CN110627860A - 一类特异性去sumo化蛋白酶1抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一类特异性去sumo化蛋白酶1抑制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种式Ⅰ所示新的特异性去SUMO化蛋白酶1抑制剂及其制备方法和应用，通过抑制特异性去SUMO化蛋白酶1(SENP1)的活性，起到提高肿瘤细胞对照射的敏感性，有望成为新的肿瘤放疗增敏药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的小分子特异性去SUMO化蛋白酶1抑制剂，所述化合物的制备方法，所述化合物作为特异性去SUMO化蛋白酶1抑制剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
背景技术
下面关于与本发明相关的背景介绍用于帮助对本发明的理解，但不应被认为是本发明的已有技术。所有引用的出版物都被全文参考。
蛋白质的小泛素相关修饰因子(SUMO)化修饰是一种重要的动态可逆的翻译后修饰类型，其修饰的底物蛋白参与了调节转录因子活性、细胞周期调控、DNA损伤应答以及核质转运等诸多过程。特异性去SUMO化蛋白酶(SENPs)是细胞内催化相应底物去SUMO化修饰的关键蛋白酶，由于SUMO化与去SUMO化修饰广泛存在于多种肿瘤相关信号通路中，使得SENPs异常表达能够在不同层面显著影响肿瘤的发生和发展。不同的SENP在肿瘤发展中的作用有差异。作为研究最多的SENP家族成员，SENP1相关调控对生命发育的基本过程是至关重要的，研究表明SENP1基因敲除小鼠在胚胎期即死亡(J.Exp.Med.,2010,207: 1183-1195.)。一般认为高水平的SENP1促进肿瘤发展(上海交通大学学报(医学版),2018, 38:348-352.)，多项研究表明SENP1的去SUMO化修饰在影响肿瘤相关基因转录活性、加剧肿瘤细胞乏氧诱导事件和诱导肿瘤耐药性等活动中起重要作用。
放疗的本质是通过电离辐射对肿瘤细胞的DNA造成致死性损伤来抑制其增殖，达到抑制肿瘤生长的目的。然而肿瘤细胞中存在的DNA损伤应答机制能够不同程度地对照射造成的损伤进行修复，并形成放射抵抗性。该通路中存在着多种SUMO化修饰的底物蛋白，这些蛋白的SUMO化与去SUMO化修饰以不同的方式调控着细胞DNA损伤信号的识别和修复蛋白的招募(2017,CellRep.,21:546-558；EMBOJ.,2016,35:1312-1329；Nature,2009,462:935-939；Nature,2009,462:886-890.)。SENP1作为一种主要的催化去SUMO化反应的酶，其表达量的高低能够对DNA损伤应答和放射抵抗产生显著影响。有研究表明通过小干扰 RNA(SiRNA)沉默SENP1的表达后，显著改善了肺癌细胞A549和H460细胞对电离辐射抵抗性，并诱导了细胞周期阻滞、γ-H2AX表达增加和细胞凋亡(Exp.Ther.Med.,2013,6: 1054-1058)；已经被报道的ATR-SENP1-JAK2-STAT3介导的顺铂耐药机制同样表明了 SENP1参与了DNA损伤应答通路的激活。此外，乏氧是形成肿瘤放疗抵抗性的一个重要因素，已经有明确的证据表明HIF-1α通改变细胞能量代谢、促进血管生成、延长G1期阻滞和抗凋亡等途径增强肿瘤细胞放疗抵抗性(中国癌症防治杂志,2011,3:169-171.)，而乏氧肿瘤细胞中HIF-1α的核内降解直接受SENP1的去SUMO化调节。
我们的前期研究结果表明，SKOV3细胞受到照射后，其SENP1蛋白的表达呈现升高趋势，而且这种趋势具有照射剂量依赖性和时间依赖性。尽管SENP1在DNA损伤应答通路中的作用并没有得到很清楚的阐释，但上述证据表明SENP1在DNA损伤应答通路和乏氧引起的肿瘤放疗抵抗性形成中具有重要作用，提示着抑制SENP1活性有可能会对照射后细胞的DNA损伤修复通路产生影响，实现放射增敏效果。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的缺陷，提供一种新的特异性去SUMO化蛋白酶1抑制剂化合物的制备方法和应用，以解决现有技术中缺乏一种类似化合物的技术问题；
本发明要解决的另一技术问题是发明背景中所述化合物的使用范围较为局限；
本发明要解决的再一技术问题是现有的化合物不能有效抑制特异性去SUMO化蛋白酶 1活性；
本发明要解决的又一技术问题是提供所述化合物作为特异性去SUMO化蛋白酶1特异性去SUMO化蛋白酶1抑制剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种由式I表示的化合物：
其中：
b)R1独立地选取C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-CO(C1-C4烷基)、-CO(芳基)、-CO(杂芳基)、-CO(C3-C6环烷基)、-CO(C3-C6杂环烷基)、-SO2(C1-C4烷基)、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基、芳基、C1-C10烷基-芳基、杂芳基和C1-C10烷基-杂芳基的酯或酰胺；
c)R2独立地选取氢原子、C1-C10烷基酰基、芳基酰基和杂芳基酰基；
d)作为优选，R1独立地选取如下化学结构：
作为优选，R2独立地选取：氢原子、乙酰基；
作为优选，所述的化合物或其在药学上可用的盐，选自：
本发明提供了一种药物组合物，包含上述化合物或其药学上可用的盐，以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体，可包括稀释剂。
同时，本发明提供了上述化合物或其药学上可用的盐、上述药物组合物在制备特异性去 SUMO化蛋白酶1抑制剂药物的应用。
作为优选，上述化合物或其药学上可用的盐、上述药物组合物是针对肿瘤放射增敏的药物。
同时，本发明提供了上述化合物的制备方法，包括以下两种方法。
方法一包括如下步骤：
1)取化合物A，在极性非质子溶剂中与溴乙酸甲酯和碱反应，得化合物B；
2)将化合物B在甲醇溶剂中与相应的胺反应，得到化合物C；
3)取化合物A，在极性非质子溶剂中与1,2-二溴乙烷和碱反应，得化合物D；
4)将化合物D在极性非质子溶剂中与相应的胺和碱反应，得化合物E；
5)取化合物A，在吡啶中与乙酸酐反应，得化合物F；
6)将化合物F在非极性溶剂中与草酰氯反应，随后与相应的胺盐和有机碱反应,可得化合物G1、化合物G2、化合物G3；
7)将化合物G1、化合物G2、化合物G3三者任一种，在四氢呋喃/甲醇混合溶液中与氢氧化钠溶液反应得到化合物I；
其中，化合物结构如下：
方法二包括以下步骤：
1)取化合物A，在极性非质子溶剂中与溴乙酸甲酯和碱反应，得化合物B；
2)化合物B在甲醇溶剂中与相应的胺反应，得到化合物C；
3)化合物A，在极性非质子溶剂中与1,2-二溴乙烷和碱反应，得化合物D；
4)化合物D在极性非质子溶剂中与相应的胺和碱反应，得化合物E；
5)化合物A，在吡啶中与乙酸酐反应，得化合物F；
6)化合物F在非极性溶剂中与草酰氯反应，随后与相应的胺盐和有机碱反应，得化合物 G1；
7)将步骤6)所得化合物G1在甲醇中相应的胺反应，得到化合物H；
8)将化合物H在四氢呋喃/甲醇混合溶液中与氢氧化钠溶液反应得到化合物I；
作为优选，方法一和方法二中的步骤1)、步骤3)和步骤4)所述反应的极性非质子溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、甲基乙基酮；更优的，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
