CN103102491A - 壳聚糖6-oh固载环糊精衍生物的制备方法及其在h2o2检测电化学传感器膜材料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法及其在H2O2检测电化学传感器膜材料中的应用，属于高分子材料的制备与改性领域。本发明以邻苯二甲酸酐保护壳聚糖2-NH2，通过点击化学反应在其6-OH位置固载环糊精后，再以水合肼脱除壳聚糖2-NH2的保护，制得在水和部分有机溶剂中具有良好溶解性的，具有高固载率的壳聚糖6-OH定位固载环糊精衍生物。将本发明制得的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的环糊精疏水性空腔中固载电子媒介体，壳聚糖吡喃环的2-NH2固载过氧化氢酶后，修饰在玻碳电极的表面，形成用于对H2O2含量检测用的电化学生物传感器膜材料。本发明使壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物在以酶催化作用配合电化学检测的酶基生物传感器中的应用成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法及其在H2O2检测电化学传感器膜材料中的应用，属于高分子材料的制备与改性领域。
背景技术
壳聚糖由于其来源丰富，价格低廉，易于化学修饰，可与酶结合，具有良好的成膜性、生物相容性、生物可降解性、渗透性、亲水性、机械强度等优异性能，在生物传感器用功能膜材料中具有重要的应用价值。
目前文献报道的通过壳聚糖构筑传感器膜的文献报道中，主要是通过壳聚糖的2-NH2实现对酶的固定作用，通过电活性物质（电子媒介体）与膜的掺杂促进电极与酶之间电子的传递。但掺杂一方面影响膜结构均匀性及催化反应的稳定性，同时电子媒介体在膜中的稳定性也不好，膜的使用寿命受到显著影响。
与壳聚糖相比，以环糊精的疏水性空腔包络有机电子媒介体，促进酶反应中心的电子转移到电极表面，既避免了电子媒介体的流失又保证了电子媒介体有充分的流动性，使传感器具有较高的灵敏度和较好的稳定性。但环糊精本身无法成膜，为使环糊精在传感器电极表面均匀分散，主要是通过其与PVC、PVA、PDMS、PU等通过共混的方式成膜。由于环糊精结构相对较稳定，较难引入膜内，或者在膜内难以控制其位置，使得制得的膜的均匀性和稳定性较差。
将环糊精在壳聚糖的分子链上通过化学方法进行固载，可将壳聚糖的易成膜，易在电极表面固定，可固载酶，易修饰等性能与环糊精空腔良好的包合作用相结合，发挥各自优势，制备出性能优异的传感器用功能膜材料。
但目前制备的壳聚糖固载环糊精衍生物中，环糊精主要固载在壳聚糖较易于改性的2-NH2上。对于传感器用功能膜材料而言，若在壳聚糖2-NH2上固载体积较大的环糊精大环化合物，将产生较大的位阻，影响在壳聚糖2-NH2上酶的固定，并使2-NH2通过交联作用与电极表面结合的位点减少，破坏壳聚糖衍生电极膜材料的固载稳定性和均匀性。
在壳聚糖的6-OH定位取代环糊精，同时保留其2-NH2，可制得性能优异的壳聚糖固载环糊精衍生物，但目前文献所报道的固载方法均存在一定的缺陷，环糊精的固载效率不高，均小于50μmol·g-1。环糊精固载率较低时，固载的疏水性空腔难以包埋足够的电子媒介体，导致电子媒介体的传递效果变差。
专利CN201110441171.4提出了一种通过点击化学反应制备具有高固载率的壳聚糖6-OH定位固载环糊精衍生物的制备方法。该方法的反应方程式为：
采用该方法制备的产物的环糊精固载率可达到210μmol·g-1以上，壳聚糖2-NH2具有较好的保留，保留程度可达到95%，上述性能使该产品在以酶催化作用配合电化学检测的酶基生物传感器中具有良好的应用前景；然而采用该方法制备的衍生物在水中的溶解性能有限，在有机溶剂中很难溶解，限制了其在该领域的应用。
发明内容
本发明的目的是通过对具有高固载率的壳聚糖6-OH定位固载环糊精衍生物的制备方法进行改进，提高该衍生物在水和部分有机溶剂中的溶解性能，进一步地，利用固载的环糊精疏水性空腔对电子媒介体的包结作用，结合壳聚糖2-NH2固定过氧化氢酶的优异性能，将壳聚糖6-OH定位固载环糊精衍生物应用于H2O2检测的电化学传感器膜材料中，实现对H2O2的稳定、快速、高效检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明以邻苯二甲酸酐保护壳聚糖2-NH2，通过点击化学反应在其6-OH位置固载环糊精后，再以水合肼脱除壳聚糖2-NH2的保护，制得在水和部分有机溶剂中具有良好溶解性的，具有高固载率的壳聚糖6-OH定位固载环糊精衍生物。
将本发明制得的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的环糊精疏水性空腔中固载电子媒介体，壳聚糖吡喃环的2-NH2固载过氧化氢酶后，修饰在玻碳电极的表面，形成可适合于对H2O2含量检测用的电化学生物传感器膜材料。
一、本发明的一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其具体制备步骤为：
第一步：壳聚糖2-NH2保护衍生物的制备
1）称取1份壳聚糖溶于30～400份的质量浓度为0.1%～10%的醋酸的水溶液中；
2）将1～10份邻苯二甲酸酐溶于30～400份有机化合物A中后滴加到1）得到的反应体系中，在0～80℃下搅拌反应0.5～8小时。然后加入溶剂B使产生的壳聚糖衍生物沉淀析出，用有机溶剂C洗涤2次以上以除去多余邻苯二甲酸酐化合物，然后50～80℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐保护的壳聚糖衍生物a。
有机化合物A为乙醇、乙醚、苯或DMF。
有机溶剂B为甲醇、丙酮或乙腈。
有机溶剂C为乙醇、乙醚或苯。
第二步：壳聚糖2-NH2保护，6-OH对甲苯磺酰酯化衍生物的制备
将1份第一步得到的邻苯二甲酸酐化壳聚糖衍生物a溶解在20-400份的有机溶剂D中，向其中加入10～100份的对甲苯磺酰氯的有机溶液E，1～60分钟滴完，然后在-10～80℃下反应0.5～8小时，抽滤，得浅黄色固体，用有机溶剂F洗去未反应的对甲苯磺酰氯，在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖衍生物b。
