CN112082846B - 肌肉中磺胺二甲基嘧啶检测样品的环境友好型前处理方法 - Google Patents

Abstract

肌肉中磺胺二甲基嘧啶检测样品的环境友好型前处理方法，在检测肌肉中磺胺二甲基嘧啶含量时，采用不含有机溶剂的提取液提取肌肉中的磺胺二甲基嘧啶，再用不含有机溶剂的稀释液对提取液进行稀释后进行检测。所述提取液的成分为：含有Tween‑20和PVP40000的柠檬酸缓冲溶液；样品稀释液的成分为：含有Tween‑80和PEG20000的磷酸盐缓冲溶液。本发明方法对包括虾肉在内的肌肉中磺胺二甲基嘧啶的提取率，可达90.47%‑109.48%；全程可在10min钟内完成，具有绿色、环保、快速等优点，适合肌肉组织类样品中磺胺二甲基嘧啶含量的现场快速、高通量处理。适用于基于单克隆抗体的免疫检测技术。

Description

肌肉中磺胺二甲基嘧啶检测样品的环境友好型前处理方法

技术领域

本发明涉及一种肉类食品中磺胺二甲基嘧啶检测样品的前处理方法，尤其是涉及一种肉类食品肌肉中残存磺胺二甲基嘧啶含量检测样品的前处理方法。

背景技术

磺胺二甲基嘧啶是一种广谱抗菌剂，常用作饲料添加剂，用来防止葡萄球菌及溶血性链球菌等的感染。

水产品养殖业中，磺胺二甲基嘧啶的滥用导致虾等水产品中出现抗生素残留，虾肉及其他水产品中磺胺二甲基嘧啶的残留会危害食用者的健康，对我国虾等水产品的出口贸易也有重要影响。这就要求质检单位、海关等监管部门需要进行严格的监管，也需要企业、养殖户等，进行自我监督。

目前，针对水产品肌肉中残存的磺胺二甲基嘧啶的检测手段，主要分为两类：一类是传统的实验室仪器检测方法；另一类是现场的快速检测方法。

以高效液相色谱为代表的仪器检测方法，虽然有较高的灵敏度，但是其对样品的前处理要求十分严格，并且检测耗时长，需要专业人员操作，检测成本高，不适合批量样品的快速检测。

以基于单克隆抗体的酶联免疫检测方法和试纸条方法已经成为快速、高通量现场检测的主流方法，在企业、监管部门中都大量被采用。

但是，对于肌肉组织类样品，尤其是蛋白质含量高的虾肉之类样品，前处理过程依然相对复杂。由于肌肉组织类食品的基质比较复杂，目前已有的前处理方法，都会采用含有机溶剂的提取液来提取虾肉、猪肉中的抗生素残留。

有机溶剂的使用有两大弊端：首先，有机溶剂的使用会污染环境，与“绿色环保”理念不符；另外，高通量的现场检测往往缺乏专业的通风设备，会导致检测人员吸入易挥发的有机溶剂，危害他们的健康。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种具有环保、安全、快速优点的肉类食品肌肉中磺胺二甲基嘧啶检测样品的前处理方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种肉类食品肌肉中磺胺二甲基嘧啶检测样品的前处理方法，使用的磺胺二甲基嘧啶提取液为含有Tween-20和PVP10000的柠檬酸缓冲溶液；使用的稀释液为含有Tween 80和PEG20000的磷酸盐缓冲溶液。

进一步，所述柠檬酸缓冲溶液中，Tween-20的体积浓度为0.9-1.1%，PVP10000的质量体积浓度为0.9-1.1%（w/v）；所述磷酸盐缓冲溶液中，Tween 80的体积浓度4.5-5.5%，PEG20000的质量体积浓度为0.9-1.1%（w/v）。

进一步，所述柠檬酸缓冲溶液中，Tween-20的体积浓度为1.0%，PVP10000的质量体积浓度为1.0%（w/v），pH=7.2；所述磷酸盐缓冲溶液中，Tween 80的体积浓度5.0%，PEG20000的质量体积浓度为1.0%（w/v），pH=6.2。

进一步，本发明方法的具体操作步骤如下：

（1）提取液的配制：向柠檬酸缓冲溶液中加入Tween-20和PVP10000，混合均匀后，备用；

（2）稀释液的配制：向磷酸盐缓冲溶液中加入Tween 80和PEG20000，混合均匀后，备用；

（3）磺胺二甲基嘧啶提取：称取肌肉样品置于离心管中，加入1.8-2.2mL提取液即含Tween-20和PVP10000的柠檬酸缓冲溶液，于振荡器上震荡0.8-1.2min，再放置于离心机中，3500-4500r/min 离心2.5-3.5min；取离心后的上清液，用稀释液即含Tween 80和PEG20000的磷酸盐缓冲溶液将上清液稀释4-6倍，即成。

进一步，称取的肌肉样品为2g，离心管的容积为15mL，加入的提取液所述柠檬酸缓冲溶液为2.0mL，震荡的时间为1.0min，离心机的转速为4000r/min，离心的时间为3.0min，用稀释液所述磷酸盐缓冲溶液将上清液稀释5倍。

柠檬酸缓冲溶液中加入表面活性剂和聚合物，表面活性剂有乳化和分散的作用，让肌肉均匀分散在缓冲溶液里，聚合物可以让肌肉中的磺胺二甲基嘧啶溶出来，并且有稳定体系的作用。另外，稀释液中的聚合物有助于单克隆抗体的舒展，更好地与目标物结合。

