CN112067685A - 一种FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种FaPEx‑TD‑ESI‑MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法，首先对肉类样品进行前处理：称取肉类样品，加入盐酸溶液震荡，然后加入醋酸乙腈溶液震荡，再离心，萃取液于FaVEx快速过滤柱中过滤，移取过滤液氮吹至近干，定容后，形成样品溶液；由样品溶液与对照品溶液是否具有相同的分子离子峰和碎片离子峰，以及待测物的碎片离子丰度比与对照品溶液的离子丰度比是否一致，判断样品中是否存在对照品中的化合物，即样品中是否含有瘦肉精。本发明将FaVEx快速过滤柱和TD‑ESI‑MS/MS技术有效结合，且有效地缩短了前处理时间，有机试剂用量少，对环境污染小，具有快速、准确、简便、耐用和低成本的优势。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法。
背景技术
“瘦肉精”是指具有相似结构的β-受体激动剂，临床上用于治疗哮喘、休克等疾病。该类药物能够促进动物生长，并显著提高瘦肉率，为了迎合消费需求，常被非法添加在畜禽肉中。为此，农业部235号公告明确规定，动物源性食品中不得检出β-受体激动剂。热解吸-电喷雾-原位质谱仪(TD-ESI-MS/MS)是目前比较先进的质谱技术之一，其优势在于使用探针取样直接检测，不受样品状态影响，没有记忆效应，操作时只通过简单的金属探针接触固体表面或液体样品采集待测物，以高温加热的方式完成探针表面吸附物质的解吸过程，解吸后的气相物质分子经载气流轨道收束并吹送至电喷雾区域，完成离子化过程，最终进入三重四极杆质谱检测器分析，适用于现场的快速筛查。该方法现已应用于食品质量安全检测、果蔬中农药残留、保健食品非法添加物等方面的研究，但在畜禽肉中兽药残留的应用未见相关报道。
目前检测β-受体激动剂最常用的方法有免疫分析法和仪器分析法。免疫分析法最常用的有酶联免疫法和胶体金免疫层析法，酶联免疫法的原理是待测样品中的β-受体激动剂类药物残留与微孔包被的抗原共同竞争特异性抗体；胶体金免疫层析法是一种利用胶体金颗粒作为标记物简单快速的免疫分析方法，其最关键的是制备出特异性强和纯度高的单克隆抗体，使用原理是将人工合成的抗原先固定于条状纤维层析材料的试纸条上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，样品溶液借助毛细作用在试纸条上移动，待测物与人工合成的抗原竞争结合胶体金标记的抗体，并直接以颜色显示检测结果；胶体金免疫层析法目前主要用在液体样品检测中，在肉制品中应用不多，其灵敏度和准确度不及酶联免疫法。仪器分析法最常用的有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，色谱质谱技术联用，可以对待测物进行有效的分离，是一种高灵敏度、高准确性的检测方法。
胶体金免疫层析法适用于大量样品的快速筛查，但是检测结果受环境和人为因素影响而存在差异，并且无法定量分析；酶联免疫法专一性和重现性无法得到有效保障，假阳性较多；虽然免疫法操作简单、使用成本不高，在检测中能快速测量大批量样品，但免疫学存在交叉反应现象仍然是制约其应用的主要问题，而且受厂家生产试剂质量影响，有可能抗体批次不同，测定结果也会出现差异；另外在同类药物多残留检测方法方面也有其不能所及之处，不能用于国家相关执法仲裁检验。胶体金免疫层析法、酶联免疫法均为快速检测方法，适用于前端的快速筛查，其定性分析的准确度和定量分析的灵敏度均不及GC-MS和LC-MS法。
GC-MS和LC-MS法以其较高的灵敏度和专属性作为最常用的国标检测方法，GC-MS需要对样品进行衍生，衍生耗时长且过程不易控制，造成衍生程度不同，进而影响定量准确性；因而目前国标主流的检测方法为LC-MS，以两种国标为例分析，GB/T 21313-2007《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》样品需要经过双柱净化、同时用基质加标配置标准曲线，整个实验过程繁琐，增加试剂消耗以及人力消耗，人员操作差异大，实验平行性难以得到有效保证；GB/T22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》需要两次调节pH，用MCX阳离子交换柱净化，内标法校正，固相萃取法一般经过活化、上样、淋洗、洗脱等过程，提取溶剂异丙醇：乙酸乙酯的＝6：4(v/v)不易挥发，增加了实验耗时和溶剂消耗。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法，缩短前处理时间、试剂用量少、缩短了仪器分析时间，能够快速准确简便的检测肉类中的瘦肉精。
