CN112094307A - 靶向泛素化降解ERα蛋白的化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类具有雌激素受体α(ERα)活性的化合物，具体地，本发明提供了具有通式(I)或通式(II)的1，3，5‑三嗪类化合物或其可药用的盐；其中，各集团的定义如说明书中所述。本发明的化合物具有ERα降解活性，可用于制备治疗人乳腺癌、子宫内膜癌的药物。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及一类新化合物及其能降解雌激素受体α(ERα)的用途。这些化合物能降解ERα，并且可用作ERα抑制剂或降解剂用于治疗乳腺癌等疾病。
背景技术
雌激素受体(ER)与其内源性的配体E2发生特异性结合后，可通过激发雌激素受体介导的相关信号通路来调控乳腺上皮细胞的增殖、分化和凋亡，如果信号通路出现异常，会引发相关基因表达紊乱，进而导致乳腺上皮细胞过度生长和繁殖，最终诱导乳腺癌的发生。ERα已被证实能够促进乳腺癌的增长和繁殖，其作为有效的乳腺癌治疗靶点一直被广泛研究。目前，选择性雌激素受体调节剂(SERMs)如Tamoxifen，Raloxifene以及选择性雌激素受体下调剂(SERDs)如Fulvestrant作为ERα调节剂，已经被批准用于ER阳性乳腺癌的治疗。然而SERMs多数存在易耐药性及引发子宫内膜癌的缺点，SERDs存在口服生物利用度差的问题，因此，需要开发新型的ERα下调剂。
蛋白水解靶向嵌合分子(Proteolysis Targeting Chimeras，PROTACs)技术是利用一种双功能小分子将目标蛋白和细胞内的E3拉近，从而导致目标蛋白降解。PROTACs包含三部分功能结构：(1)可以与蛋白底物相结合的部分；(2)能够与E3相结合的部分；(3)前两部分的连接链。在细胞内PROTACs可以同时与靶蛋白和E3结合，使本来不能与E3结合的靶蛋白泛素化，进而被蛋白酶体识别并降解。其中，CRBN与VHL是两个常用的E3泛素连接酶配体。
发明内容
发明目的：提供一类化合物，其利用靶向嵌合体技术将ERα降解。
本发明的另一目的是提供上述化合物制备方法。
本发明的最后一个目的是提供所述的化合物在制备治疗人乳腺癌、子宫内膜癌的药物中的用途。
技术方案：本发明提供一种具有通式(I)的靶向泛素化降解ERα的化合物。
其中，
D为D1时，L选自碳数为3的饱和烷基，或碳数为6-10的烷氧基；
D为D2时，L选自碳数为4或10的饱和烷基；
D选自D1或D2，其结构如下：
进一步地，所述的具有通式(I)的靶向泛素化降解ERα的化合物或其可药用的盐，为如下任一种：
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-((2S，4R)-1-((S)-2-胺戊酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺)羰甲氧基-3，17β-二醇(A01)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-((2S，4R)-1-((S)-2-胺十一酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺)羰甲氧基-3，17β-二醇(A02)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A03)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙氧乙氧丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A04)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙氧基二乙氧基丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A05)
一种药物组合物，其含有治疗有效量的一种或多种所述的具有通式(I)的靶向泛素化降解ERα的化合物。
具有通式(I)的化合物或其可药用的盐的制备方法：
a、通式(I)靶向泛素化降解ERα的化合物的制备方法，包括如下步骤：
对于E3连接酶CRBN，本系列中选用泊马度胺作为其配体。该片段的合成以化合物1为原料，与不同的Boc单保护二胺反应，得到化合物3。随后利用三氟乙酸脱去Boc保护基，得到含有不同侧链结构配体片段4。
对于另一个VHL配体片段的合成，则是从化合物5出发，利用分子内氨基与不同N-Boc羧酸片段形成酰胺结构，得到化合物7，最终通过三氟乙酸脱去Boc保护基，得到含有不同侧链结构的VHL配体片段(8)。