作为优选，方法一和方法二中的步骤2)以及方法二中的步骤7)所述的反应是在加热或室温条件下进行的。
作为优选，方法一和方法二中的步骤1)、步骤3)和步骤4)中所述的碱为碳酸钾。
作为优选，方法一和方法二中的步骤6)所述非极性溶剂为二氯甲烷，苯，四氯化碳，己烷、异辛烷、甲苯；更优的，所述溶剂为二氯甲烷。
作为优选，方法一和方法二中的步骤6)中所述有机碱为三乙胺、N,N-二异丙基乙胺。
作为优选，方法一中的步骤7)和方法二中的步骤8)所述的四氢呋喃/甲醇混合溶液的体积比为3:2。
作为优选，方法一中的步骤7)和方法二中的步骤8)所述的氢氧化钠水溶液浓度为4N。
熊果酸即化合物A在N,N-二甲基甲酰胺中与溴乙酸甲酯反应得到化合物B，化合物B 与相应的胺在甲醇中回流反应，得到化合物C。化合物A在碳酸钾的作用下在N,N-二甲基甲酰胺中与1,2-二溴乙烷反应，得到中间体D，D在碱的作用下与相应的胺连接得到化合物E。化合物A在吡啶中与乙酸酐反应得到羟基保护的中间体F，F在二氯甲烷中与草酰氯反应，随后与相应的胺盐在三乙胺作用下得酰胺化合物G1-G3，化合物G1与相应的胺在甲醇中回流反应，得到化合物H。化合物G1、G2、G3和H最后在四氢呋喃/甲醇混合溶液中与 4N氢氧化钠溶液反应脱除乙酰基得到化合物I。该制备方法的反应流程如以上反应式所示。
以上技术方案的相关技术术语，除非特殊解释，否则将遵循下面的定义。
术语“烷基”指具有指定碳原子数的直链或支链烃基，因此例如，在此使用的术语“C1-C4烷基”和“C1-C10烷基”是指分别具有至少1个且至多4个或10个碳原子的烷基。本发明中所使用的此类支链或直链烷基的实例包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、正丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基，和正癸基。和后面五个正烷烃的的支链类似物。
当使用术语“烯基”(或“亚烯基”)时，其指的是含有指定数目碳原子和至少1个至多 5个碳-碳双键的直链或支链烃链。实例包括乙烯基(或亚乙烯基)和丙烯基(或亚丙烯基)。
当使用术语“炔基”(或“亚炔基”)时，其指的是含有指定数目碳原子和至少1个至多 5个碳-碳叁键的直链或支链烃链。实例包括乙炔基(或亚乙炔基)和丙炔基(或亚丙炔基)。
当使用术语“环烷基”时，其指的是含有指定数目碳原子的非芳香的、饱和的、环状的烃环。因此，例如，术语“C3-C8环烷基”是指具有3-8个碳原子的非芳香的环状的烃环。在本发明中所用的示例性的“C3-C8环烷基”基团包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
当使用术语“C5-C8环烯基”是指具有指定书目碳原子和至多3个碳-碳双键的非芳香的单环碳环。示例性的“环烯基”包括环戊烯基和环己烯基。
当使用术语“C3-C8杂环烷基”时，其是指含有指定数目环原子的非芳香杂环，其为饱和的或具有一个或多个不饱和度，且含有一个或多个选自O、S或N的杂原子。此类环可任选稠合至一个或多个其它“杂环”或环烷基上。“杂环”基团的实例包括，但不限于，氮杂环丙烷、硫杂环丙烷、氧杂环丙烷、氮杂环丁烷、硫杂环丁烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、吡喃、1，4-二恶烷，1，4-二噻烷、1，3-二恶烷、1，3-二氧戊环、哌啶、哌嗪、2，4-哌嗪二酮、吡咯烷、2-咪唑啉、咪唑烷、吡唑烷、吡唑啉、吗啉、硫代吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩等。
术语“芳基”指含有5-14个环原子，至少一个环拥有共轭π电子体系的芳香基团，包括有全碳原子的芳环、芳杂环和并芳环或联芳环，并可带有取代基。芳基可以带有1-6个取代基。杂芳环或芳杂环是指含有5-14个环上原子的基团，其中1-4个杂原子为芳香环上原子，其余环上原子为碳原子。合适的杂原子有氧、硫、氮、和硒原子。合适的芳杂环有呋喃、噻吩、吡啶、吡咯啶、氮上带有低碳数烷基取代基的吡咯烷、吡啶氮氧化物、嘧啶、吡嗪、咪唑及其他类似杂环，并均可带有取代基。
术语“随意取代”或“取代”指基团带有1-4个不同的取代基，可以分别是低碳数烷基、低碳数芳基、低碳数芳烷基、低碳数环状烷基、低碳数杂环烷基、羟基、低碳数烷氧基、低碳数芳氧基、多卤代烷氧基、芳烷氧基、低碳数杂芳基、低碳数杂芳环氧基、低碳数杂芳烷基、低碳数杂芳烷氧基、叠氮基、氨基、卤素、低碳数烷巯基、氧基、低碳数酰烷基、低碳数羧酸酯基、羧酸、酰胺基、硝基、低碳数酰氧基、低碳数胺烷基、低碳数烷胺芳基、低碳数烷芳基、低碳数烷胺烷基、低碳数烷氧芳基、低碳数芳胺基、低碳数芳烷胺基、磺酰基、低碳数酰胺烷芳基、低碳数酰胺芳基、低碳数羟烷基、低碳数卤代烷基、低碳数烷胺烷酸基、低碳数脲烷基、氰基、低碳数烷氧烷基、低碳数多卤代烷基、低碳数芳烷氧烷基。
“取代芳基”和“取代杂芳基”指芳环或者杂芳环基团上带有1-6个取代基。这些取代基可以是低碳数烷基、低碳数烷氧基、低碳数多卤代烷基、卤素、羟基和氨基。
附图说明
图1：化合物抑制SENP1活性的免疫沉淀实验结果图；
图2：0Gy下化合物克隆形成实验结果图；
图3：2Gy下化合物克隆形成实验结果图；
图4：4Gy下化合物克隆形成实验结果图；
图5：6Gy下化合物克隆形成实验结果图；
图6：8Gy下化合物克隆形成实验结果图；
图7受试化合物的存活分数-照射剂量曲线。
具体实施方式
本发明中的化合物及制备可以通过下面的实例更好地说明。这些实例不应被解读为本发明的局限，现在已知的或将来开发的这些化合物的变化体也应被认为属于本发明的范畴并申请保护。
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在一下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(±10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的是可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1熊果酰氧基乙酸甲酯(2)
将5.23g熊果酸(1，11.45mmol,1eq)溶于30mL DMF中，加入1.91g无水K2CO3(13.74mmol,1.2eq)，室温下搅拌，称取1.99g溴乙甲酸甲酯，滴加入体系，反应过夜。反应完全后将反应液倒入200mL蒸馏水中，析出大量不溶物，过滤，干燥后得到粗品，粗品经硅胶柱分离后得到2的白色固体粉末5.21g，产率86.1％。熔点：173.3-174.9℃；ESI-MS m/z529.35[M+H]+,551.19[M+Na]+,527.07[M-H]-；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.25(t,J＝ 3.5Hz,1H),4.54(dd,J1＝32.0Hz,J2＝15.6Hz,2H),3.73(s,3H),3.21(dd,J1＝10.8Hz,J2＝4.8Hz,1H),2.25(d,J＝11.2Hz,1H),2.04(td,J1＝13.2Hz,J2＝4.4Hz,1H),1.90(dd,J1＝8.8 Hz,J2＝3.5Hz,2H),1.78(m,3H),1.71(d,J＝4.0Hz,1H),1.64(m,3H),1.49(m,6H),1.32(m, 4H),1.11(m,1H),1.08(s,3H),1.04(m,1H),0.99(s,3H),0.94(d,J＝6.1Hz,3H),0.91(s,3H), 0.86(d,J＝6.4Hz,3H),0.78(s,3H),0.74(s,33H),0.72(d,J＝14.0Hz,1H).