有机溶剂D为DMF，DMSO或DMAc。
有机溶液E中的溶剂为三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO，优选为三氯甲烷或DMSO。有机溶液E中对甲苯磺酰氯的质量浓度为2%～40%。
有机溶剂F为三氯甲烷、丙酮或N-甲基吡咯烷酮。
优选的反应条件为：将1份第一步得到的邻苯二甲酸酐化壳聚糖衍生物a溶解在20-100份的有机溶剂D中，向其中加入20～60份的对甲苯磺酰氯的有机溶液E，10～40分钟滴完，然后在-10～80℃下反应3～6小时，抽滤，得浅黄色固体，用有机溶剂F洗去未反应的对甲苯磺酰氯，在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖衍生物b。
第三步：壳聚糖2-NH2保护，6-OH叠氮化衍生物的制备
称取1份第二步得到的壳聚糖衍生物b溶于10～60份的有机溶剂G中，0～80℃下搅拌使之溶解，加入1～10份的叠氮化钠，在20～100℃条件下搅拌反应1～8小时，反应结束后，使用50～300份水沉淀，用水洗涤析出物，最后依次用有机溶剂H和水洗涤2次以上，抽滤后50～100℃真空干燥得到壳聚糖的叠氮化衍生物c。
有机溶剂G为DMF、DMSO或DMAc。
有机溶剂H为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈或四氢呋喃，优选为乙醇、丙酮或四氢呋喃。
优选的反应条件为：称取1份壳聚糖衍生物b溶于20～40份的有机溶剂G中，0～80℃下搅拌使之溶解，加入1～4份的叠氮化钠，在50～90℃条件下搅拌反应3～6小时，反应结束后，使用50～300份水沉淀，用水洗涤析出物，最后依次用有机溶剂H和水洗涤2次以上，抽滤后50～80℃真空干燥得到壳聚糖的叠氮化衍生物c。
第四步：环糊精单对甲苯磺酰化衍生物的制备
1）称取1份β-环糊精，加入3～20份质量浓度为0.2%～5%的碱I的水溶液中，在-10～50℃下搅拌使β-环糊精完全溶解；
2）将0.5～5份对甲苯磺酰氯溶解于1～10份的有机溶剂J中，用恒压滴液漏斗在5～30分钟内滴加到1）得到的反应体系中，继续搅拌反应0.5～6小时后，加入氯化铵调节溶液的pH值到7～9，有大量的白色物质析出。用去离子水和有机溶剂J分别清洗抽滤2次以上，然后将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的对甲苯磺酰化衍生物d。
碱I为NaOH、KOH或氨水，优选为NaOH或KOH。
有机溶剂J为三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO，优选为三氯甲烷或DMSO。
优选的反应条件为：
1）称取1份β-环糊精，加入5～12份质量浓度为0.5%～2%的碱I的水溶液中，在-10～30℃下搅拌使β-环糊精完全溶解；
2）将1～3份对甲苯磺酰氯溶解于1～5份的有机溶剂J中，用恒压滴液漏斗在10～20分钟内滴加到1）得到的反应体系中，继续搅拌反应1～3小时后，加入氯化铵调节溶液的pH值到7～9，有大量的白色物质析出。用去离子水和有机溶剂J分别清洗抽滤2次以上，然后将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的对甲苯磺酰化衍生物d。
第五步：环糊精单炔基化衍生物的制备
将1份第四步得到的对甲苯磺酰化衍生物d和1～10份炔丙胺或炔丙醇分散在10～150份的水和有机溶剂K的混合物中，在20～80℃、N2保护下，搅拌反应12～48小时后，加入沉淀剂L，析出沉淀，过滤，用水、有机溶剂K洗涤2次以上后，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的单炔基化衍生物e。
有机溶剂K为乙醇、丙醇、DMF或DMSO，优选为乙醇或DMSO。
水和有机溶剂K的混合物中水与有机溶剂O的质量比为1:9～9:1，优选为3:7～7:3。
沉淀剂L为乙腈、丙酮、四氢呋喃或N-甲基吡咯烷酮，优选为乙腈或四氢呋喃。
优选的反应条件为：将1份第四步得到的对甲苯磺酰化衍生物d和1～5份炔丙胺或炔丙醇分散在20～70份的水和有机溶剂K的混合物中，在40～70℃、N2保护下，搅拌反应20～30小时后，加入沉淀剂L，析出沉淀，过滤，用水、有机溶剂K洗涤2次以上后，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的单炔基化衍生物e。
第六步：点击化学反应制备壳聚糖2-NH2保护，6-OH定位固载化环糊精衍生物
1）称取1份第三步得到的壳聚糖的叠氮化衍生物c，溶解于1～30份的有机溶剂M中；
2）称取0.01～0.1份CuSO4·5H2O分散于1～10份有机溶剂N中，加入0.01～0.1份抗坏血酸钠及0.01～0.5份水，增进溶解；
3）将1）得到的溶液和2）得到的溶液进行混合；
4）称取1～5份第五步得到的环糊精的单炔基化衍生物e加入3）得到的混合溶液中，在0～80℃下搅拌反应0.5～8小时，停止反应，加入沉淀剂O后，用水洗涤2次以上，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f。
有机溶剂M为DMSO、DMF或DMAc。
有机溶剂N为乙醇、丙醇、DMF或DMSO，优选为乙醇或DMSO；
沉淀剂O为乙腈、丙酮、四氢呋喃或N-甲基吡咯烷酮，优选为乙腈或四氢呋喃。
优选的反应条件为：
1）称取1份壳聚糖的叠氮化衍生物c，溶解于5～15份的有机溶剂M中；
2）称取0.01～0.05份CuSO4·5H2O分散于1～10份有机溶剂N中，加入0.01～0.05份抗坏血酸钠及0.01～0.2份水增进溶解；
3）将1）得到的溶液和2）得到的溶液进行混合；
4）称取1～5份第五步得到的环糊精的单炔基化衍生物e加入3）得到的混合溶液中，在20～60℃下搅拌反应3～6小时，停止反应，加入沉淀剂O后，用水洗涤2次以上，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f。
第七步：2-NH2的脱保护反应及壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的获得