化合物A01～A05的合成以雌酚酮9为原料，首先利用DDQ脱氢构建9，11位双键，随后NaBH4还原17-位羰基，并将双羟基用苄基保护，得到化合物12。化合物12经过硼氢化氧化在11-位引入羟基，其中α/β构型(3∶1)，再经过IBX氧化，NaBH4还原将11-位羟基统一为β构型，得到中间体15。而后利用Williamson醚合成法，在叔丁醇钾作用下，与溴乙酸叔丁酯反应得到化合物16。然后化合物16通过钯碳加氢反应，脱去保护基，随后酯水解得到化合物18。最后，在酰胺缩合剂HATU作用下，与之前合成的不同侧链片段反应，得到目标产物。
附图说明
图1为化合物A01～A05与阳性对照Fluvestrant对MCF-7细胞内ERα降解情况。
具体实施方式
以下实施例中的熔点数据结果均是由X-4型数字显示显微熔点仪(北京泰克仪器有限公司)测定；终产物以及中间体的核磁谱图数据是以DMSO-d6或者CDCl3-d3为溶剂，TMS为内标，由Bruker公司的300MHz或者400MHz核磁共振仪测定；高分辨质谱(HRMS)均是由安捷伦公司的型号为Q-TOF 6520的质谱仪测定。
化合物的合成、纯化、分离中所使用的试剂有：(1)柱层析硅胶：200或者300目硅胶均购自青岛海洋化工；(2)HSGF254型TLC薄层色谱板：购自烟台化工研究所；(3)柱层析洗脱系统中所使用的常规溶剂如石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等以及反应所需的化学试剂，除特殊说明外，均为市售化学纯或分析纯产品。
实施例1：N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-丙基氨基甲酸叔丁酯异吲哚啉-1，3-二酮(3a)的合成
将化合物1(126μL，0.72mmol)溶于无水DMF中，而后在氮气保护下依次向其中加入化合物2a(200mg，0.72mmol)，DIPEA(240μL，1.2mmol)，90℃下反应过夜。TLC检测反应完成后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，有机层用饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得黄色固体3a(0.2g，50％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.3l(s，1H)，7.53(m，1H)，7.13(d，J＝7.1Hz，1H)，6.98(d，J＝8.6Hz，1H)，6.49(t，J＝5.6Hz，1H)，5.02(s，1H)，4.95(dd，J＝11.8，5.4Hz，1H)，3.57(t，J＝6.0Hz，2H)，3.45(q，J＝6.4Hz，2H)，3.26(d，J＝6.7Hz，2H)，1.98(p，J＝6.2Hz，2H)，1.85-1.76(m，2H)，1.48(s，9H).MS(ESI，m/z)：430.1[M+H]+.
实施例2：N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-丙氧乙氧丙基氨基甲酸叔丁酯异吲哚啉-1，3-二酮(3b)的合成
采用合成化合物3a类似方法，合成得黄色固体3b(0.4g，45％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.05(s，1H)，7.46(dt，J＝17.0，8.6Hz，1H)，7.06(t，J＝7.0Hz，1H)，6.88(t，J＝8.0Hz，1H)，6.50(s，1H)，5.13(s，1H)，4.90(s，1H)，3.70(t，J＝5.3Hz，2H)，3.54(t，J＝5.2Hz，2H)，3.45(q，J＝5.4Hz，2H)，3.29(d，J＝5.0Hz，2H)，2.79-2.68(m，2H)，2.28(s，2H)，1.40(s，9H).MS(ESI，m/z)：532.2[M+H]+.
实施例3：N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-丙氧乙氧己基氨基甲酸叔丁酯异吲哚啉-1，3-二酮(3c)的合成
采用合成化合物3a类似方法，合成得黄色固体3c(0.3g，40％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.31(s，1H)，7.55-7.46(m，1H)，7.09(dd，J＝7.1，0.6Hz，1H)，6.95(d，J＝8.5Hz，1H)，6.42(t，J＝5.8Hz，1H)，4.99(s，1H)，4.97-4.89(m，1H)，3.74-3.58(m，10H)，3.54(t，J＝6.0Hz，2H)，3.42(q，J＝6.5Hz，2H)，3.22(s，5H)，1.94(p，J＝6.3Hz，2H)，1.82-1.71(m，4H).MS(ESI，m/z)：576.2[M+H]+.