实施例2 N-甲基熊果酰氧基乙酰胺(3)
将0.3g(0.567mmol,1eq)2溶于15mL甲醇溶液中，室温下搅拌。将10mL 33％甲胺的甲醇溶液滴加入体系，随着反应的进行体系逐渐变浑浊。TLC监测反应(PE:EA＝2:1)，待反应完全后将反应液过滤，滤饼用甲醇再洗一遍，干燥后得到3的白色粉末0.23g，产率76.8％。熔点：246.0-247.1℃；ESI-MS m/z 550.46[M+Na]+,526.44[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd for C33H53NO4527.3975；found 528.4036[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.28(s,1H),5.26(t,J＝3.2Hz,1H),4.78(d,J＝15.7Hz,1H),4.24(d,J＝15.7Hz,1H),3.20(dd,J1＝ 11.3Hz,J2＝4.4Hz,1H),2.86(d,J＝4.8Hz,3H),2.22(d,J＝11.1Hz,1H),2.01(m,2H),1.86 (ddd,J1＝18.6Hz,J2＝11.3Hz,J3＝2.8Hz,1H),1.71(m,3H),1.61(m,5H),1.52(m,3H),1.45 (m,1H),1.34(m,4H),1.12(m,,1H),1.09(s,3H),1.03(m,1H),0.97(s,3H),0.95(d,J＝6.0Hz, 3H),0.88(s,3H),0.87(d,J＝6.6Hz,3H),0.76(s,3H),0.70(d,J＝10.8Hz,1H),0.67(s,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ175.97,168.21,140.23,125.13,79.02,77.48,77.16,76.84,62.88, 55.25,52.99,48.48,47.47,42.35,39.55,39.24,38.93,38.84,38.62,37.03,36.81,32.91,30.58, 28.22,27.84,27.23,26.01,24.51,23.76,23.29,21.24,18.32,17.13,17.01,15.73,15.49.
实施例3 N-羟乙基熊果酰氧基乙酰胺(4)
将0.3g(0.567mmol,1eq)2和0.18gN-甲基乙醇胺(2.84mmol,5eq)溶于25mL甲醇溶液中，加热回流约24h。反应完全后减压蒸除溶剂，残余物用20mL蒸馏水和20mL EA 萃取，有机层用饱和食盐水洗两遍，无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后得4的白色固体粉末0.23g，产率72.7％。熔点：121.5-123.3℃；ESI-MS m/z 556.27[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd forC34H55NO5557.4080；found 558.4153[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.66(t,J＝5.2Hz,1H),5.29(t,J＝3.3Hz,1H),4.71(d,J＝15.8Hz,1H),4.33(d,J＝15.8Hz,1H),3.75(t, J＝5.0Hz,2H),3.53(ddd,J1＝15.6Hz,J2＝10.6Hz,J3＝5.2Hz,1H),3.41(ddd,J1＝15.6Hz,J2＝10.6Hz,J3＝5.2Hz,1H),3.20(dd,J1＝11.4Hz,J2＝4.4Hz,1H),2.22(d,J＝11.1Hz,1H),2.06(m,2H),1.90(m,3H),1.73(m,3H),1.63(m,4H),1.51(m,4H),1.34(m,5H),1.12(m,1H),1.09(s,3H),1.03(m,1H),0.97(s,3H),0.95(d,J＝6.1Hz,3H),0.89(s,3H),0.86(d,J＝6.4Hz, 3H),0.77(s,3H),0.70(d,J＝11.6Hz,1H),0.69(s,3H).
实施例4 N-甲基-N-羟乙基熊果酰氧基乙酰胺(5)
将0.3g(0.567mmol,1eq)2和0.21gN-甲基乙醇胺(2.84mmol,5eq)溶于25mL甲醇溶液中，加热回流约48h。反应完全后减压蒸除溶剂，向残余物中加入10mL甲醇打浆，过滤，滤饼再用甲醇洗一遍，得到5的白色粉末0.18g，产率55.5％。熔点：202.8-204.2℃； ESI-MSm/z 572.54[M+H]+,594.28[M+Na]+；TOF-HRMS m/z:calcd for C35H57NO5571.4237； found572.4290[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.22(m,1H),4.75and 4.64(dd,J＝28.4,14.2Hz,2H),3.75(m,2H),3.52and 3.39(t,J＝4.8Hz,1H),3.20(dd,J1＝10.8Hz,J2＝4.7Hz, 1H),3.04and 2.94(s,3H),2.25(d,J＝11.2Hz,1H),2.03(m,1H),1.89(m,2H),1.76(m,4H), 1.61(m,3H),1.48(m,5H),1.33(m,4H),1.08(m,4H),1.01(m,1H),0.97(m,4H),0.92(d,J＝ 6.2Hz,3H),0.90(s,3H),0.84(d,J＝6.4Hz,3H),0.76(s,3H),0.73(d,J＝4.4Hz,3H),0.70(d, J＝11.6Hz,1H).
实施例5熊果酸-(2-溴乙基)酯(6)
将5.23g 1(11.45mmol,1eq)溶于50mL的DMF中，加入3.16g无水K2CO3(22.90 mmol,2eq)和0.95g无水KI(5.73mmol,0.5eq)，室温下搅拌。称取8.60g 1,2-二溴乙烷(45.80mmol,4eq)，滴加入体系，体系逐渐变为棕黄色。TLC监测反应完全后，将反应液用水和EA萃取，EA层用无水MgSO4干燥。减压蒸干溶剂后的残余物硅胶柱分离(PE:EA (V:V)＝15:1→8:1)，得到6的白色泡沫状固体4.80g，产率74.4％。熔点：94.8-96.2℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.26(t,J＝3.3Hz,1H),4.30(t,J＝6.0Hz,2H),3.48(t,J＝6.0Hz,2H),3.21(dd,J1＝10.8,J2＝4.8Hz,,1H),2.23(d,J＝11.2Hz,1H),2.01(td,J＝13.1,4.3Hz,1H), 1.90(dd,J1＝8.8,J2＝3.4Hz,2H),1.78(td,J1＝13.6,J2＝4.4Hz,1H),1.70(m,2H),1.61(m, 4H),1.47(m,6H),1.32(m,6H),1.09(m,1H),1.07(s,3H),1.01(m,2H),0.98(s,3H),0.94(d,J ＝6.0Hz,3H),0.91(s,3H),0.85(d,J＝6.4Hz,3H),0.77(s,3H),0.75(s,3H),0.71(d,J＝11.2 Hz,1H)。
实施例6 O-2-(N-羟乙基哌嗪-1-基)乙基熊果酸酯(7)
将0.5g 6(0.89mmol,1eq)溶于5mL DMF中，加入0.24g无水K2CO3(1.78mmol,2 eq)，升温至80℃，搅拌0.5h。随后将0.23gN-哌嗪乙醇(1.78mmol,2eq)，加入体系中。 TLC监测反应(PE:EA＝1:1)。反应完全后，将反应液倒入100mL蒸馏水中，搅拌0.5h，过滤，干燥后得到7的白色固体粉末，产率84.1％。熔点：177.3-178.1℃；ESI-MS m/z 613.63 [M+H]+；TOF-HRMS m/z:calcd for C38H64N2O4612.4866；found 613.4904[M+H]+；1H NMR (400MHz,CDCl3)δ5.22(t,J＝3.4Hz,1H),4.13(t,J＝5.9Hz,2H),3.68(t,J＝5.9Hz,2H), 3.20(dd,J1＝10.8Hz,J2＝4.8Hz,1H),2.87(brs,2H),2.77–2.49(m,12H),2.20(d,J＝11.2Hz, 1H),1.99(td,J1＝13.2Hz,J2＝4.1Hz,1H),1.89(m,2H),1.76(td,J1＝13.6Hz,J2＝4.3Hz,1H),1.70–1.40(m,11H),1.33(m,4H),1.07(s,3H),1.03(m,1H),0.99(m,4H),0.93(d,J＝5.8Hz,3H),0.91(s,3H),0.85(d,J＝6.4Hz,3H),0.77(s,3H),0.74(s,3H),0.69(d,J＝12.0Hz,1H).