本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
一种FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法，具体为：
建立前处理：称取肉类样品，加入盐酸溶液震荡，然后加入醋酸乙腈溶液震荡，再离心，萃取液于FaVEx快速过滤柱中过滤，移取过滤液氮吹至近干，定容后，形成样品溶液；所述样品与盐酸溶液的用量比为2g：1mL，样品与醋酸乙腈溶液的量比为2g：10mL；所述定容采用0.1甲酸水-甲醇(95:5)；
设置TD-ESI-MS条件：包括注射泵溶剂、注射泵流速、热解吸温度、雾化器压力、毛细管电压、干燥气温度和干燥气流速；所述注射泵溶剂为0.1％甲酸水溶液-甲醇(1:1，V:V)，注射泵流速为100～200μL/h，所述雾化器压力为1psi或3psi或5psi；
定性分析：将混合对照品溶液移取至探针表面取样环，探针插入加热管，高温解吸探针表面物质，待测物离子化，进入质谱仪检测分析；若样品溶液与对照品溶液具有相同的分子离子峰和碎片离子峰，且待测物的碎片离子丰度比与对照品溶液的离子丰度比相一致，样品中存在对照品中的化合物，即样品中含有瘦肉精；所述解吸温度为260-300℃。
进一步的，还包括半定量分析：移取混合标准中间溶液至肉类空白基质中，作为基质加标液，并进行前处理，取基质加标液和待测物于探针表面取样环，探针插入加热管，进入质谱仪检测分析，获取样品溶液的待测物浓度，确定样品中化合物的含量。
进一步的，所述注射泵流速为150μL/h，所述雾化器压力为3psi，所述解吸温度为280℃，所述盐酸溶液的浓度为0.05mol/L，所述醋酸乙腈溶液的浓度为1％。
本发明的有益效果为：本发明将FaVEx快速过滤柱和TD-ESI-MS/MS技术有效结合，建立了肉类中瘦肉精的快速分析方法，该方法不仅有效缩短了前处理时间，而且有机试剂用量少，废弃物少，对环境污染小；本发明缩短了仪器分析时间，不需要色谱分离，实时得到检测结果。本发明方法不仅快速、准确，而且兼顾简便、耐用和低成本的优势，适合肉类中瘦肉精的定性和半定量分析。
附图说明
图1为本发明所述热解吸-电喷雾离子源工作原理图；
图2为本发明中不同热解吸温度对响应强度的影响对比图，图2(a)为热解吸温度260℃b对响应强度的影响图，图2(b)为热解吸温度280℃对响应强度的影响图，图2(c)为热解吸温度300℃对响应强度的影响图；
图3为本发明中不同雾化器压力对响应强度的影响对比图，图3(a)为雾化器压力1psi对响应强度的影响图，图3(b)为雾化器压力3psi对响应强度的影响图，图3(c)为雾化器压力5psi对响应强度的影响图；
图4为本发明猪肉中4种β-受体激动剂重复性图谱，图4(a)为6个猪肉加标样品连续测定得到的总离子流图，图4(b)为莱克多巴胺的第一对碎片离子对的MRM谱图，图4(c)为莱克多巴胺的第二对碎片离子对的MRM谱图，图4(d)为沙丁胺醇的第一对碎片离子对的MRM谱图，图4(e)为沙丁胺醇的第二对碎片离子对的MRM谱图，图4(f)为特布他林的第一对碎片离子对的MRM谱图，图4(g)为特布他林的第二对碎片离子对的MRM谱图，图4(h)为克伦特罗的第一对碎片离子对的MRM谱图，图4(i)为克伦特罗的第二对碎片离子对的MRM谱图；
图5为本发明实际样品检测图谱，图5(a)为实际样品测定得到的总离子流图，图5(b)为实际样品含克伦特罗第一对碎片离子对的检测图，图5(c)为实际样品含克伦特罗第二对碎片离子对的检测图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明使用的仪器为：三重四极杆质谱仪采用美国Agilent公司的Ultivo三重四极杆质谱仪；热解吸-电喷雾离子源的生产商为山东国投鸿基检测技术股份有限公司；金属取样探针材质为镍铬合金，线径0.6mm，环直径2mm，总长5～6cm，伸出取样器的长度为4cm；样品称重利用瑞士Mettler Toledo公司的MS105DU电子天平。