将1份第六步得到的邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f浸泡在20～200份的水合肼溶液中（其中H2NNH2与H2O的摩尔比为1:0.5～1:3），20～60℃下加热搅拌反应12～36小时，用有机溶剂P沉淀后，用有机溶剂Q洗涤两次后在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g。
有机溶剂P为甲醇、丙酮或乙腈。
有机溶剂Q为乙醇、乙醚或苯。
优选的反应条件为：将第六步得到的1份邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f浸泡在30～100份的水合肼溶液中（其中H2NNH2与H2O的摩尔比为1:0.5～1:2），20～40℃下加热搅拌反应12～20小时，用有机溶剂P沉淀后，用有机溶剂Q洗涤两次后在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g。
二、本发明的一种利用上述壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g制备用于H2O2电化学检测的生物传感器膜材料的方法，具体制备步骤如下：
第一步：壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体的制备
将壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g溶于溶剂R中。再将溶于溶剂S的电子媒介体的溶液加入上述溶液中。然后将反应体系在30～90℃油浴中回流搅拌反应1～8小时。反应完毕后，用去离子水沉淀包合物，用溶剂S洗去未发生包合的电子媒介体，干燥，得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体产物。
其中壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物在溶剂R中的浓度为0.001～0.05mol/L；壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g与电子媒介体的摩尔投料比1:0.5～1:10，电子媒介体在溶剂S中的摩尔浓度为0.1mol/L～15mol/L。
溶剂R为：DMF，DMSO，DMAc。
溶剂S为：四氢呋喃，乙腈，乙醚，N-甲基吡咯烷酮。
电子媒介体为：二茂铁，氢醌，四硫富瓦烯中的一种。
第二步：壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体-固载过氧化氢酶的制备
将第一步得到的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体产物溶解于溶剂R中，使该溶液的摩尔浓度为0.001～0.05mol/L。将过氧化氢酶加入pH=7的0.05～0.2mol/L的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为10.0～50.0mg/mL的过氧化氢酶溶液。
称取1份的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体溶液，按照过氧化氢酶占溶液用量为0.0005～0.01份加入过氧化氢酶溶液，在4～70摄氏度反应0.5～10小时后，加入0.0001～0.008份的戊二醛，在4～70摄氏度再反应0.5～10小时后，加入5～40份的去离子水，搅拌后离心分离，抽滤，用去离子水洗涤固体产物，洗去未发生交联的戊二醛，抽滤，用0.05～0.2mol/L的PBS缓冲溶液洗去未发生固定化的过氧化氢酶，制得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包结电子媒介体-固载过氧化氢酶产物，即为用于H2O2电化学检测的生物传感器膜材料。
三、本发明的一种利用上述壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体-固载过氧化氢酶产物对H2O2进行电化学生物检测的方法，首先将壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体-固载过氧化氢酶产物修饰在玻碳电极表面；再配制不同浓度的H2O2标准溶液，测量修饰后电极在各H2O2标准溶液的循环伏安曲线，将所有循环伏安曲线中峰电流与H2O2标准溶液浓度作图，得到该修饰电极的对H2O2的有效检测范围及工作曲线，最后测量修饰后电极在H2O2待测溶液的循环伏安曲线，对应该修饰电极的工作曲线，得到待测溶液中H2O2的浓度。
有益效果
通过本发明方法制备的壳聚糖6-OH定位固载环糊精衍生物在保证环糊精固载率可达到216μmol·g-1以上的同时，又提高了其在水、DMSO、DMF、DMAc等溶剂中的溶解性，使其在以酶催化作用配合电化学检测的酶基生物传感器中的应用成为可能。与传统壳聚糖构筑传感器膜相比，通过本发明衍生物制备而成的传感器敏感膜材料，通过环糊精包结的电子媒介体促进电极与酶之间电子的传递，由于可实现电子媒介体的均匀包合和酶的高效固载，对H2O2的有效检测范围也得到了较大的提高，大大扩展了该衍生物的应用领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容做进一步说明。
实施例1（壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备）
称取1份的壳聚糖溶于200份的质量浓度为1%的醋酸/水溶液中。将2份邻苯二甲酸酐溶于50份乙醇中后滴加到反应体系中，在50℃下搅拌反应5小时。然后加入甲醇使产生的壳聚糖衍生物沉淀析出，用乙醇洗涤2次以上以除去多余邻苯二甲酸酐化合物，然后60℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐保护的壳聚糖衍生物a。
将1份邻苯二甲酸酐保护的壳聚糖衍生物a溶解在200份的DMSO中，向其中加入30份对甲苯磺酰氯的三氯甲烷溶液，其中对甲苯磺酰氯的质量浓度为20%，10分钟滴完，30℃下反应3小时，抽滤，得浅黄色固体，用三氯甲烷洗去未反应的对甲苯磺酰氯，60℃下真空干燥得到壳聚糖衍生物b。