实施例4：N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-氨丙基异吲哚啉-1，3-二酮(4a)的合成
化合物3a(0.2g，0.36mmol)溶于二氯甲烷(2ml)溶液中，加入等体积三氟乙酸，冰浴下反应1h。停止反应，蒸干溶剂及三氟乙酸得粗品三氟乙酸盐4a。不经纯化，直接下投。
实施例5：N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-氨丙氧乙氧丙基异吲哚啉-1，3-二酮(4b)的合成
采用合成化合物4a类似方法，合成得黄色液体148b，不经纯化，直接下投。
实施例6：N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-氨丙氧基二乙氧基丙基异吲哚啉-1，3-二酮(4c)的合成
采用合成化合物4a类似方法，合成得黄色液体4c，不经纯化，直接下投。
实施例7：(2S，4R)-1-((S)-2-(6-氨基甲酸酯基己酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺(7a)的合成
将化合物5(0.126mmol)和HATU(0.24mmol)溶解于无水DMF(2ml)中于室温下搅拌10min，随后加入6a(0.5mmol)，搅拌20min后，将DIPEA(0.6mmol)缓慢加入，室温反应5h。停止反应后，将体系倒入水中，抽滤，水洗滤饼。滤饼干燥后柱层析得白色固体7a(0.2g，39％)。MS(ESI，m/z)：713.4[M+H]+.
实施例8：(2S，4R)-1-((S)-2-氨十一酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺(7b)的合成
采用合成化合物7a类似方法，合成得白色固体7b(0.2g，39％)。MS(ESI，m/z)：713.4[M+H]+.
实施例9：(2S，4R)-1-((S)-2-氨戊酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺(8a)的合成
采用合成化合物4a类似方法，合成得无色液体8a，不经纯化，直接下投。
实施例10：(2S，4R)-1-((S)-2-氨十一酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺(9b)的合成
采用合成化合物4a类似方法，合成得无色液体8b，不经纯化，直接下投。
实施例11：3-羟基-雌甾-1，3，5(10)-三烯-9-烯-17酮(10)的合成
将雌酚酮9(5g，18.5mmol)，DDQ(6.4g，27.7mmol)溶解于甲醇(400ml)，65℃下反应10h。体系冷却至室温，浓缩溶剂，甲醇打浆得类白色固体10(2.5g，50％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.16(s，1H)，7.29(d，J＝8.7Hz，1H)，6.40(dt，J＝10.4，5.2Hz，1H)，6.33(d，J＝2.2Hz，1H)，5.91(d，J＝4.7Hz，1H)，2.72-2.57(m，2H)，2.12-1.72(m，7H)，1.56-1.34(m，2H)，1.14(s，1H).
实施例12：雌甾-1，3，5(10)-三烯-9-烯-3，17β-二醇(11)合成
将化合物10(2.2g，8.2mmol)和甲醇(100ml)加入250ml圆底烧瓶内，随后加入浓NaOH(0.85g，2.22mmol)溶液，体系变为澄清状态。室温条件下，将NaBH4(0.8g，2.22mmol)分三批加入反应体系，室温下反应4h。随后将体系倒入水(100ml)中，加入浓盐酸调pH至2，析出白色沉淀，抽滤得白色固体11(1.6g，80％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.10(s，1H)，7.27(d，J＝8.6Hz，1H)，6.39(d，J＝8.6Hz，1H)，6.30(s，1H)，5.89(s，1H)，4.45(d，J＝4.5Hz，1H)，3.47(d，J＝4.6Hz，1H)，2.58(q，2H)，2.06-1.69(m，6H)，1.38-0.91(m，6H)，0.53(s，3H).
实施例13：3，17β-二苄氧基-雌甾-1，3，5(10)-三烯-9-烯(12)的合成
无水条件下，将化合物11(1.6g，5.6mmol)和无水DMF(40ml)加入250ml圆底烧瓶中，冰浴条件下缓慢加入氢化钠(0.45g，11.2mmol)，反应2h后，缓慢加入氯化苄(1.28ml，11.2mol)，随后缓慢升至室温反应16h。反应完成后，体系倒入水中(100ml)，有类白色固体析出，抽滤，水洗，得化合物12(1.3g，70％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.89(s，3H)，2.81(m，2H).3.60(t，J＝8.6Hz，1H)，4.58(m，2H)，5.05(s，2H)，6.11(m，1H)，6.69(s，1H)，6.79(d，J＝8.2Hz，1H)，7.38(m，1OH)，7.54(d，J＝8.8Hz，1H).