本发明采用的对照品为：克伦特罗(纯度99.3％)、莱克多巴胺(纯度95.0％)、沙丁胺醇(纯度99.4％)和特布他林(纯度100.0％)，以上对照品均购置于德国Dr.Ehrensorfer公司。
一种FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法，本实施例以猪肉为例，详细描述该检测方法，具体包括如下步骤：
步骤(1)，快速前处理方法的建立
准确称取2g猪肉样品，首先加入0.05mol/L的盐酸溶液1mL、震荡5min，然后加入1％醋酸乙腈溶液10mL、震荡15min，再以1000r/min的速度离心5min后，移取5mL萃取液于FaVEx快速过滤柱中，待液体全部过滤后，移取2.5mL过滤液氮吹至近干，用0.1甲酸水-甲醇(95:5)定容至0.5mL，形成样品溶液，上机检测。
如表1所示，为本发明前处理方法与国标方法GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》的对比，本发明采用步骤(1)建立的前处理方法，仅需采用震荡器、离心机和氮吹仪，分别进行均质、离心和浓缩，无需固相萃取、PH调节和酶解，国标方法前处理约1-2天，本发明方法前处理可控制在1个小时，大幅度缩短了前处理时间，减少了前处理所需设备，节约实验成本。
表1国标方法与FaPEx-TD-ESI-MS/MS前处理及设备对比表
步骤(1)中消耗的试剂有0.05mol/L的盐酸溶液1mL、1％醋酸乙腈溶液10mL以及0.1甲酸水-甲醇(95:5)，相对于国标方法GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》消耗的试剂，本发明使用的试剂种类少，节约实验成本，是一种绿色、环保、高效的检测技术。表2为本发明方法与国标方法消耗试剂对比。
表2国标方法与FaPEx-TD-ESI-MS/MS消耗试剂对比表
步骤(2)，TD-ESI-MS条件设置
设置下列条件：注射泵溶剂为0.1％甲酸水溶液-甲醇(1:1，V:V)，注射泵流速为150μL/h，热解吸温度为280℃，雾化器压力为3psi，毛细管电压为+4.0kV/-4.0kV，干燥气温度为300℃，干燥气流速为3L/min。
上述注射泵溶剂的确定为：
对比2种注射泵溶剂水-甲醇(1:1，V:V)、0.1％甲酸水溶液-甲醇(1:1，V:V)对4种β-受体激动剂加合响应值的影响，发现0.1％甲酸水溶液-甲醇(1:1，V:V)作为注射泵溶剂时，4种β-受体激动剂的加合响应值最高，峰形最佳，故选择其作为注射泵溶剂。
上述注射泵流速的确定为：
0.1％甲酸水溶液-甲醇(1:1，V:V)通过外置注射泵进入电喷雾区域，促进待测物离子化，流速不适宜影响离子化的效率，流速设置范围通常为100～200μL/h。精密移取混合对照品溶液5μL，注射泵流速分别设置为100、150、200μL/h进行测定，连续检测3次，记录4种β-受体激动剂加合响应值。结果表明，当注射泵流速为100μL/h时，待测物离子化程度越充分，4种β-受体激动剂的加合响应值较高，但峰展宽较明显；当注射泵流速为200μL/h时，注射泵内溶剂单位时间内进入电喷雾区域的速度越高，待测物被溶剂吹散，离子化程度不充分，离子化效率降低，4种β-受体激动剂的加合响应值显著降低；当注射泵流速为150μL/h时，可以兼顾峰形与质谱响应强度，因此设置注射泵流速为150μL/h。
上述雾化器压力的确定为：
雾化器压力是影响待测物离子化的重要因素，雾化器压力过高，会将解吸附的气化物质吹散，实际进入毛细管的待测物减少，降低仪器灵敏度；雾化器压力过低，不能使全部待测物进入毛细管，也会使仪器灵敏度降低，因此选择适宜的雾化器压力至关重要。本发明设置雾化器压力为1、3、5psi，连续检测3次，对比不同雾化器压力对应的谱图，当雾化器压力为3psi时，峰形最好，质谱响应最高，因此设置本发明的雾化器压力为3psi，结果如图3(a)、(b)、(c)所示。
步骤(3)，定性分析