称取1份壳聚糖衍生物b溶于20份的DMSO中，30℃下搅拌使之溶解，加入4份的叠氮化钠，在60℃条件下搅拌反应4小时，反应结束后，使用100份水沉淀，用水洗涤析出物，最后依次用乙醇和水洗涤2次，抽滤后60℃真空干燥得到壳聚糖的叠氮化衍生物c。
称取1份β-环糊精，加入10份质量浓度为1%的KOH的水溶液中，在10℃下搅拌使β-环糊精完全溶解。将1.1份对甲苯磺酰氯溶解于3份的DMSO中，用恒压滴液漏斗在10分钟内缓慢的滴加到反应体系中，继续搅拌反应2小时后，加入氯化铵调节溶液的pH值到8，有大量的白色物质析出。用去离子水和DMSO分别清洗抽滤3次，然后将滤饼在60℃下真空干燥得到环糊精的对甲苯磺酰化衍生物d。
将1份对甲苯磺酰化衍生物d和1.3份炔丙醇分散在30份的水和乙醇的混合物中，其中水和乙醇的质量比为4:6，在50℃、N2保护下，搅拌反应26小时后，加入乙腈沉淀，过滤，用水、乙醇洗涤2次后，将滤饼在60℃下真空干燥得到环糊精的单炔基化衍生物e。
称取1份壳聚糖的叠氮化衍生物c，溶解于15份的DMSO中，另外称取0.04份CuSO4·5H2O分散于5份乙醇中，加入0.02份抗坏血酸钠及0.1份水增进溶解，将溶液进行混合，称取3份单炔基化衍生物e，加入上述溶液，在40℃下搅拌反应3小时，停止反应，加入乙腈沉淀后，用水洗涤2次，将滤饼在60℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f。
将得到的1份邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f浸泡在50份H2NNH2与H2O的摩尔比为1:1的水合肼溶液中，30℃下加热搅拌反应15小时，用丙酮沉淀后后，用乙醇洗涤两次后在60℃下真空干燥得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g。测得环糊精的固载率为221.7μmol·g-1，壳聚糖2-NH2的保留程度为93.8%。壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物在DMF中溶解后最高浓度可达0.03mol/L，在DMAc中溶解后最高浓度可达0.06mol/L，在DMSO中溶解后最高浓度可达0.055mol/L，DMF中溶解后最高浓度可达0.065mol/L。
实施例2（壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备）
利用具体实施例1所制备的壳聚糖的叠氮化衍生物c及环糊精的单炔基化衍生物e的点击化学反应制备邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f：
称取1份壳聚糖的叠氮化衍生物c，溶解于10份的DMAc中，另外称取0.03份CuSO4·5H2O分散于5份乙醇中，加入0.03份抗坏血酸钠及0.05份水增进溶解，将溶液进行混合，称取4份单炔基化衍生物e，加入上述溶液，在60℃下搅拌反应5小时，停止反应，加入乙腈沉淀后，用水洗涤2次，将滤饼在60℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f。
将得到的1份邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f浸泡在40份H2NNH2与H2O的摩尔比为1:1的水合肼溶液中，50℃下加热搅拌反应18小时，用丙酮沉淀后后，用乙醚洗涤两次后在60℃下真空干燥得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g。测得环糊精的固载率为237.7μmol·g-1，壳聚糖2-NH2的保留程度为95.1%。壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物在DMF中溶解后最高浓度可达0.055mol/L，在DMAc中溶解后最高浓度可达0.080mol/L，在DMSO中溶解后最高浓度可达0.070mol/L，DMF中溶解后最高浓度可达0.090mol/L。
实施例3（利用本发明的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物制备生物传感器膜材料并用于H2O2电化学检测）
将实施例1所获得的壳聚糖固载环糊精衍生物溶于DMAc中，其中壳聚糖固载环糊精衍生物在溶液中的浓度为0.025mol/L。将事先溶于四氢呋喃的电子媒介体二茂铁的溶液加入其中。反应中壳聚糖固载环糊精衍生物与二茂铁的摩尔投料比1:1，二茂铁在四氢呋喃中的摩尔浓度为1.0mol/L。在70℃油浴中回流搅拌反应8小时。反应完毕后，用去离子水沉淀包合物，用四氢呋喃洗去未发生包合的电子媒介体，干燥，得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体产物。测得二茂铁的包合率为35.7%。
将壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合二茂铁产物溶解于DMAc中，溶液的摩尔浓度为0.02mol/L。将过氧化氢酶加入pH=7的0.2mol/L的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为30mg/mL的过氧化氢酶溶液。
称取1份的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体溶液，按照过氧化氢酶占溶液用量为0.006份加入过氧化氢酶溶液，在30摄氏度反应2小时后，加入0.002份的戊二醛，在40摄氏度再反应2小时后，加入20份的去离子水，搅拌后离心分离，抽滤，在去离子水洗涤固体产物，洗去未发生交联的戊二醛，抽滤，用0.1mol/L的PBS缓冲溶液洗去未发生固定化的过氧化氢酶，制得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合二茂铁-固载过氧化氢酶产物。测得酶的相对活性为93.8%。