本发明通过选用合适的表面活性剂和聚合物、缓冲溶液，构建提取液体系和稀释液体系，提高肌肉中磺胺二甲基嘧啶的提取率，优选方案还包括选择缓冲溶液的合适的pH值，建立的前处理方法可以用于酶联免疫检测方法和试纸条检测方法中包括虾肉在内的前处理，用于包括虾肉在内的肉类食品的现场高通量、快速检测。

本发明方法使用的提取液、稀释液分别采用含有表面活性剂和聚合物的缓冲体系。均不含有机溶剂。对环境友好；提取液、稀释液体系稳定；操作简便。

附图说明

图1为荧光试纸条检测虾肉中磺胺二甲基嘧啶的标准曲线。

具体实施方式

以下通过实施例本发明作进一步是明。

实施例中使用的化学试剂均通过常规商业途径获得。

实施例1（回收率试验）

（1）提取液的配制：向柠檬酸缓冲溶液（0.01M, pH 6.2）中加入Tween-20（1%（v/v））和PVP10000（1%（w/v）），混合均匀后，备用；

（2）稀释液的配制：向磷酸盐缓冲溶液（0.01M, pH 7.2）中加入Tween 80（5%（v/v））和PEG20000（1%（w/v）），混合均匀后，备用；

（3）虾肉中磺胺二甲基嘧啶提取：称取2 g 虾肉样品置于15 mL离心管中，加入磺胺二甲基嘧啶，使其在虾肉样品中的浓度为10 μg/kg，加入2 mL步骤（1）配制的提取液，于振荡器上震荡1min，再放置于离心机中，4000 r/min 离心3 min；

（4）稀释：取离心后的上清液，用步骤（2）配制的稀释液将上清液稀释5倍，样品前处理工作即告完成。

取步骤（4）稀释好的待测液160 μL，用其将冻干的荧光微球探针溶解，取80 μL滴于试纸条样品垫，室温反应5min后，采用荧光免疫分析仪进行读数，即得虾肉中的磺胺二甲基嘧啶含量的检测结果。

表1列出的为虾肉中磺胺二甲基嘧啶的添加回收实验数据。

表1 虾肉中磺胺二甲基嘧啶的添加回收率实验

添加浓度（μg/kg）	检测浓度（μg/kg）	回收率（%）
			1	0.90	90.47
2	2.19	109.48
			5	5.04	100.80

实施例2

（1）在长沙世纪华联超市随机购买虾仁100g，剁碎后称取2.0 g 虾肉糜于15 mL离心管中，加入2 mL提取液，于振荡器上震荡1min，再放置于离心机中，4000 r/min 离心3min

（2）取离心后的上清液，用稀释液将上清液稀释5倍。

（3）取步骤（2）稀释好的待测液160 μL，用其将冻干的荧光微球探针溶解，取80 μL滴于试纸条样品垫，室温反应5min后，采用荧光免疫分析仪进行读数，即得虾肉中的磺胺二甲基嘧啶含量的检测结果，检测结果为阴性。

实施例2使用的提取液、稀释液均为实施例1制备的。

Claims (4)

1.一种肌肉中磺胺二甲基嘧啶含量检测样品的前处理方法，其特征在于，使用的磺胺二甲基嘧啶提取液为含有Tween-20和PVP10000的柠檬酸缓冲溶液；使用的稀释液为含有Tween 80和PEG20000的磷酸盐缓冲溶液；

具体操作步骤如下：

（1）提取液的配制：向柠檬酸缓冲溶液中加入Tween-20和PVP10000，混合均匀后，备用；

（2）稀释液的配制：向磷酸盐缓冲溶液中加入Tween 80和PEG20000，混合均匀后，备用；

（3）磺胺二甲基嘧啶提取：称取肌肉样品置于离心管中，加入1.8-2.2mL所述提取液，于振荡器上震荡0.8-1.2min，再放置于离心机中，3500-4500r/min 离心2.5-3.5min；取离心后的上清液，用所述稀释液将上清液稀释4-6倍，即成。

2.根据权利要求1所述的肌肉中磺胺二甲基嘧啶含量检测样品的前处理方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲溶液中，Tween-20的体积浓度为0.9-1.1%，PVP10000的质量体积浓度为0.9-1.1%（w/v）；所述磷酸盐缓冲溶液中，Tween 80的体积浓度4.5-5.5%，PEG20000的质量体积浓度为0.9-1.1%（w/v）。

3.根据权利要求2所述的肌肉中磺胺二甲基嘧啶含量检测样品的前处理方法，其特征在于，所述柠檬酸缓冲溶液中，Tween-20的体积浓度为1.0%，PVP10000的质量体积浓度为1.0%（w/v），pH=7.2；所述磷酸盐缓冲溶液中，Tween 80的体积浓度5.0%，PEG20000的质量体积浓度为1.0%（w/v），pH=6.2。

4.根据权利要求1-3之一所述的肌肉中磺胺二甲基嘧啶含量检测样品的前处理方法，其特征在于，步骤（3）中，称取的肌肉样品为2g，离心管的容积为15mL，加入的所述提取液为2.0mL，震荡的时间为1.0min，离心机的转速为4000r/min，离心的时间为3.0min，用所述稀释液将上清液稀释5倍。

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