实施例7 O-2-(2-氧代哌嗪-4-基)乙基熊果酸酯(8)
按照与实施例6，方法一和方法二中的步骤4中相同方法，在实施例5中所获得的中间体6与2-氧代哌嗪酮按照相同方法得到化合物8的白色固体粉末，产率70.3％。熔点：208.2-209.9℃；ESI-MS m/z 583.39[M+H]+,605.41[M+Na]+,581.47[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd for C36H58N2O4582.4397；found 583.4462[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.07(s,1H),5.24(t,J＝3.4Hz,1H),4.14(m,2H),3.35(m,2H),3.20(m,3H),2.71(m,4H),2.21(d,J＝ 11.0Hz,1H),2.00(td,J1＝13.3Hz,J2＝4.2Hz,1H),1.90(m,2H),1.76(td,J1＝13.6Hz,J2＝ 4.3Hz,1H),1.56(m,13H),1.33(m,5H),1.07(m,4H),1.00(m,1H),0.98(s,3H),0.94(d,J＝ 5.9Hz,3H),0.91(s,3H),0.85(d,J＝6.3Hz,3H),0.77(s,3H),0.74(s,3H),0.70(d,J＝12.0Hz, 1H)。
实施例8 O-2-[N-(3-三氟甲基苯基)哌嗪-1-基]乙基熊果酸酯(9)
按照与实施例6，方法一和方法二中的步骤4中相同方法，在实施例5中所获得的中间体6与N-(3-三氟甲基苯基)哌嗪按照相同方法得到化合物9的白色固体粉末，产率74.7％。熔点：101.4-102.9℃；ESI-MS m/z 713.11[M+H]+；TOF-HRMS m/z:calcd forC43H63F3N2O3 712.4791；found 713.4857[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.42(m,1H),7.15(m,3H), 5.15(t,J＝3.4Hz,1H),4.29(d,J＝5.1Hz,1H),4.18(m,1H),4.06(t,J＝5.2Hz,1H),3.53(m, 1H),3.21(m,4H),3.17–2.78(m,2H),2.59(m,1H),2.15(m,1H),1.99(m,1H),1.90–1.65(m, 3H),1.65–1.13(m,14H),1.02(m,4H),0.92(s,3H),0.88(m,4H),0.85–0.77(m,6H),0.70(s, 3H),0.66(m,4H)；19F NMR(376MHz,DMSO)δ-61.09。
实施例9 O-(S)-2-(2-甲氧羰基四氢吡咯-1-基)乙基熊果酸酯(10)
按照与实施例6，方法一和方法二中的步骤4中相同方法，在实施例5中所获得的中间体6与脯氨酸甲酯盐酸盐按照相同方法得到化合物10，经硅胶柱分离,(PE:EA(V:V)＝10:1→6:1)，得到白色固体粉末，产率52.7％。熔点：78.7-79.2℃；ESI-MS m/z 612.51[M+H]+； TOF-HRMS m/z:calcd for C38H61NO5 611.4550；found 612.4603[M+H]+；1H NMR(400MHz, CDCl3)δ5.23(t,J＝3.4Hz,1H),4.19(s,2H),3.73(s,3H),3.37(s,1H),3.21(m,2H),3.02(s, 1H),2.79(s,1H),2.56(s,1H),2.20(d,J＝11.3Hz,2H),1.94(m,6H),1.75(td,J1＝13.6Hz,J2＝ 4.4Hz,1H),1.56(m,10H),1.31(m,5H),1.07(s,3H),1.03(m,1H),1.00(m,4H),0.93(d,J＝ 5.9Hz,3H),0.91(s,3H),0.85(d,J＝6.4Hz,3H),0.77(s,3H),0.73(s,3H),0.71(d,J＝11.5Hz, 1H)
实施例10 3-乙酰氧基熊果酸(11)
将10g 1(21.90mmol,1eq)溶于150mL干燥吡啶中，加入0.26gN,N-二甲氨基吡啶(2.10mmol,0.1eq)，室温下搅拌，滴加入8.94g乙酸酐(87.58mmol,4eq)，反应过夜。反应完全后减压蒸除吡啶，残余物用150mL水和200mL二氯甲烷萃取，二氯甲烷层再用 1N盐酸溶液洗一遍，无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后，向残余物中加入100mL甲醇，继续搅拌0.5h，过滤得到11的白色固体8.91g，产率81.6％。熔点：279.8-281.9℃；ESI-MS m/z 497.53[M-H]-；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.94(s,1H),5.14(s,1H),4.41(dd,J1＝ 10.8Hz,J2＝4.4Hz,1H),2.12(d,J＝11.2Hz,1H),2.01(s,3H),1.99–1.90(m,1H),1.89–1.74 (m,3H),1.68–1.41(m,10H),1.39–1.22(m,4H),1.06(s,3H),1.01(d,J＝13.2Hz,2H),0.92 (s,6H),0.84(m,10H),0.76(s,3H)。
实施例11 N-甲氧羰甲基-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(12)
将4.00g 11(8.01mmol,1eq)溶于60mL CH2Cl2中，冰浴下搅拌0.5h，称取3.05g 草酰氯(24.03mmol,3eq)滴加入体系，滴完后撤除冰浴，室温下反应过夜。减压蒸除溶剂，向残余物中加入25mL CH2Cl2，再蒸一遍，最后用40mL CH2Cl2溶解残余物，室温下搅拌。称取1.36g甘氨酸甲酯盐酸盐(9.62mmol,1.2eq)和2.43g TEA(24.06mmol,3eq)溶于 30mLCH2Cl2中，滴加入体系。反应完全后，将反应液依次用50mL蒸馏水和饱和食盐水洗，有机层用无水MgSO4干燥。减压蒸干溶剂得到12的粗品4.89g。粗品用15mL甲醇重结晶，得到12的白色粉末3.84g，产率82.0％。熔点：115.9-117.8℃；ESI-MS m/z 570.27[M+H]+, 592.49[M+Na]+,568.34[M-H]-；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.52(s,1H),5.40(t,J＝3.2Hz, 1H),4.49(dd,J1＝10.2Hz,J2＝4.0Hz,1H),4.10(d,J＝18.8Hz,1H),3.83(d,J＝18.8Hz,1H), 3.76(s,3H),2.04(s,3H),1.98(m,3H),1.86(d,J＝13.2Hz,1H),1.73(d,J＝13.2Hz,1H),1.60 (m,4H),1.48(m,6H),1.31(m,5H),1.09(s,3H),1.03(m,2H),0.95(s,3H),0.93(s,3H),0.89(d, J＝6.0Hz,3H),0.85(s,6H),0.83(d,J＝11.2Hz,1H),0.71(s,3H).
实施例12 N-甲氧羰甲基-N-甲基-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(13)
称取5.00g 11(10.04mmol,1eq)，按照与实施例11，方法一和方法二中的步骤6中相同方法，与草酰氯反应得到酰氯中间体。称取1.68g肌氨酸甲酯盐酸盐(12.05mmol,1.2eq) 和3.04g TEA(30.12mmol,3eq)溶于30mL CH2Cl2中，滴加入体系。反应完全后，将反应液依次用50mL蒸馏水和饱和食盐水洗，有机层用无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后，残余物用硅胶柱分离(PE:EA(V:V)＝30:1→15:1)，得13的白色粉末3.64g，产率62.34％。熔点：67.4-69.7℃；ESI-MS m/z 584.37[M+H]+,606.46[M+Na]+；TOF-HRMS m/z:calcd forC36H57NO5583.4237；found 584.4282[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.21(t,J＝3.5Hz,1H),4.49(dd,J1＝10.0Hz,J2＝6.0Hz,1H),3.69(s,3H),3.21(s,3H),2.46(d,J＝11.2Hz,1H), 2.17(m,1H),2.04(s,3H),1.88(m,3H),1.61(m,5H),1.50(m,4H),1.42(m,1H),1.30(m,6H), 1.12(m,4H),1.02(m,1H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H),0.93(s,3H),0.87(d,J＝4.0Hz,3H),0.85 (m,8H),0.81(d,J＝11.6Hz,1H),0.72(s,3H)
实施例13 N-(2-甲氧羰基乙基)-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(14)
称取5.00g 11(10.04mmol,1eq)，按照与实施例11，方法一和方法二中的步骤6中相同方法，与草酰氯反应得到酰氯中间体。称取1.68gβ-丙氨酸甲酯盐酸盐(12.05mmol,1.2eq) 和3.04g TEA(30.12mmol,3eq)溶于30mL CH2Cl2中，滴加入体系。反应完全后，将反应液依次用50mL蒸馏水和饱和食盐水洗，有机层用无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后，残余物用20mL甲醇重结晶，得14的白色粉末3.89g，产率66.63％。熔点：187.0-188.1℃； ESI-MSm/z 584.44[M+H]+,606.53[M+Na]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.42(t,J＝6.0Hz, 1H),5.29(t,J＝3.2Hz,1H),4.49(dd,J1＝10.0Hz,J2＝6.0Hz,1H),3.70(s,3H),3.54(m,1H), 3.38(m,1H),2.49(t,J＝6.0Hz,2H),2.04(s,3H),1.95(m,3H),1.82(m,2H),1.72(dd,J1＝13.6Hz,J2＝2.0Hz,1H),1.63(m,5H),1.46(m,6H),1.28(m,3H),1.05(m,5H),0.94(s,6H),0.87(d, J＝5.8Hz,3H),0.86(s,3H),0.85(s,3H),0.82(d,J＝11.5Hz,1H),0.75(s,3H).