将玻碳电极用Al2O3抛光至镜面，然后依次在去离子水、无水乙醇、去离子水中超声清洗1分钟，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。将本实施例所获得的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合二茂铁-固载过氧化氢酶溶解于DMAc中，配制成5×10-3mol/L溶液，振荡30分钟后，取6μL滴加在玻碳电极上，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合二茂铁-固载过氧化氢酶修饰的电极。
将1mL不同浓度的H2O2标准溶液，加入5.00mL的pH=7.0的0.1mol/L PBS缓冲溶液中，在此溶液中，在-0.80～0.80V电位范围内，测量修饰电极的循环伏安曲线。通过循环伏安曲线中峰电流与H2O2标准溶液浓度作图，得到修饰电极修饰电极对H2O2的有效检测范围为6.0×10-7–5.0×10-3mol/L。修饰电极的工作曲线为：
I=0.0061+1.1378×C
式中，I为峰电流的值，10-6A；C为H2O2溶液浓度，10-3mol/L。
实施例4（利用本发明的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物制备生物传感器膜材料并用于H2O2电化学检测）
将实施例1所获得的壳聚糖固载环糊精衍生物溶于DMF中，壳聚糖固载环糊精衍生物在溶液中的浓度为0.04mol/L。将事先溶于乙醚的电子媒介体醌氢醌的溶液加入其中。反应中壳聚糖固载环糊精衍生物与醌氢醌的摩尔投料比1:4，醌氢醌在乙醚中的摩尔浓度为12.0mol/L。在40℃油浴中回流搅拌反应7小时。反应完毕后，用去离子水沉淀包合物，用乙醚洗去未发生包合的电子媒介体，干燥，得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合醌氢醌产物。测得醌氢醌的包合率为16.8%。
将壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合醌氢醌产物溶解于DMF中，溶液的摩尔浓度为0.05mol/L。将过氧化氢酶加入pH=7的0.1mol/L的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为30mg/mL的过氧化氢酶溶液。
称取1份的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合醌氢醌溶液，按照过氧化氢酶占溶液用量为0.006份加入过氧化氢酶溶液，在20摄氏度反应3小时后，加入0.008份的戊二醛，在20摄氏度再反应3小时后，加入10份的去离子水，搅拌后离心分离，抽滤，在去离子水洗涤固体产物，洗去未发生交联的戊二醛，抽滤，用0.1mol/L的PBS缓冲溶液洗去未发生固定化的过氧化氢酶，制得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合醌氢醌-固载过氧化氢酶产物。测得酶的相对活性为93.1%。
将玻碳电极用Al2O3抛光至镜面，然后依次在去离子水、无水乙醇、去离子水中超声清洗1分钟，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。将本实施例所获得的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合醌氢醌-固载过氧化氢酶溶解于DMF中，配制成5×10-3mol/L溶液，振荡30分钟后，取6μL滴加在玻碳电极上，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合醌氢醌-固载过氧化氢酶修饰的电极。
将1mL不同浓度的H2O2标准溶液，加入5.00mL的pH=7.0的0.1mol/L PBS缓冲溶液中，在此溶液中，在-0.80～0.80V电位范围内，测量修饰电极的循环伏安曲线。通过循环伏安曲线中峰电流与H2O2标准溶液浓度作图，得到修饰电极修饰电极对H2O2的有效检测范围为0.8×10-7–4.0×10-2mol/L，修饰电极的工作曲线为：
I=0.5167+0.7169×C
式中，I为峰电流的值，10-6A；C为H2O2溶液浓度，10-3mol/L。
实施例5（利用本发明的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物制备生物传感器膜材料并用于H2O2电化学检测）
将实施例2所获得的壳聚糖固载环糊精衍生物溶于DMSO中，壳聚糖固载环糊精衍生物在溶液中的浓度为0.002mol/L。将事先溶于乙腈的电子媒介体四硫富瓦烯的溶液加入其中。反应中壳聚糖固载环糊精衍生物与四硫富瓦烯的摩尔投料比1:0.8，四硫富瓦烯在乙腈中的摩尔浓度为0.4mol/L。在30℃油浴中回流搅拌反应6小时。反应完毕后，用去离子水沉淀包合物，用乙腈洗去未发生包合的四硫富瓦烯，干燥，得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合四硫富瓦烯产物。测得四硫富瓦烯的包合率为82.7%。
将壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合四硫富瓦烯产物溶解于DMSO中，溶液的摩尔浓度为0.01mol/L。将过氧化氢酶加入pH=7的0.075mol/L的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为10mg/mL的过氧化氢酶溶液。
称取1份的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合四硫富瓦烯溶液，按照过氧化氢酶占溶液用量为0.001份加入过氧化氢酶溶液，在60摄氏度反应1小时后，加入0.001份的戊二醛，在60摄氏度再反应0.5小时后，加入40份的去离子水，搅拌后离心分离，抽滤，在去离子水洗涤固体产物，洗去未发生交联的戊二醛，抽滤，用0.1mol/L的PBS缓冲溶液洗去未发生固定化的过氧化氢酶，制得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合四硫富瓦烯-固载过氧化氢酶产物。测得酶的相对活性为89.1%。