实施例14：3，17β-二苄氧基-雌甾-1，3，5(10)-三烯-11-羟基(13)的合成
无水氮气保护的条件下，将化合物12(1.5g，4.2mmol)溶解于无水四氢呋喃(15ml)中，冰浴条件下缓慢加入1M硼烷四氢呋喃络合物(16ml，16.8mmol)，随后缓慢升至室温反应12h。随后，将体系置于冰浴条件下，缓慢加入冰水(7.65ml)，30％NaOH溶液(7.5ml)和30％H2O2溶液(7.5ml)，随后室温下反应6h。反应完成后，将体系抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。滤液萃取，水相再用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，再用饱和食盐水萃取一次，无水硫酸钠干燥。旋干后不经纯化直接下投。
实施例15：3，17β-二苄氧基-雌甾-1，3，5(10)-三烯-11-酮(14)的合成
将化合物13(1g，3mmol)溶解于乙酸乙酯(30ml)中，随后加入IBX(1.5g，6mmol)回流反应4h。停止反应后，将体系过滤，滤饼使用乙酸乙酯洗涤两次，滤液用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，再使用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水溶液各萃取一次，无水硫酸钠干燥。柱层析得白色固体14(0.65g，65％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.38(m，10H)，7.25(d，J＝8.7Hz，1H)，6.83(d，J＝8.7，1H)，6.70(s，1H)，5.04(s，2H)，4.55(s，2H)，3.73(t，J＝8.2Hz，1H)，3.47(d，J＝10.8Hz，1H)，2.84(m，2H)，2.68(d，J＝11.6Hz，1H)，2.47(d，J＝11.6Hz，1H)，0.83(s，3H).
实施例16：3，17β-二苄氧基-雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-羟基(15)的合成
化合物14(0.8g，2.4mmol)溶解于乙醇(10ml)中，冰浴条件下加入NaBH4(0.14g，4.8mmol)，冰浴下反应2h。停止反应后，加水稀释，浓缩溶剂。随后加入二氯甲烷复溶，萃取，合并有机相，再用饱和食盐水萃取一次，无水硫酸镁干燥。柱层析得白色固体15(0.6g，75％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.23-7.50(m，10H)，7.21(d，J＝8.5Hz，1H)，6.83(dd，J＝8.6，2.7Hz，1H)，6.76(d，J＝2.4Hz，1H)，5.04(s，2H)，4.71(m，1H)，4.61(d，J＝12.1Hz，1H)，4.57(d，J＝12.1Hz，1H)，3.49(dd，J＝8.6，7.6Hz，1H)，2.75-2.89(m，2H)，2.33-2.45(m，2H)，1.13(s，3H)，0.81-2.10(m，10H).
实施例17：3，17β-二苄氧基-雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-叔丁氧羰甲氧基(16)的制备
叔丁醇钾(1.42g，12.6mmol)用无水甲苯制成1M的悬液，在氮气保护下，向其中加入化合物15(2g，4.2mmol)，而后于70℃反应30分钟。再向反应瓶中缓慢滴加溴乙酸叔丁酯(1.26ml，8.6mmol)，70℃反应过夜。反应完毕，将反应液倾入水中，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得白色固体16(1.24g，50％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.48-7.30(m，11H)，6.84(dd，J＝8.6，2.9Hz，1H)，6.71(d，J＝2.8Hz，1H)，5.05(s，2H)，4.66-4.52(m，3H)，4.00(s，2H)，3.54-3.46(m，1H)，2.79(m，2H)，2.58(d，J＝10.5Hz，1H)，2.48(d，J＝10.5Hz，1H)，1.48(s，9H)，1.10(s，3H).
实施例18：雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-叔丁氧羰甲氧基-3，17β-二醇(17)的合成。
将化合物16(0.9g，1.67mmol)溶于乙醇，向其中加入10％的钯碳，置换氢气，室温下反应过夜。反应完毕后，将反应液铺硅藻土抽滤，收集滤液，浓缩，柱层析得白色固体17(0.56g，80％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.79(d，J＝8.6Hz，1H)，6.58(d，J＝2.8Hz，1H)，6.39(dd，J＝8.5，2.7Hz，1H)，4.40(s，2H)，3.93(s，1H)，3.67(d，J＝8.5Hz，1H)，3.03-2.78(m，2H)，2.50(dd，J＝13.1，2.1Hz，1H)，1.43(s，9H)，0.31(s，3H).
