-FA的合成:
首先将化合物CS-NA(200mg,0.31mmol,1.0eq)分散于20mL无水乙醇溶液,在氩气条件下加热至溶剂回流,加入质量浓度为80%的水合肼(0.1mL,1.6mmol,5.0eq),反应12小时。反应结束待反应液冷却后过滤,滤渣用无水乙醇洗涤3次,将滤渣真空冷冻干燥得到化合物CS-FA,黄色粉末(146mg,产率:73%)。置于-20℃条件下保存。
实施例2
化合物CS-FA的甲醛浓度依赖性光谱变化和可视化检测
取实施例1制备的CS-FA甲醛荧光探针溶于PBS缓冲溶液(pH=7.4)中,制成1mg/mL储备液。从储备液中取出20μL加入到2mL PBS溶液中,加入不同体积的HCHO水溶液,制备成不同浓度梯度(50-1000ppm)的HCHO水溶液,测试探针的紫外吸收和荧光发射性质。结果如图2a所示,加入HCHO之后,探针的紫外吸收波段出现明显的红移。图2b显示了随着HCHO浓度的增加,测试体系的荧光发射强度不断增强且具有良好的线性关系。紫外灯的照射后,发生了明显的荧光颜色变化。
实施例3
化合物CS-FA甲醛荧光探针的时间依赖性和和选择性荧光光谱
从实施例2中荧光探针储备液中取出20μL加入到2mL PBS溶液中,然后加入200ppmHCHO,混匀后进行荧光光谱测试。图3a显示该探针在2分钟左右就可以实现对甲醛的快速荧光响应并具备良好的稳定性。从实施例2中荧光探针储备液中取出20μL加入到2mL PBS 溶液中,分别加入等体积10mM的竞争性物质,其中一个加入300ppm HCHO水溶液后检测溶液的荧光发射光谱变化。如图3b所示,其他金属离子、氨基酸和氧化还原性物质对化合物 CS-FA的荧光发射几乎没有影响,而HCHO溶液的加入使化合物CS-FA的荧光发射显著增强。
实施例4
化合物CS-FA荧光探针细胞毒性实验
探究CS-FA是否满足生物成像的基本条件,即对生物体没有明显的毒副作用。通过细胞毒性实验验证了接枝壳聚糖后探针的生物相容性得到明显提高。在本实施例中,使用了MTT 法对探针CS-FA与NA进行了细胞毒性实验。取7组不同浓度探针作为实验组,设置只加培养基的孔作为空白对照组,浓度梯度分别为0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。取灭菌过的96孔板,并在每个孔中加入100μL含有相同数量HePG2 细胞的细胞培养液,在恒温培养箱中经过12小时的贴壁培养。提前配好含有探针溶液的上述计划浓度的细胞培养液,移走先前的细胞培养液,在孔中分别加入上述配好的系列浓度细胞培养基,继续在恒温细胞培养箱中培养20小时。培养完后每孔加入10μL MTT(5mg/mL)继续培养4小时。吸走培养基后,每孔加入100μL的DMSO用来溶剂紫色沉淀(甲瓒),充分溶解后,用酶标仪读取数据,并计算细胞存活率。如图4所示,壳聚糖基探针CS-FA的细胞毒性比NA要低。HePG2细胞在低浓度的CS-FA的长时间培养下依然保持活力状态,在含有 10μg/mL CS-FA的培养基中培养24小时后,仍可保留近80%的细胞。本实验说明了低剂量的CS-FA对细胞的毒副作用较小。
实施例5
化合物CS-FA荧光探针对细胞外源性甲醛荧光成像
将本发明探针应用于HepG2细胞中对外源性的甲醛的荧光成像,具体操作步骤如下:将 10μg/mL探针PBS溶液加入到育有HepG2细胞的培养液中在细胞培养箱中培养20min后用共聚焦显微镜进行荧光成像,此时细胞显示无光或比较微弱的荧光。然而,用探针溶液孵育过后再用200ppm HCHO孵育20min后进行荧光成像,结果显示细胞内出现明显的绿色荧光增强(图5)。
实施例6
化合物CS-FA荧光探针对斑马鱼活体荧光成像
斑马鱼作为模式动物与人类基因组的相似度高达87%。另外,斑马鱼的早期胚胎透明可观察,便于探针的荧光成像研究。本发明探针应用与斑马鱼活体中对外源性的甲醛进行荧光成像应用(图6)。具体操作步骤如下:将10μg/mL探针PBS溶液加入到育有斑马鱼的培养液中在30℃培养环境中培养20min后用共聚焦显微镜进行荧光成像,此时斑马鱼躯体显示无光或比较微弱的荧光。向体系中加入200ppm HCHO的水溶液,孵育10min后用450nm波长光进行激发,可以观察到明显的绿色荧光出现。此结果说明了探针CS-FA适用于斑马鱼活体的荧光成像,由此获取中间信息。
实施例7
化合物CS-FA荧光探针琼脂凝胶对于甲醛溶液的检测