将玻碳电极用Al2O3抛光至镜面，然后依次在去离子水、无水乙醇、去离子水中超声清洗1分钟，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。将本实施例所获得的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合四硫富瓦烯-固载过氧化氢酶溶解于DMSO中，配制成5×10-3mol/L溶液，振荡30分钟后，取6μL滴加在玻碳电极上，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合四硫富瓦烯-固载过氧化氢酶修饰的电极。
将1mL不同浓度的H2O2标准溶液，加入5.00mL的pH=7.0的0.1mol/L PBS缓冲溶液中，在此溶液中，在-0.80～0.80V电位范围内，测量修饰电极的循环伏安曲线。通过循环伏安曲线中峰电流与H2O2标准溶液浓度作图，得到修饰电极修饰电极对H2O2的有效检测范围为1.7×10-6–2.3×10-2mol/L，修饰电极的工作曲线为：
I=1.2198+0.7969×C
式中，I为峰电流的值，10-6A；C为H2O2溶液浓度，10-3mol/L。
实施例6（壳聚糖用于H2O2电化学检测的对照实施例）
将壳聚糖以摩尔浓度为0.025mol/L溶解于质量浓度为1%的稀醋酸溶液中。将过氧化氢酶加入pH=7的0.1mol/L的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为20mg/mL的过氧化氢酶溶液。
称取1份的壳聚糖稀醋酸溶液，按照过氧化氢酶占溶液用量为0.005份加入过氧化氢酶溶液，在30摄氏度反应2小时后，加入0.001份的戊二醛，在30摄氏度再反应3小时后，加入20份的去离子水，搅拌后离心分离，抽滤，在去离子水洗涤固体产物，洗去未发生交联的戊二醛，抽滤，用0.1mol/L的PBS缓冲溶液洗去未发生固定化的过氧化氢酶，制得壳聚糖固载过氧化氢酶产物。测得酶的相对活性为94.6%。
将玻碳电极用Al2O3抛光至镜面，然后依次在去离子水、无水乙醇、去离子水中超声清洗1分钟，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。将上述获得的壳聚糖固载过氧化氢酶溶解于质量浓度为1%的稀醋酸溶液中，配制成5×10-3mol/L溶液，振荡30分钟后，取6μL滴加在玻碳电极上，将电极垂直放置，在25℃下自然风干。得到壳聚糖固载过氧化氢酶修饰的电极。
将1mL不同浓度的H2O2标准溶液，加入5.00mL的pH=7.0的0.1mol/L PBS缓冲溶液中，在此溶液中，在-0.80～0.80V电位范围内，测量修饰电极的循环伏安曲线。通过循环伏安曲线中峰电流与H2O2标准溶液浓度作图，得到修饰电极修饰电极对H2O2的有效检测范围为8.0×10-5–2.0×10-3mol/L，修饰电极的工作曲线为：
I=0.0189+2.5768×C
式中，I为峰电流的值，10-6A；C为H2O2溶液浓度，10-3mol/L。
该修饰电极对H2O2的有效检测范围，最低检测值等均显著劣于实施例4所获得的修饰电极。
Claims (9)
1.一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其特征是：
具体制备步骤为：
第一步：壳聚糖2-NH2保护衍生物的制备
1）称取1份壳聚糖溶于30～400份的质量浓度为0.1%～10%的醋酸的水溶液中；
2）将1～10份邻苯二甲酸酐溶于30～400份有机化合物A中后滴加到1）得到的反应体系中，在0～80℃下搅拌反应0.5～8小时；然后加入溶剂B使产生的壳聚糖衍生物沉淀析出，用有机溶剂C洗涤2次以上以除去多余邻苯二甲酸酐化合物，然后50～80℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐保护的壳聚糖衍生物a；
有机化合物A为乙醇、乙醚、苯或DMF；
有机溶剂B为甲醇、丙酮或乙腈；
有机溶剂C为乙醇、乙醚或苯；
第二步：壳聚糖2-NH2保护，6-OH对甲苯磺酰酯化衍生物的制备
将1份第一步得到的邻苯二甲酸酐化壳聚糖衍生物a溶解在20-400份的有机溶剂D中，向其中加入10～100份的对甲苯磺酰氯的有机溶液E，1～60分钟滴完，然后在-10～80℃下反应0.5～8小时，抽滤，得浅黄色固体，用有机溶剂F洗去未反应的对甲苯磺酰氯，在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖衍生物b；
有机溶剂D为DMF，DMSO或DMAc；
有机溶液E中的溶剂为三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO；有机溶液E中对甲苯磺酰氯的质量浓度为2%～40%；
有机溶剂F为三氯甲烷、丙酮或N-甲基吡咯烷酮；
第三步：壳聚糖2-NH2保护，6-OH叠氮化衍生物的制备
称取1份第二步得到的壳聚糖衍生物b溶于10～60份的有机溶剂G中，0～80℃下搅拌使之溶解，加入1～10份的叠氮化钠，在20～100℃条件下搅拌反应1～8小时，反应结束后，使用50～300份水沉淀，用水洗涤析出物，最后依次用有机溶剂H和水洗涤2次以上，抽滤后50～100℃真空干燥得到壳聚糖的叠氮化衍生物c；
有机溶剂G为DMF、DMSO或DMAc；
有机溶剂H为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈或四氢呋喃；
第四步：环糊精单对甲苯磺酰化衍生物的制备
1）称取1份β-环糊精，加入3～20份质量浓度为0.2%～5%的碱I的水溶液中，在-10～50℃下搅拌使β-环糊精完全溶解；
2）将0.5～5份对甲苯磺酰氯溶解于1～10份的有机溶剂J中，用恒压滴液漏斗在5～30分钟内滴加到1）得到的反应体系中，继续搅拌反应0.5～6小时后，加入氯化铵调节溶液的pH值到7～9，有大量的白色物质析出；用去离子水和有机溶剂J分别清洗抽滤2次以上，然后将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的对甲苯磺酰化衍生物d；