实施例14 N-((S)-2-甲氧羰基四氢吡咯烷-1-基)-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(15)
称取5.00g 11(10.04mmol,1eq)，按照与实施例11，方法一和方法二中的步骤6中相同方法，与草酰氯反应得到酰氯中间体。称取1.66g脯氨酸甲酯盐酸盐(12.05mmol,1.2eq) 和3.04g TEA(30.12mmol,3eq)溶于30mL CH2Cl2中，滴加入体系。反应完全后，将反应液依次用50mL蒸馏水和饱和食盐水洗，有机层用无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后，残余物用20mL甲醇重结晶，得15的白色粉末4.12g，产率67.55％。熔点：286.5-287.1℃； ESI-MSm/z 610.45[M+H]+,632.92[M+Na]+；TOF-HRMS m/z:calcd for C38H59NO5609.4393； found610.4446[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.23(t,J＝3.2Hz,1H),4.50(m,1H), 4.43(d,J＝6.8Hz,1H),3.88(t,J＝8.5Hz,1H),3.68(s,3H),3.49(m,1H),2.48(d,J＝11.0Hz, 1H),2.14(m,1H),2.05(s,3H),1.97(m,2H),1.87(m,5H),1.63(m,5H),1.50(m,5H),1.36(m,2H),1.29(m,2H),1.07(m,6H),0.94(d,J＝4.5Hz,3H),0.93(s,3H),0.87(d,J＝7.7Hz,3H),0.86(s,3H),0.85(s,3H),0.81(d,J＝11.6Hz,1H),0.74(s,3H).
实施例15 N-(甲胺酰基)甲基-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(16)
将0.3g(0.526mmol,1eq)12溶于15mL甲醇溶液中，室温下搅拌。将10mL 33％甲胺的甲醇溶液滴加入体系，约30min后体系中有大量不溶物析出，待反应完全后将反应液过滤，滤饼用甲醇再洗一遍，干燥后得到16的白色粉末0.20g，产率72.2％。熔点： 140.1-143.4℃；ESI-MS m/z 569.39[M+H]+,591.23[M+Na]+,559.35[M-H]-；TOF-HRMS m/z: calcdfor C35H56N2O4568.4240；found 569.4194[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.92(s, 1H),5.41(t,J＝3.2Hz,1H),3.98(d,J＝14.2Hz,1H),3.79(d,J＝15.6Hz,1H),3.52(brs,1H),3.21(dd,J1＝11.2Hz,J2＝4.4Hz,1H),2.81(s,3H),2.01(m,4H),1.82(m,1H),1.70(m,1H),1.51(m,6H),1.32(m,3H),1.09(s,3H),1.04(m,1H),0.99(m,1H),0.98(s,3H),0.95(s,3H),0.90(s,3H),0.87(d,J＝6.4Hz,3H),0.77(s,3H),0.71(d,J＝11.2Hz,1H),0.69(s,3H).
实施例16 N-(甲胺酰基)甲基-N-甲基-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(17)
按照与实施例15，方法二中的步骤7中相同方法，在实施例12中所获得的中间体13与33％甲胺的甲醇溶液按照相同方法得化合物17的白色粉末0.26g，产率76.5％。熔点：99.9-102.5℃；ESI-MS m/z 583.50[M+H]+,605.51[M+Na]+；TOF-HRMS m/z:calcd forC36H58N2O4582.4397；found 583.4448[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.21(t,J＝3.5Hz,1H),4.49(dd,J1＝10.0Hz,J2＝6.0Hz,1H),3.69(s,3H),3.21(s,3H),2.46(d,J＝11.2Hz,1H), 2.17(m,1H),2.04(s,3H),1.88(m,3H),1.61(m,5H),1.50(m,4H),1.42(m,1H),1.30(m,6H), 1.12(m,4H),1.02(m,1H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H),0.93(s,3H),0.87(d,J＝4.0Hz,3H),0.85 (m,8H),0.81(d,J＝11.6Hz,1H),0.72(s,3H).
实施例17 N-(2-甲胺酰基)乙基-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(18)
按照与实施例15，方法二中的步骤7中相同方法，在实施例13中所获得的中间体14与33％甲胺的甲醇溶液按照相同方法得化合物18的白色固体粉末0.23g，产率70.1％。熔点：129.8-131.0℃；ESI-MS m/z 583.50[M+H]+,605.55[M+Na]+；TOF-HRMS m/z:calcd forC36H58N2O4582.4397；found 583.4448[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.51(t,J＝5.2Hz,1H),5.89(s,1H),5.32(s,1H),4.49(dd,J1＝10.0Hz,J2＝6.0Hz,1H),3.55(td,J1＝12.0Hz,J2＝6.0Hz,1H),3.38(td,J1＝12.0Hz,J2＝6.0Hz,1H),2.80(d,J＝4.6Hz,3H),2.50–2.23(m, 2H),2.04(s,3H),2.00–1.84(m,4H),1.80(d,J＝12.8Hz,1H),1.67(m,4H),1.53(m,3H),1.45 –1.35(m,3H),1.29(m,3H),1.08(s,3H),1.05(m,2H),0.95(m,7H),0.86(m,9H),0.79(d,J＝ 12.6Hz,1H),0.76(s,3H).
实施例18 N-(2-溴乙基)熊果酸酰胺(19)
称取4.00g 11(8.01mmol,1eq)，按照与实施例11，方法一和方法二中的步骤6中相同方法，与草酰氯反应得到酰氯中间体。称取2.00g溴乙胺氢溴酸盐(9.62mmol,1.2eq) 和2.43g TEA(24.06mmol,3eq)溶于30mL CH2Cl2中，滴加入体系。反应完全后，将反应液依次用50mL蒸馏水和饱和食盐水洗，有机层用无水MgSO4干燥。减压蒸干溶剂得到 19的白色粉末4.64g，产率95.7％。熔点：196.9-198.4℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.21 (t,J＝3.2Hz,1H),4.48(dd,J1＝9.4Hz,J2＝6.5Hz,1H),4.11(t,J＝9.4Hz,2H),3.76(t,J＝9.4 Hz,2H),2.19(d,J＝11.2Hz,1H),2.03(m,4H),1.90(m,3H),1.62(m,6H),1.49(m,5H),1.35 (m,4H),1.06(s,3H),1.04(m,1H),1.01(m,1H),0.93(d,J＝2.5Hz,6H),0.85(m,9H),0.79(d, J＝9.4Hz,1H),0.77(s,3H).
实施例19 N-((S)-1-苯基乙基)-3-乙酰氧基熊果酸酰胺(20)
称取2.76g 11(5.53mmol,1eq)，按照与实施例11，方法一和方法二中的步骤6中相同方法，与草酰氯反应得到酰氯中间体。称取1.12g TEA(11.06mmol,2eq)和0.67g(S)-(-)-α- 甲基苄胺，溶于30mL CH2Cl2中，滴加入体系，室温下继续反应约4h。反应完全后，将反应液依次用蒸馏水、1N稀盐酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗，有机层用无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后，残余物用10mL甲醇重结晶，干燥后得到20的白色固体2.53g，产率 76.0％。熔点：227.8-228.1℃；ESI-MS m/z 602.33[M+H]+,624.45[M+Na]+；TOF-HRMS m/z: calcd forC40H59NO3601.4495；found 602.4547[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37– 7.22(m,5H),6.15(d,J＝6.8Hz,1H),5.12(s,1H),5.03–4.95(m,1H),4.48–4.41(m,1H), 2.04(s,3H),2.00–1.90(m,1H),1.89–1.84(m,3H),1.79–1.70(m,6H),1.63–1.55(m,4H), 1.50(m,3H),1.46–1.33(m,9H),1.32–1.16(m,5H),1.01(s,3H),0.98(m,2H),0.95(s,3H), 0.84(d,J＝6.5Hz,1H),0.82(d,J＝5.7Hz,1H),0.74(d,J＝10.1Hz,1H),0.72(s,3H).