为了进一步扩大探针在甲醛检测中的应用,本实施例中制备了探针CS-FA复合琼脂水凝胶。通过混合2%琼脂溶液和CS-FA的PBS溶液制备探针的复合琼脂凝胶,然后转移到培养皿中,冷却至室温后,得到琼脂凝胶。如图7所示,仅载有探针的琼脂凝胶在紫外光下不会发出荧光。然而,随着浸泡甲醛浓度的增加,负载CS-FA的琼脂凝胶的荧光强度也增加。另外,该复合水凝胶探针在不同竞争性分子存在的条件下,依然对甲醛较强的选择性荧光响应。这为荧光探针在凝胶材料上的应用提供了参考。
实施例8
化合物CS-FA荧光探针测试条对于空气甲醛的检测
除了检测水溶液中的HCOH外,本发明还尝试追踪被认为是室内首要污染物的甲醛气体。在这里,选择水溶液代替有机溶剂制备探针溶液可以减少有机溶剂带来的污染及其挥发所产生的有害气体。本实施例中首先将滤纸条浸入0.1mg/mL CS-FA水溶液中,浸泡两分钟后放置室温条件下自然晾干,然后将CS-FA测试条分别放在装有20%的甲醛溶液和去离子水的称量瓶的上方空气中,两分钟后取下放在365nm波长的灯下观察。如图8所示,甲醛溶液上方试纸的颜色在大约1min内迅速变成黄色,并且荧光发射强度也相较于在水上方的测试条有了明显的增强。因此,我们预测探针CS-FA可用作颜色或荧光指示剂,用于跟踪一定浓度范围的甲醛气体。
需要说明的是,上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例,而非全部实施例。显然,基于本发明的上述实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例,都应当属于本发明保护的范围。
Claims (3)
2.一种权利要求1所述用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下制备步骤:
(1)化合物CS-N3的合成:称取2.5g壳聚糖和5.5g邻苯二甲酸酐,溶于盛有50mL DMF的反应瓶中,氮气条件下将体系加热至130℃持续6小时,反应结束后将反应液迅速倒入冰水,有沉淀析出,过滤后用甲醇萃取12小时,过滤并用去离子水洗涤3次,样品经冷冻干燥后得到3g黄褐色粉末;
(2)将步骤(1)黄褐色粉末加入另一个反应瓶中,然后在氮气气氛下加入47.5mL DMF和2.5mL水,搅拌加热至110℃保持5小时,再将反应液倒入冰水中进行沉淀,沉淀经抽滤后用甲醇提取12小时,过滤后用去离子水洗涤,样品经冷冻干燥处理后,得到浅黄褐色粉末CS-PA;
(3)将0.5g CS-PA分散于盛有25mL DMF的茄形瓶中,加入0.52g二氮杂二环和0.94g二苯基磷酰叠氮化物,在70℃和N2的条件下反应12小时,再将反应液自然冷却至室温,倒入100mL无水乙醇静置,有沉淀生成;再将该沉淀用无水乙醇和去离子水洗涤三次,再用去离子水透析2天,最终经真空冷冻干燥得到化合物黄色粉末CS-N3,产物CS-N3应储存在-20℃条件下;
(4)化合物NA的合成:将1g 4-溴-1,8-萘二甲酸酐和398mg炔丙胺加入到100mL反应烧瓶中,量取38mL无水乙醇或乙酸乙酯加入反应瓶中,在80℃条件下加热回流,结束将反应液冷却后,将溶液倒入冰水中,沉淀物过滤,然后用去离子水和丙酮洗净,将沉淀物真空冷冻干燥得到淡黄色粉末NA;
(5)将化合物157mg NA和169mg CS-N3在氮气保护下溶于20mL无水二氯甲烷中;再向该溶液中加入38mg四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐和50μL DIEA,并用锡箔纸包裹反应瓶室温反应2天;反应结束,将反应液转移到截留分子量为3500D的透析袋中,在质量浓度为50%的DMSO水溶液中透析24小时,然后转移至去离子水中透析2天,最后,将袋中的物料冷冻干燥,得到化合物CS-NA;
(6)目标探针化合物CS-FA的合成:将化合物200mg CS-NA分散于20mL无水乙醇溶液中,在氩气条件下加热至溶剂回流,加入0.1mL、质量浓度为80%的水合肼,反应12小时,反应结束待反应液冷却后过滤,滤渣用无水乙醇洗涤3次,将滤渣真空冷冻干燥得到目标探针化合物CS-FA,置于-20℃条件下保存。
3.一种权利要求1所述用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针的应用,其特征在于,该荧光探针应用于水环境和离体生物细胞体系中甲醛的含量传感检测;所述的传感检测包含荧光检测,目视定性检测,细胞成像检测。
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