碱I为NaOH、KOH或氨水；
有机溶剂J为三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO；
第五步：环糊精单炔基化衍生物的制备
将1份第四步得到的对甲苯磺酰化衍生物d和1～10份炔丙胺或炔丙醇分散在10～150份的水和有机溶剂K的混合物中，在20～80℃、N2保护下，搅拌反应12～48小时后，加入沉淀剂L，析出沉淀，过滤，用水、有机溶剂K洗涤2次以上后，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的单炔基化衍生物e；
有机溶剂K为乙醇、丙醇、DMF或DMSO；
水和有机溶剂K的混合物中水与有机溶剂O的质量比为1:9～9:1；
沉淀剂L为乙腈、丙酮、四氢呋喃或N-甲基吡咯烷酮；
第六步：点击化学反应制备壳聚糖2-NH2保护，6-OH定位固载化环糊精衍生物
1）称取1份第三步得到的壳聚糖的叠氮化衍生物c，溶解于1～30份的有机溶剂M中；
2）称取0.01～0.1份CuSO4·5H2O分散于1～10份有机溶剂N中，加入0.01～0.1份抗坏血酸钠及0.01～0.5份水，增进溶解；
3）将1）得到的溶液和2）得到的溶液进行混合；
4）称取1～5份第五步得到的环糊精的单炔基化衍生物e加入3）得到的混合溶液中，在0～80℃下搅拌反应0.5～8小时，停止反应，加入沉淀剂O后，用水洗涤2次以上，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f；
有机溶剂M为DMSO、DMF或DMAc；
有机溶剂N为乙醇、丙醇、DMF或DMSO；
沉淀剂O为乙腈、丙酮、四氢呋喃或N-甲基吡咯烷酮；
第七步：2-NH2的脱保护反应及壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的获得
将1份第六步得到的邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f浸泡在20～200份的水合肼溶液中（其中H2NNH2与H2O的摩尔比为1:0.5～1:3），20～60℃下加热搅拌反应12～36小时，用有机溶剂P沉淀后，用有机溶剂Q洗涤两次后在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g；
有机溶剂P为甲醇、丙酮或乙腈；
有机溶剂Q为乙醇、乙醚或苯。
2.如权利要求1所述的一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其特征是：
其中第二步的壳聚糖2-NH2保护，6-OH对甲苯磺酰酯化衍生物的制备，其具体制备方法为：
将1份第一步得到的邻苯二甲酸酐化壳聚糖衍生物a溶解在20-100份的有机溶剂D中，向其中加入20～60份的对甲苯磺酰氯的有机溶液E，10～40分钟滴完，然后在-10～80℃下反应3～6小时，抽滤，得浅黄色固体，用有机溶剂F洗去未反应的对甲苯磺酰氯，在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖衍生物b；
有机溶剂D为DMF，DMSO或DMAc；
有机溶液E中的溶剂为三氯甲烷或DMSO；有机溶液E中对甲苯磺酰氯的质量浓度为2%～40%；
有机溶剂F为三氯甲烷、丙酮或N-甲基吡咯烷酮。
3.如权利要求1所述的一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其特征是：
其中第三步的壳聚糖2-NH2保护，6-OH叠氮化衍生物的制备，其具体制备方法为：
称取1份壳聚糖衍生物b溶于20～40份的有机溶剂G中，0～80℃下搅拌使之溶解，加入1～4份的叠氮化钠，在50～90℃条件下搅拌反应3～6小时，反应结束后，使用50～300份水沉淀，用水洗涤析出物，最后依次用有机溶剂H和水洗涤2次以上，抽滤后50～80℃真空干燥得到壳聚糖的叠氮化衍生物c；
有机溶剂G为DMF、DMSO或DMAc；
有机溶剂H为乙醇、丙酮或四氢呋喃。
4.如权利要求1所述的一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其特征是：
其中第四步的环糊精单对甲苯磺酰化衍生物的制备，其具体制备方法为：
1）称取1份β-环糊精，加入5～12份质量浓度为0.5%～2%的碱I的水溶液中，在-10～30℃下搅拌使β-环糊精完全溶解；
2）将1～3份对甲苯磺酰氯溶解于1～5份的有机溶剂J中，用恒压滴液漏斗在10～20分钟内滴加到1）得到的反应体系中，继续搅拌反应1～3小时后，加入氯化铵调节溶液的pH值到7～9，有大量的白色物质析出；用去离子水和有机溶剂J分别清洗抽滤2次以上，然后将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的对甲苯磺酰化衍生物d；
碱I为NaOH或KOH；
有机溶剂J为三氯甲烷或DMSO。
5.如权利要求1所述的一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其特征是：
其中第五步的环糊精单炔基化衍生物的制备，其具体制备方法为：
将1份第四步得到的对甲苯磺酰化衍生物d和1～5份炔丙胺或炔丙醇分散在20～70份的水和有机溶剂K的混合物中，在40～70℃、N2保护下，搅拌反应20～30小时后，加入沉淀剂L，析出沉淀，过滤，用水、有机溶剂K洗涤2次以上后，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到环糊精的单炔基化衍生物e；
有机溶剂K为乙醇或DMSO；
水和有机溶剂K的混合物中水与有机溶剂O的质量比为3:7～7:3；
沉淀剂L为乙腈或四氢呋喃。
6.如权利要求1所述的一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其特征是：
其中第六步的点击化学反应制备壳聚糖2-NH2保护，6-OH定位固载化环糊精衍生物，其具体制备方法为：
1）称取1份壳聚糖的叠氮化衍生物c，溶解于5～15份的有机溶剂M中；
2）称取0.01～0.05份CuSO4·5H2O分散于1～10份有机溶剂N中，加入0.01～0.05份抗坏血酸钠及0.01～0.2份水增进溶解；