实施例19：雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-乙酸氧基-3，17β-二醇(18)的合成
将化合物17(0.13g，0.31mmol)溶于THF与水的混合溶剂中(THF∶H2O＝1∶1)，而后加入氢氧化锂(14.8mg，0.62mmol)室温下反应2小时。反应完毕后，体系置于冰浴条件下，1NHCl调pH至2，抽滤得白色粗品，直接下投。
实施例20：雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-((2S，4R)-1-((S)-2-胺戊酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺)羰甲氧基-3，17β-二醇(A01)的合成.
将化合物18(0.1g，0.288mmol)和HATU(0.14g，0.34mmol)溶解于无水DMF(3ml)中于室温下搅拌10min，随后加入化合物8a(0.14mg，0.288mmol)，搅拌20min后，将DIPEA(0.1ml，0.6mmol)缓慢加入，室温反应5h。停止反应后，将体系倒入水中，抽滤，水洗滤饼。滤饼干燥后柱层析得白色固体A01(0.02g，8.35％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.69(s，1H)，7.42-7.30(m，4H)，6.97(d，J＝8.3Hz，1H)，6.63(d，J＝7.8Hz，2H)，6.34(d，J＝9.1Hz，1H)，6.07(t，J＝5.8Hz，1H)，4.70(t，J＝8.1Hz，1H)，4.62-4.48(m，3H)，4.36(d，J＝5.3Hz，2H)，4.30(dd，J＝8.3，4.1Hz，2H)，4.11(d，J＝15.0Hz，2H)，3.69(d，J＝14.9Hz，2H)，3.58(dd，J＝11.5，3.3Hz，1H)，2.51(s，3H)，0.94(s，12H).HRMS(ESI)for C53H75N5O8S+H calcd942.5409，found 942.5417.
实施例21：雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-((2S，4R)-1-((S)-2-胺十一酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺)羰甲氧基-3，17β-二醇(A02)的合成
采用化合物A01的合成方法，以化合物18为原料，与侧链8b反应得到黄色固体A02(0.03g，50％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.69(s，1H)，7.42-7.30(m，4H)，6.97(d，J＝8.3Hz，1H)，6.63(d，J＝7.8Hz，2H)，6.34(d，J＝9.1Hz，1H)，6.07(t，J＝5.8Hz，1H)，4.70(t，J＝8.1Hz，1H)，4.62-4.48(m，3H)，4.36(d，J＝5.3Hz，2H)，4.30(dd，J＝8.3，4.1Hz，2H)，4.11(d，J＝15.0Hz，2H)，3.69(d，J＝14.9Hz，2H)，3.58(dd，J＝11.5，3.3Hz，1H)，2.51(s，3H)，0.94(s，12H).HRMS(ESI)for C53H75N5O8S+H calcd 942.5409，found 942.5417.
实施例22：雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A03)的合成
采用化合物A01的合成方法，以化合物18为原料，与侧链4a反应得到黄色固体A03(0.03g，50％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.56(s，1H)，8.44(s，1H)，7.37(dd，J＝8.5，7.1Hz，1H)，6.99(d，J＝7.0Hz，1H)，6.86(d，J＝8.4Hz，1H)，6.79(dd，J＝8.6，2.5Hz，1H)，6.64-6.51(m，2H)，6.37(d，J＝6.6Hz，1H)，5.86(q，J＝5.4Hz，1H)，4.81(dt，J＝16.0，7.1Hz，2H)，4.22-4.15(m，1H)，4.02(dd，J＝14.7，7.6Hz，2H)，3.28(p，J＝6.0Hz，2H)，3.22-3.09(m，3H)，2.93(dt，J＝13.5，6.7Hz，1H)，2.41-2.33(m，1H)，2.04(dt，J＝7.9，2.9Hz，1H)，0.95(s，3H)，0.79(q，J＝8.4，7.2Hz，2H).HRMS(ESI)for C36H42N4O8+H calcd659.3075，found 659.3076.