实施例20 N-(甲氨酰基)甲基熊果酸酰胺(21)
将0.3g 16溶于溶于10mL混合溶剂中(THF:MeOH(V:V)＝3:2)中，室温下搅拌，滴加入5mL的4N NaOH溶液，TLC监测反应(CH2Cl2:MeOH＝10:1)。反应完全后减压蒸除溶剂，残余物用30mL蒸馏水和30mL乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗两遍，无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后得到21的白色固体粉末0.26g，产率93.6％。熔点： 237.3-238.8℃；ESI-MS m/z527.35[M+H]+,549.44[M+Na]+；TOF-HRMS m/z:calcd for C33H54N2O3526.4134；found527.4178[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.92(s,1H),5.41 (t,J＝3.2Hz,1H),3.98(d,J＝14.2Hz,1H),3.79(d,J＝15.6Hz,1H),3.52(brs,1H),3.21(dd, J1＝11.2Hz,J2＝4.4Hz,1H),2.81(s,3H),2.01(m,4H),1.82(m,1H),1.70(m,1H),1.51(m, 6H),1.32(m,3H),1.09(s,3H),1.04(m,1H),0.99(m,1H),0.98(s,3H),0.95(s,3H),0.90(s, 3H),0.87(d,J＝6.4Hz,3H),0.77(s,3H),0.71(d,J＝11.2Hz,1H),0.69(s,3H).
实施例21 N-羧甲基-N-甲基熊果酸酰胺(22)
称取0.3g 13，按照与实施例20，方法一中的步骤7中相同方法，得到化合物22的白色固体粉末0.22g，产率81.1％。熔点：118.7-119-7℃；ESI-MS m/z 526.65[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd for C33H53NO4527.3975；found 528.4026[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.23 (s,1H),4.11(m,1H),3.96(m,1H),3.88(m,1H),3.73(m,1H),3.23(s,3H),3.22(m,1H),2.46 (d,J＝10.8Hz,1H),2.17(m,1H),2.01(m,1H),1.91(d,J＝8.4Hz,2H),1.84(d,J＝14.4Hz, 2H),1.74(m,1H),1.63(m,3H),1.51(m,3H),1.37(m,5H),1.11(m,1H),1.09(s,3H),1.02(m, 1H),0.99(s,3H),0.95(d,J＝6.1Hz,3H),0.91(s,3H),0.87(d,J＝6.0Hz,3H),0.78(s,3H), 0.73(s,3H),0.72(d,J＝11.2Hz,1H).
实施例22 N-(甲胺酰基)甲基-N-甲基熊果酸酰胺(23)
称取0.3g 17，按照与实施例20，方法二中的步骤8中相同方法，得到化合物23的白色固体粉末0.19g，产率68.2％。ESI-MS m/z 541.60[M+H]+,563.16[M+Na]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.56(t,J＝6.0Hz,1H),5.23(t,J＝3.6Hz,1H),4.12(q,J＝7.2Hz,1H),3.49(brs,1H),3.31–3.05(m,4H),2.74(d,J＝4.6Hz,3H),2.45(d,J＝10.8Hz,1H),2.16(td,J1＝ 14.2Hz,J2＝3.2Hz,1H),1.92(dd,J1＝8.8Hz,J2＝3.6Hz,2H),1.89–1.77(m,2H),1.69–1.57 (m,5H),1.56–1.46(m,5H),1.46–1.28(m,5H),1.15(m,1H),1.09(s,3H),1.04(m,1H),0.99 (s,3H),0.96(d,J＝6.0Hz,3H),0.91(s,3H),0.88(d,J＝6.4Hz,3H),0.78(s,3H),0.72(m,4H).
实施例23 N-(2-甲胺酰基)乙基熊果酸酰胺(24)
称取0.3g 18，按照与实施例20，方法二中的步骤8中相同方法，得到化合物24的白色固体粉末0.20g，产率71.8％。ESI-MS m/z 541.25[M+H]+,563.58[M+Na]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.52(t,J＝5.6Hz,1H),5.92(s,1H),5.33(s,1H),3.54(dt,J1＝12.8Hz,J2＝6.0 Hz,1H),3.38(dt,J1＝12.8Hz,J2＝6.0Hz,1H),3.21(dd,J1＝10.8Hz,J2＝4.8Hz,1H),2.80(d, J＝4.8Hz,3H),2.37(m,2H),1.97(m,3H),1.82(m,2H),1.76–1.57(m,6H),1.57–1.35(m, 8H),1.35–1.18(m,4H),1.09(s,3H),1.07(m,1H),1.03(m,2H),0.99(s,3H),0.94(s,3H),0.91 (s,3H),0.87(d,J＝6.4Hz,3H),0.78(s,3H),0.76(s,3H),0.72(d,J＝12.0Hz,1H).
实施例24 N-((S)-2-羧基四氢吡咯烷-1-基)-熊果酸酰胺(25)
称取0.3g 15，按照与实施例20，方法一中的步骤7中相同方法，得到化合物25的白色固体粉末0.20g，产率73.4％。熔点：298.0-299.2℃；ESI-MS m/z 554.73[M+H]+,576.50[M+Na]+,552.52[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd for C35H55NO4553.4131；found 554.4197 [M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.24(s,1H),4.51(brs,1H),3.73(m,1H),3.48(m,1H), 3.21(dd,J1＝10.0Hz,J2＝3.6Hz,1H),2.48(dd,J1＝16.0Hz,J2＝5.2Hz,1H),2.26–2.06(m,2H),1.87–2.00(m,3H),1.85–1.70(m,3H),1.65–1.43(m,9H),1.42–1.17(m,6H),1.09(m,4H),0.99(m,4H),0.86–0.95(m,9H),0.78(s,3H),0.72(m,4H).
实施例25 N-(2-溴乙基)熊果酸酰胺(26)
称取0.3g 19，按照与实施例20，方法一中的步骤7中相同方法，得到化合物26的白色固体粉末0.24g，产率86.0％。熔点：258.5-260.3℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.21(t, J＝3.2Hz,1H),4.12(t,J＝9.2Hz,2H),3.77(t,J＝9.2Hz,2H),3.21(dd,J1＝10.2Hz,J2＝4.0Hz,1H),2.20(d,J＝11.1Hz,1H),2.06(t,J＝13.2Hz,1H),1.92(m,3H),1.65(m,5H),1.50(m, 5H),1.33(m,5H),1.08(m,4H),1.00(m,5H),0.93(m,6H),0.85(d,J＝5.7Hz,3H),0.77(s, 6H),0.72(d,J＝11.2Hz,1H).
实施例26 N-((S)-1-苯基乙基)熊果酸酰胺(27)
称取0.3g 20，按照与实施例20，方法一中的步骤7中相同方法，得到化合物27的白色固体粉末0.25g，产率89.6％。熔点：237.9-238.6℃；ESI-MS m/z 560.29[M+H]+,582.41[M+Na]+,558.68[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd for C38H57NO2559.4389；found 560.4430 [M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32–7.16(m,5H),6.09(d,J＝5.0Hz,1H),5.06(s,1H), 4.92(s,1H),3.11(d,J＝9.9Hz,1H),1.85(m,4H),1.66(m,2H),1.56(m,1H),1.53–1.41(m, 5H),1.38(m,5H),1.29(m,5H),1.16(dd,J＝26.9,12.4Hz,3H),0.96(s,1H),0.91(m,2H),0.88(s,6H),0.77(d,J＝5.7Hz,3H),0.67(s,3H),0.63(s,3H),0.56(d,J＝11.4Hz,1H),0.20(s,3H).