用移液器移取混合对照品溶液(1μg/mL)5μL于探针表面取样环，然后将探针插入加热管，采用高温加热的方式完成探针表面物质的解吸过程，通过电喷雾促进待测物离子化，最终进入三重四极杆质谱仪检测分析；按照同样的方法处理步骤(1)前处理定容后的样品溶液，若样品与溶液对照品溶液具有相同的分子离子峰和碎片离子峰，而且样品溶液的碎片离子丰度比与对照品溶液的离子丰度比相一致(相对丰度＞50％，允许±10％偏差；20％＜相对丰度≤50％，允许±15％偏差；10％＜相对丰度≤20％，允许±20％偏差；相对丰度≤10％，允许±50％偏差)，则可判断样品中存在对照品中的化合物，即样品中含有瘦肉精。热解吸-电喷雾离子源工作原理如图1所示。
上述混合对照品溶液的配置为：分别精密称取各对照品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇定容配制成质量浓度为1mg/mL的对照品单标溶液，再取各单标溶液1mL置于10mL容量瓶，配制成质量浓度为100μg/mL的混合标准中间液，移取混合标准中间液1mL置于100mL容量瓶，配制成质量浓度为1μg/mL的混合标准使用液，作为混合对照品溶液。
质谱条件为：正离子模式，干燥气温度为300℃，干燥气流速为3L/min，雾化器压力为34.5kPa(5psi)，毛细管电压为4000V。质谱仪采集的对照品参数见表3。
表3 4种β-受体激动剂的CAS号、化学式、离子信息、碎裂电压、碰撞能和极性信息
上述采用高温加热的方式完成探针表面物质的解吸过程，需确定热解吸温度，具体为：
不同物质具有不同的分子结构，分子结构的差异导致了热解吸行为的差异，因此依据待测物不同的分子结构选择最适宜的热解吸温度，以保证离子化效率最高是本发明的关键。精密移取混合对照品溶液5μL，对比热解吸温度在0～300℃范围4种β-受体激动剂峰面积的加合响应值，得到适宜的热解吸温度区间为260～300℃，以不同热解吸温度260、280、300℃连续检测3次，结果如图2(a)、(b)、(c)所示；不同热解吸温度下所显示的每个峰即一次进样的谱图，因为没有经过色谱分离，4种β-受体激动剂会在同一时间段出峰，每个峰包含4种待测物峰面积的加合响应值；温度越低，热解吸时间延长，峰展宽越明显，待测物被充分离子化，质谱响应越高；温度越高，热解吸时间缩短，峰形尖锐，但待测物未能被充分离子化。从图2中可以看出，质谱当热解吸温度为280℃时，可兼顾峰形和响应强度，故选择280℃为最适宜热解吸温度。
步骤(4)，半定量分析
用移液器移取100μg/mL混合标准中间溶液0.02mL至猪肉空白基质中，作为基质加标液，并按步骤(1)处理，取基质加标液和样品溶液各5μL于探针表面取样环，然后将探针插入加热管，进入三重四极杆质谱仪检测分析，连续测定3次，峰面积取3次测定平均值，单点法定量分析，获取样品溶液的待测物浓度，确定样品中化合物的含量；待测物浓度的计算公式为：
C样品＝C标品×(S样品/S标品)
其中：C样品为待测物浓度，C标品为混合对照品溶液浓度，S样品为待测物峰面积，S标品为混合对照品溶液峰面积。
本发明方法学验证包括：
(1)专属性试验
精密移取猪肉空白基质5mL置于探针表面取样环，将探针插入加热管热解吸，进而进入离子源电离并导入三重四极杆质谱检测器测定，考察空白基质对检测结果的干扰作用。结果显示空白基质均未检出4种β-受体激动剂，表明空白基质对检测结果无干扰，实验专属性强。
(2)检出限
将1.0μg/mL加标样品用本发明方法检测，结果表明，各化合物的色谱峰信噪比皆在10附近，可以此加标样品中各化合物浓度作为本发明方法的检出限。将此加标样品用国标色谱法检测，获得各药物的准确浓度作为本发明方法的检出限，得到4种β-受体激动剂的检出限均为0.5μg/kg。与现行的国标方法GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》相比，检出限相当，但是本发明方法操作更加简便，大幅度缩短时间和试剂消耗，能够满足现场快速筛查的要求。
(3)重复性
精密移取混合对照品溶液0.2mL，加入2g猪肉空白基质中，进行前处理，配制成4种β-受体激动剂的浓度均为100ng/mL的加标样品，平行试验6次，考察方法的重复性，结果见图4，其中图4(a)中显示6个峰为6个猪肉加标样品连续测定得到的总离子流图，图4(b)-(i)分别为总离子流图所对应的各碎片离子对的MRM谱图(碎片离子对信息见表3)，4种β-受体激动剂的加合响应值的平均值为14397，RSD为6.1～13.5％，说明本发明方法重复性良好。