实施例23：雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙氧乙氧丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A04)的合成。
采用化合物A01的合成方法，以化合物18为原料，与侧链4b反应得到黄色固体A04(0.02g，45％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.11(s，1H)，9.05(d，J＝3.3Hz，1H)，7.51(dd，J＝8.5，7.1Hz，1H)，7.12(dd，J＝7.0，1.2Hz，1H)，7.00(dd，J＝8.6，4.9Hz，1H)，6.92(dd，J＝8.6，2.2Hz，1H)，6.67(ddd，J＝8.8，6.7，2.6Hz，1H)，6.61(d，J＝2.6Hz，1H)，6.54(q，J＝5.6Hz，1H)，6.30(d，J＝5.2Hz，1H)，4.95(ddt，J＝7.7，5.7，2.3Hz，1H)，4.87(dd，J＝9.2，7.1Hz，1H)，4.35-4.29(m，1H)，4.20-4.05(m，1H)，3.82-3.70(m，3H)，3.63(h，J＝3.4，2.8Hz，2H)，3.58-3.43(m，4H)，3.32(dt，J＝18.9，5.1Hz，4H)，2.93-2.71(m，5H)，2.46(d，J＝10.9Hz，1H)，2.32(qd，J＝9.2，8.8，4.9Hz，3H)，1.99-1.87(m，2H)，1.29(t，J＝7.2Hz，2H)，1.05(s，3H).
实施例24：雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙氧基二乙氧基丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A05)的合成
采用化合物A01的合成方法，以化合物18为原料，与侧链4c反应得到黄色固体A05(0.02g，40％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.64-8.48(m，1H)，7.55(t，J＝7.8Hz，1H)，7.20-7.12(m，1H)，7.03(d，J＝7.7Hz，1H)，6.88(dd，J＝8.5，1.9Hz，1H)，6.68(dd，J＝8.3，2.6Hz，1H)，6.66-6.56(m，1H)，6.18(s，1H)，6.07(t，J＝6.0Hz，1H)，5.05-4.96(m，1H)，4.91(t，J＝8.2Hz，1H)，3.76(d，J＝15.2Hz，1H)，3.24-3.06(m，4H)，3.01(s，1H)，2.93(m，2H)，2.51(d，J＝10.7Hz，1H)，2.33(t，J＝11.0Hz，2H)，2.20(d，J＝8.5Hz，1H)，2.02-1.71(m，10H)，1.62(dt，J＝13.6，5.8Hz，4H)，1.09(s，3H)，0.91(q，J＝8.3，7.0Hz，3H).HRMS(ESI)forC43H56N4O11+H calcd 805.4018，found 805.4017.
实施例44：性能测试
表2是以下性能测试所用到的试剂来源。
表2 试剂来源
表3是以下性能测试所用到的仪器来源。
表3 试剂来源
(一)、ERα受体亲和力测试
ERα受体亲和力实验是一种基于荧光偏振技术进行雌激素受体调节剂活性筛选的实验方法。本实验使用荧光标记的雌二醇作为荧光配基，与待测化合物对雌激素受体进行竞争性结合。偏振光的强度与物质受激发时分子转动的速度成反比。当样品与雌激素受体有较强的亲和力时，荧光标记雌二醇呈小分子游离状态，转动速度较快，偏振荧光就弱；当样品与受体亲和力较弱，荧光标记雌二醇与雌激素受体结合，形成大分子复合物，转动速度较慢，偏振荧光较强。
1、实验方法
按照试剂盒(ER Alpha Competitor Assay Kit，Green(A15882))的说明书分别将ERα核受体蛋白、探针(荧光标记的雌二醇)以及10mM样品DMSO溶液用ES2 ScreeningBuffer稀释到指定浓度，值得注意的是ERα核受体蛋白因不能反复冻融超过三次，需先将其按照10μL每管进行分装，然后置于-80℃冰箱储存，使用时再从冰箱里取出。依次用移液枪吸取5μL已经配置好的ERα核受体蛋白溶液、10μL 2X浓度待测物溶液以及5μL已经配置好的探针(荧光标记的雌二醇)于黑色的384孔板(Corning，NO.4514)中，以1μM的雌二醇作为亲和力100％的对照组，以同体积含有0.1％DMSO的Buffer作为空白对照。于室温下避光反应2h，7h内用SpectraMax Paradigm多功能酶标仪读取偏振值。
2、实验结果
表4为化合物的ERα亲和力实验结果。
表1 为化合物在1uM浓度下对ERα的亲和力
| 编号 | Inh％(1μM) |
| A01 | 41.46 |
| A02 | 28.83 |
| A03 | 111.77 |
| A04 | 53.41 |
| A05 | 14.68 |
| E2 | 100 |
| Fulvestrant | 97.10 |
(二)、Western Blot法检测ERα的水平
为了证明本发明化合物具有ERα降解作用，利用Western Blot方法，以Fulvestrant作为阳性对照，测试了化合物对ERα蛋白水平的下调作用。
1、实验方法