实施例27 N-[(2-羟乙基胺基)甲酰基]甲基熊果酸酰胺(28)
将0.3g 12(0.526mmol,1eq)溶于25mL甲醇中，加入0.32g氨基乙醇(5.26mmol,10eq)，加热至回流，TLC监测反应进行(CH2Cl2:MeOH＝10:1)原料消耗完全后减压蒸除溶剂，残余物用30mL蒸馏水和30mL EA萃取，有机层用饱和食盐水洗两遍，无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后得到相应中间产物的粗品，不经纯化直接用于下一步。将上一步产物的粗品溶于10mL的混合溶剂中(THF:MeOH(V:V)＝3:2)中，室温下搅拌，滴加入5mL 的4NNaOH溶液，TLC监测反应。反应完全后减压蒸除大部分溶剂，残余物用30mL蒸馏水和30mL EA萃取，有机层用饱和食盐水洗两遍，无水MgSO4干燥。减压蒸除溶剂后将残余物进行硅胶柱分离(CH2Cl2:MeOH(V:V)＝50:1→30:1)，得到28的白色固体粉末，产率63.2％(按两步反应计)。熔点：202.5-204.9℃；ESI-MS m/z 557.42[M+H]+,579.30[M+Na]+, 555.57[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd for C34H56N2O4556.4240；found 557.4296[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(t,J＝5.4Hz,1H),7.06(t,J＝4.0Hz,1H),5.43(t,J＝3.2Hz, 1H),3.95(dd,J1＝16.4Hz,J2＝4.8Hz,1H),3.77(dd,J1＝16.4Hz,J2＝3.6Hz,1H),3.68(t,J＝ 4.8Hz,2H),3.40(dd,J1＝9.6Hz,J2＝5.2Hz,2H),3.18(dd,J1＝10.8Hz,J2＝4.8Hz,1H),1.98 (m,4H),1.78(m,1H),1.63(m,4H),1.50(m,4H),1.41(m,4H),1.31(m,2H),1.07(s,3H),1.04 (m,2H),0.95(s,3H),0.92(m,4H),0.88(s,3H),0.85(d,J＝6.4Hz,3H),0.75(s,3H),0.69(d,J ＝11.2Hz,1H),0.66(s,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ179.45,169.05,138.53,126.95, 78.97,65.67,61.70,55.16,53.65,47.83,47.61,42.33,39.78,39.60,39.03,38.81,38.71,36.96,32.73,30.87,30.63,28.19,27.83,27.23,24.94,23.53,23.48,21.27,19.26,18.37,17.24,16.52, 15.77,15.58.
实施例28 N-[(N-2-羟乙基-N-甲基胺基)甲酰基]甲基熊果酸酰胺(29)
按照与实施例27，方法二中的步骤7和8中相同方法，化合物12与N-甲基氨基乙醇得到化合物29的白色固体粉末，产率74.2％(按两步反应计)。熔点：250.1-251.9℃；ESI-MSm/z 571.46[M+H]+,593.51[M+Na]+；TOF-HRMS m/z:calcd for C35H58N2O4 570.4397；found571.4458[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.09(m,1H),5.45(t,J＝3.4Hz,1H),4.20and4.07(dd,J1＝17.6Hz,J2＝4.4Hz,1H),3.91(dd,J1＝17.8Hz,J2＝2.8Hz,1H),3.79and 3.76(t, J＝5.2Hz,2H),3.58and 3.41(ddt,J1＝36.0Hz,J2＝14.4Hz,J3＝5.2Hz,2H),3.21(dd,J1＝ 11.2Hz,J2＝4.4Hz,1H),3.04and 3.00(s,3H),2.63(brs,1H),2.02(m,2H),1.95(m,2H),1.79 (m,4H),1.63(m,4H),1.46(m,7H),1.29(m,4H),1.09(s,3H),1.04(m,2H),0.97(s,3H),0.94 (m,3H),0.89(s,3H),0.87(d,J＝7.4Hz,3H),0.76(s,3H),0.71(d,J＝11.6Hz,1H),0.67(s, 3H).
实施例29 N-[N,N-二(2-羟乙基)胺基]甲酰基甲基熊果酸酰胺(30)
按照与实施例27，方法二中的步骤7和8中相同方法，化合物12与二乙醇胺得到化合物30的白色固体粉末，产率58.2％(按两步反应计)。熔点：150.9-152.3℃；ESI-MS m/z601.38 [M+H]+,623.68[M+Na]+,599.42[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd forC36H60N2O5600.4502； found 601.4557[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.12(s,1H),5.44(t,J＝3.4Hz,1H), 4.12(dd,J1＝17.6Hz,J2＝4.4Hz,1H),3.95(dd,J1＝7.6Hz,J2＝2.8Hz,1H),3.87(td,J1＝12.4 Hz,J2＝7.4Hz,2H),3.80(m,2H),3.57(t,J＝4.4Hz,2H),3.45(m,2H),3.20(dd,J1＝11.2Hz, J2＝4.4Hz,1H),1.99(m,4H),1.78(m,4H),1.61(m,3H),1.47(m,7H),1.29(m,5H),1.12(s, 3H),1.03(m,2H),0.97(s,3H),0.95(s,3H),0.89(s,2H),0.87(d,J＝6.8Hz,3H),0.76(s,3H), 0.71(d,J＝11.2Hz,1H),0.66(s,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ178.67,170.13,138.54, 126.83,79.12,61.27,60.42,55.24,53.77,51.56,51.05,47.80,47.69,42.71,42.33,42.07,39.83, 39.70,39.17,38.87,38.75,37.07,37.04,32.78,30.97,28.24,27.93,27.31,25.01,23.58,21.33, 18.39,17.31,16.41,15.75,15.59.
实施例30 N-[(2,3-二羟基丙基胺基)甲酰基]甲基熊果酸酰胺(31)
按照与实施例27，方法二中的步骤7和8中相同方法，化合物12与2,3-二羟基丙胺得到化合物31的白色固体粉末，产率63.7％(按两步反应计)。熔点：141.1-142.3℃；ESI-MSm/z 587.52[M+H]+,609.61[M+Na]+,585.25[M-H]-；TOF-HRMS m/z:calcd for C35H58N2O5586.4346；found 587.4404[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(td,J1＝17.6Hz,J2＝3.2Hz,1H),7.12(s,1H),5.42(t,J＝3.2Hz,1H),3.96(dd,J1＝17.6Hz,J2＝4.4Hz,1H),3.95(dd, J1＝7.6Hz,J2＝2.8Hz,1H),3.87(td,J1＝12.4Hz,J2＝7.4Hz,2H),3.76(m,2H),3.53(m,2H), 3.36(m,3H),3.21(dd,J1＝11.2Hz,J2＝4.4Hz,1H),2.00(m,4H),1.82(m,2H),1.52(m,12H), 1.27(m,4H),1.10(s,3H),1.04(m,2H),0.98(s,3H),0.95(s,3H),0.91(s,3H),0.88(d,J＝6.8 Hz,3H),0.77(s,3H),0.71(d,J＝11.2Hz,1H),0.69(s,3H).