3）将1）得到的溶液和2）得到的溶液进行混合；
4）称取1～5份第五步得到的环糊精的单炔基化衍生物e加入3）得到的混合溶液中，在20～60℃下搅拌反应3～6小时，停止反应，加入沉淀剂O后，用水洗涤2次以上，将滤饼在50～80℃下真空干燥得到邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f；
有机溶剂M为DMSO、DMF或DMAc；
有机溶剂N为乙醇或DMSO；
沉淀剂O为乙腈或四氢呋喃。
7.如权利要求1所述的一种壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的制备方法，其特征是：
其中第七步的2-NH2的脱保护反应及壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物的获得，其具体制备方法为：
将第六步得到的1份邻苯二甲酸酐化壳聚糖固载环糊精衍生物f浸泡在30～100份的水合肼溶液中（其中H2NNH2与H2O的摩尔比为1:0.5～1:2），20～40℃下加热搅拌反应12～20小时，用有机溶剂P沉淀后，用有机溶剂Q洗涤两次后在50～80℃下真空干燥得到壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g；
有机溶剂P为甲醇、丙酮或乙腈；
有机溶剂Q为乙醇、乙醚或苯。
8.一种利用权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物制备用于H2O2电化学检测的生物传感器膜材料的方法，其特征是：
具体制备步骤如下：
第一步：壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体的制备
将壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g溶于溶剂R中；再将溶于溶剂S的电子媒介体的溶液加入上述溶液中；然后将反应体系在30～90℃油浴中回流搅拌反应1～8小时；反应完毕后，用去离子水沉淀包合物，用溶剂S洗去未发生包合的电子媒介体，干燥，得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体产物；
其中壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物在溶剂R中的浓度为0.001～0.05mol/L；壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物g与电子媒介体的摩尔投料比1:0.5～1:10，电子媒介体在溶剂S中的摩尔浓度为0.1mol/L～15mol/L；
溶剂R为：DMF，DMSO，DMAc；
溶剂S为：四氢呋喃，乙腈，乙醚，N-甲基吡咯烷酮；
电子媒介体为：二茂铁，氢醌，四硫富瓦烯中的一种；
第二步：壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体-固载过氧化氢酶的制备
将第一步得到的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体产物溶解于溶剂R中，使该溶液的摩尔浓度为0.001～0.05mol/L；将过氧化氢酶加入pH=7的0.05～0.2mol/L的PBS缓冲溶液中，配制成质量浓度为10.0～50.0mg/mL的过氧化氢酶溶液；
称取1份的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体溶液，按照过氧化氢酶占溶液用量为0.0005～0.01份加入过氧化氢酶溶液，在4～70摄氏度反应0.5～10小时后，加入0.0001～0.008份的戊二醛，在4～70摄氏度再反应0.5～10小时后，加入5～40份的去离子水，搅拌后离心分离，抽滤，用去离子水洗涤固体产物，洗去未发生交联的戊二醛，抽滤，用0.05～0.2mol/L的PBS缓冲溶液洗去未发生固定化的过氧化氢酶，制得壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包结电子媒介体-固载过氧化氢酶产物，即为用于H2O2电化学检测的生物传感器膜材料。
9.一种利用权利要求8所述的壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体-固载过氧化氢酶产物对H2O2进行电化学生物检测的方法，其特征是：
首先将壳聚糖6-OH固载环糊精衍生物包合电子媒介体-固载过氧化氢酶产物修饰在玻碳电极表面；再配制不同浓度的H2O2标准溶液，测量修饰后电极在各H2O2标准溶液的循环伏安曲线，将所有循环伏安曲线中峰电流与H2O2标准溶液浓度作图，得到该修饰电极的对H2O2的有效检测范围及工作曲线，最后测量修饰后电极在H2O2待测溶液的循环伏安曲线，对应该修饰电极的工作曲线，得到待测溶液中H2O2的浓度。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103751835A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-04-30 | 北京理工大学 | 壳聚糖6-oh固载环糊精包合茶树油衍生物的制备方法 |
| CN103751835B (zh) * | 2013-12-13 | 2017-01-04 | 北京理工大学 | 壳聚糖6-oh固载环糊精衍生物包合茶树油的制备方法 |
| CN107807158A (zh) * | 2017-09-08 | 2018-03-16 | 中国农业大学 | 一种用于3‑mcpd检测的有机相介质体系构建方法 |
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| CN115572335A (zh) * | 2022-09-19 | 2023-01-06 | 齐鲁工业大学 | 一种用于甲醛监测的壳聚糖基荧光探针及其制备方法和应用 |
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