MCF-7细胞经化合物处理完毕后，弃去培养基，PBS洗涤2-3次，依次加入蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液，反复晃动培养板，使细胞与之充分接触，然后用刮子将细胞刮下。将所得的细胞悬液转移至离心管中，于冰上裂解30min，期间可用移液枪反复吹打，促进细胞裂解完全，然后进行离心(4℃，12,000g，10min)，上层液即为得到的总蛋白溶液。参照试剂盒的说明书，用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，然后按照蛋白溶液∶蛋白上样缓冲液＝4∶1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，并于沸水浴中煮沸15min，准备进行下一步的蛋白分离。将等量的上述蛋白溶液加入到凝胶上样孔中，准备进行电泳，其中浓缩胶的电压为75V，分离胶电压为120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止，进行转模。将目的蛋白的条带剥离出来，贴上PVDF膜，通过电泳，转移至PVDF膜上，后用5％脱脂牛奶于脱色摇床上封闭1h。加入一抗，4℃孵育过夜，而后用TBST洗涤三次，每次洗涤时间为5min。加入二抗，室温下孵育30min，而后用TBST洗涤三次，每次洗涤时间为5min。提前于暗室中按照ECLA∶ECLB＝1∶1的比例配置ECL混合溶液，然后将处理好的PVDF膜面朝上放在曝光匣中，加入配置好的ECL混合溶液反应1-2min后弃去反应液，根据显影试剂的发光强度调整曝光条件，开始曝光。扫描所得胶片，用Photoshop整理去色，Alpha软件分析光密度值。
2、实验结果
从图1能够看出，在100nM作用浓度下，对照品Fulvestrant仍具有良好的ERα抑制作用，而XHLXD系列化合物降解活性弱于对照品Fulvestrant。整体上，含有CRBN配体的化合物A01和A02降解活性弱于含有VHL配体的化合物，分析原因可能是由于A01和A02分子连接链为长烷烃结构，不含有聚乙二醇片段，因此，降解活性弱于含有聚乙二醇片段的化合物A04，与文献报道结果一致。在含有VHL配体的化合物A03～A05中，A04降解活性最佳，连接链的延长或缩短都会降低分子的降解活性，其中连接链不含O原子的化合物A05降解活性最差。
Claims (7)
1.一种具有通式(I)的靶向泛素化降解ERα的化合物：
其中，
D为D1时，L选自碳数为3的饱和烷基，或碳数为6-10的烷氧基；
D为D2时，L选自碳数为4或10的饱和烷基；
D选自D1或D2，其结构如下：
2.根据权利要求1所述的具有通式(I)的靶向泛素化降解ERα的化合物，为如下任一种：
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-((2S，4R)-1-((S)-2-胺戊酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺)羰甲氧基-3，17β-二醇(A01)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-((2S，4R)-1-((S)-2-胺十一酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-(4-(4甲基噻唑)-苄基-吡咯烷-2-甲酰胺)羰甲氧基-3，17β-二醇(A02)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A03)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙氧乙氧丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A04)
雌甾-1，3，5(10)-三烯-11β-(N-2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-4-胺丙氧基二乙氧基丙基异吲哚啉-1，3-二酮)羰甲氧基-3，17β-二醇(A05)
3.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的化合物。
4.如权利要求1所述的化合物的用途，其特征在于，用于：
(a)制备治疗与雌激素受体α(ERα)活性或表达量相关的疾病的药物；
(b)制备雌激素受体α(ERα)靶向抑制剂或降解剂；
(c)体外非治疗性地抑制或降解雌激素受体α(ERα)；
(d)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或
(e)治疗与雌激素受体α(ERα)活性或表达量相关的疾病。
5.一种抑制或降解雌激素受体α(ERα)的方法，其特征在于，包括步骤：对抑制对象施用抑制有效量的如权利要求所述的具有通式(I)的化合物。
6.一种治疗与雌激素受体α(ERα)活性或表达量相关的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：对治疗对象施用治疗有效量的如权利要求1所述的化合物。
7.一种体外抑制细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括：对抑制对象施用抑制有效量的如权利要求所述的化合物。
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| WO2014108452A1 (en) * | 2013-01-11 | 2014-07-17 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Proteolysis targeting chimeras (protacs) directed to the modulation of the estrogen receptor |
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