实施例31免疫沉淀法测定化合物对特异性去SUMO化蛋白酶1抑制活性实验
取对数生长期的Hela细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，过夜培养；待细胞完全贴壁恢复形态后，更换为含终浓度为5μM的熊果酸或受试化合物的培养基，继续培养24h；去除培养基，用PBS清清洗涤两次，用0.25％胰酶消化，1500rpm离心5min收集细胞；每个样品加入200μl RIPA裂解液(已加入蛋白酶抑制剂PMSF、抑肽酶)，冰上裂解1h，每15min 振荡混悬一次；4℃低温离心，14000×g离心15min，小心吸取上层清液(避免吸到沉淀)。对回收的上层清液进行蛋白定量。
采用BCA法进行蛋白定量。配制蛋白标准液，稀释至终浓度为0.5mg/mL；将稀释后的标准液按0、1、2、4、8、12、16和20μl分别加到96孔板的孔中，加PBS补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/ml。取4μl样品， PBS补足到80μL，混匀后取20μL加到96孔板样品孔中，做3个复孔。根据标准品和样品的数量配制BCA工作液，BCA试剂A与BCA试剂B按50:1的比例配制适量BCA工作液，充分混匀，现用现配。各孔加入200μL BCA工作液，37℃孵育30min；用酶标仪测定 562nm波长的吸光度；根据标准曲线和样品体积计算出样品的蛋白浓度。
取500μg裂解液(加入1μg IgG和20μL protein A/G-beads，4℃缓慢摇晃孵育30min，在4℃以3000rpm速度离心5min，收集上清)，将2μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜。取20μLprotein A/G-beads，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心5min。将预处理过的20μLprotein A/G-beads加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，在4℃下缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A/G-beads偶连。免疫沉淀反应后，在4℃以3000rpm速度离心5min，将protein A/G-beads离心至管底，将上清小心吸去。protein A/G-beads用1mL裂解缓冲液洗5次，最后加入20μl的2×SDS加样缓冲液，金属浴98℃ 5min。进行SDS-PAGE分析。
蛋白电泳及转印：根据检测指标的分子量大小选取分离胶浓度，浓缩胶均为5％，配制方法详见表1，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)。蛋白上样量控制在40μg。蛋白电泳，70V电泳25min，待样品跑到浓缩胶与分离胶的分界线，提高电压到110V，继续电泳80min，至上样缓冲液的蓝色条带跑到末尾，电泳停止。蛋白转印采用湿转法，在恒流100mA下转印120min(转印时间根据蛋白分子量定，蛋白分子量越小，转膜时间相应减少)，将蛋白转至PVDF膜上。
表1分离胶和浓缩胶的配制方法和组成
抗体孵育及显色：将PVDF膜放入TBST溶液配制的5％脱脂奶粉溶液中封闭1h以上；按照检测蛋白指标的分子量大小切取条带，加入相应的一抗，放于4℃冰箱中孵育过夜。之后用TBST溶液洗涤条带3次，每次10min；将膜与相应的辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)标记的二抗室温孵育2h，用TBST溶液洗涤条带2次，每次5min，随后改为PBS溶液洗涤条带1次，洗涤5min。采用ECL法于暗室中利用X射线胶片曝光获得蛋白表达图像。将蛋白条带扫描成电子版，用Scion Corporation软件分析目的蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算各目的蛋白相对表达量(目的蛋白灰度值/β-actin灰度值)。本实验以化合物7为对照药物，以其在免疫沉淀的抑制活性活性为1，根据蛋白的相对表达量得到受试化合物的相对活性数值。
化合物抑制SENP1活性的结果见表2和图1
表2化合物对SENP1抑制率活性测试结果
从表1可以看出，本发明中绝大部分化合物表现出明显的特异性去SUMO化蛋白酶抑制活性。
实施例52细胞毒性实验
将处于对数生长期的Hela细胞按照3×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL，过夜培养。显微镜观察细胞贴壁且形态恢复后，吸除原培养基，用D-hanks缓冲液冲洗，加入无胎牛血清的培养基配制的待测化合物药物溶液，终浓度依次为0.7、2.2、6.6、20μM，每组设置三个复孔，并设置相应空白组，对照组内加入0.1％DMSO，每组设3个复孔，并设对应的空白组；在37℃、5％CO2条件下继续培养72h，每孔加入10μL CCK-8检测液，在37℃培养箱中继续孵育1h。利用酶标仪在490nm波长处读取各孔吸光度值(A)，计算抑制率和IC50值，计算公式和方法如下：
抑制率＝[1－(A药物－A空白)/(A对照－A空白)]×100％
以抑制率为纵坐标，lg[M]为横坐标(M为给药浓度)，采用GraphpadPrism 6.0软件拟合曲线，计算相应受试化合物的IC50值。
化合物细胞毒性活性测试结果见表3：
表3化合物抑制Hela细胞增殖活性的测试结果
从表2可以看出，本发明化合物表现出较低的细胞毒性，适合作为放射增敏剂进行进一步研究。
实施例53克隆形成实验
取对数生长期的Hela细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打呈单个细胞，将细胞悬液稀释至适当浓度。实验以1、17和21为实验组，每组设置5组不同的照射剂量(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)，不同的照射剂量组接种不同数量的细胞，每组药物每个剂量设置三个平行实验孔，其中0Gy组和2Gy组每孔接种200个细胞，4Gy组每孔接种500个细胞，6 Gy组每孔接种2000个细胞，8Gy组每孔接种5000个细胞。将细胞接种至含500μL培养基24孔板中后，37℃下预温，米字形震荡使细胞分散均匀，过夜孵育，使其贴壁生长。
对照组不做处理，继续培养24h后进行照射；弃去药物组中的培养基后，加入500μL含终浓度为5μM的受试化合物的培养基，继续培养24h。随后将对照组和药物组进行不同剂量的照射(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)，照射剂量率为1Gy/min。照射完成后在5％ CO2，37℃培养箱中培养2周后终止培养，期间每隔3天换液一次。
完成培养后弃去上清液，PBS洗涤2次，加4％多聚甲醛固定细胞15min。弃去固定液， PBS洗涤2次，加入适量的0.1％结晶紫染液染色10min，PBS洗涤3次，空气干燥。肉眼对克隆数计数，大于50个细胞的集落计作1个克隆数，并计算每个照射剂量的克隆形成率和细胞存活分数。结果见图2-图6。
克隆形成率计算公式如下：
克隆形成率＝对照组克隆数/对照组接种细胞数×100％；
细胞存活分数计算公式如下：
细胞存活分数(SF)＝实验组克隆数/(实验组接种细胞数×克隆形成率)×100％
采用GraphPadPrism 6.0软件对实验数据样本进行分析比较，实验数据以平均数±标准差表示，采取单因素方差分析，P<0.05，认为有统计学差异。根据多靶单击模型进一步计算D0值以及Dq值，并拟合对照组和实验组的剂量-效应曲线，计算放射增敏比(SER)。
化合物处理后的Hela细胞联合照射后的细胞存活分数结果见表3。
表3受试化合物处理后的Hela细胞联合照射后的细胞存活分数
根据多靶单击模型拟合的受试化合物的存活分数-照射剂量曲线如图7所示，得到的对照组和药物组的D0、Dq以及药物组SER值如表4所示。
表4经受试化合物处理后Hela细胞的放射增敏相关参数
从图1和表4可以看出，本发明中的化合物表现出较好放射增敏活性，有望作为肿瘤放射增敏药物。
Claims (10)
1.一种式Ⅰ结构化合物及其药学上可用的盐：
2.权利要求1所述的化合物及其药学上可用的盐，其中：
a)R1独立地选取C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、-CO(C1-C4烷基)、-CO(芳基)、-CO(杂芳基)、-CO(C3-C6环烷基)、-CO(C3-C6杂环烷基)、-SO2(C1-C4烷基)、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基、芳基、C1-C10烷基-芳基、杂芳基和C1-C10烷基-杂芳基的酯或酰胺；
b)R2独立地选取氢原子、C1-C10烷基酰基、芳基酰基、杂芳基酰基。
3.根据权利要求2所述的化合物及其药学上可用的盐，其特征在于R1独立地选自如下化学结构：
4.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可用的盐，其特征在于R2独立地选自：氢原子、乙酰基。
5.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可用的盐，选自：
6.权利要求1-5任一项所述所述的化合物或其药学上可用的盐，其制备方法包括以下步骤：
1)取化合物A，在极性非质子溶剂中与溴乙酸甲酯和碱反应，得化合物B；
2)将化合物B在甲醇溶剂中与相应的胺反应，得到化合物C；
3)取化合物A，在极性非质子溶剂中与1,2-二溴乙烷和碱反应，得化合物D；
4)将化合物D在极性非质子溶剂中与相应的胺和碱反应，得化合物E；
5)取化合物A，在吡啶中与乙酸酐反应，得化合物F；
6)将化合物F在非极性溶剂中与草酰氯反应，随后与相应的胺盐和有机碱反应,可得化合物G1、化合物G2、化合物G3；
7)将化合物G1、化合物G2、化合物G3三者任一种，在四氢呋喃/甲醇混合溶液中与氢氧化钠溶液反应得到化合物I；
其中，化合物结构如下：
7.权利要求1-5任一项所述所述的化合物或其药学上可用的盐，其制备方法包括以下步骤：
1)取化合物A，在极性非质子溶剂中与溴乙酸甲酯和碱反应，得化合物B；
2)化合物B在甲醇溶剂中与相应的胺反应，得到化合物C；
3)化合物A，在极性非质子溶剂中与1,2-二溴乙烷和碱反应，得化合物D；
4)化合物D在极性非质子溶剂中与相应的胺和碱反应，得化合物E；
5)化合物A，在吡啶中与乙酸酐反应，得化合物F；
6)化合物F在非极性溶剂中与草酰氯反应，随后与相应的胺盐和有机碱反应，得化合物G1；
7)将步骤6)所得化合物G1在甲醇中相应的胺反应，得到化合物H；
8)将化合物H在四氢呋喃/甲醇混合溶液中与氢氧化钠溶液反应得到化合物I；
8.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项上所述的式I结构化合物或其药学上可用的盐，以及药学上可接受的载体。
9.权利要求1-5所述化合物及其药学上可用的盐在制备特异性去SUMO化蛋白酶1抑制剂药物的应用。
10.权利要求9所述的应用为在制备肿瘤放疗增敏药物的应用。
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