(4)线性关系
称取2g猪肉空白基质，加入混合标准中间液(100μg/mL)2、20、200μL，进行样品前处理，配制成0.1μg/mL、1.0μg/mL和10.0μg/mL混合标准溶液，探针取样，进入TD-ESI-MS中实时分析。结果表明，如表4所示，加标浓度与色谱峰面积呈现正相关性，随加标溶液浓度的增加，样品检测的色谱峰面积也逐渐增加。
表4加标浓度与色谱峰面积的相关性
(5)实际样品检测
采用本发明方法对中国农业科学院提供的阳性样品进行检测，如图5(a)、(b)、(c)所示，检出非法添加β-受体激动剂克伦特罗，峰面积为235929，采用单点法定量分析，浓度约为0.68mg/kg。使用现行的国标方法GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》对该批次阳性样品进行结果验证，检出克伦特罗的浓度为1.05mg/kg，与快速筛查结果具有一致性，表明本发明方法可以作为市场监管前端的快速筛查方法。
本发明大幅度缩短了仪器分析时间，无需色谱分离，可实现实时检测。使用传统LC-MS分析4种β受体激动剂，由于色谱柱的差异一般一针需要8-20min，先进不同浓度标准溶液5-10针，再进样品。而使用本发明FaPEx-TD-ESI-MS/MS原位质谱技术，一次进样不到1min，若检出阳性样品，使用单点法定量分析。对比于胶体金法、酶联免疫法等快检方法，本发明能够定性定量分析，数据更准确可靠。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法，其特征在于：
建立前处理：称取肉类样品，加入盐酸溶液震荡，然后加入醋酸乙腈溶液震荡，再离心，萃取液于FaVEx快速过滤柱中过滤，移取过滤液氮吹至近干，定容后，形成样品溶液；所述样品与盐酸溶液的用量比为2g：1mL，样品与醋酸乙腈溶液的量比为2g：10mL；所述定容采用0.1甲酸水-甲醇(95:5)；
设置TD-ESI-MS条件：包括注射泵溶剂、注射泵流速、热解吸温度、雾化器压力、毛细管电压、干燥气温度和干燥气流速；所述注射泵溶剂为0.1％甲酸水溶液-甲醇(1:1，V:V)，注射泵流速为100～200μL/h，所述雾化器压力为1psi或3psi或5psi；
定性分析：将混合对照品溶液移取至探针表面取样环，探针插入加热管，高温解吸探针表面物质，待测物离子化，进入质谱仪检测分析；若样品溶液与对照品溶液具有相同的分子离子峰和碎片离子峰，且待测物的碎片离子丰度比与对照品溶液的离子丰度比相一致，样品中存在对照品中的化合物，即样品中含有瘦肉精；所述解吸温度为260-300℃。
2.根据权利要求1所述的FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测肉类中瘦肉精的方法，其特征在于，还包括半定量分析：移取混合标准中间溶液至肉类空白基质中，作为基质加标液，并进行前处理，取基质加标液和待测物于探针表面取样环，探针插入加热管，进入质谱仪检测分析，获取样品溶液的待测物浓度，确定样品中化合物的含量。
3.根据权利要求1所述的FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述注射泵流速为150μL/h。
4.根据权利要求1所述的FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述雾化器压力为3psi。
5.根据权利要求1所述的FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述解吸温度为280℃。
6.根据权利要求1所述的FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述盐酸溶液的浓度为0.05mol/L。
7.根据权利要求1所述的FaPEx-TD-ESI-MS/MS快速检测猪肉中瘦肉精的方法，其特征在于，所述醋酸乙腈溶液的浓度为1％。
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