CN112029820A - 一种抗羟苯磺酸钙干扰的肌酐含量检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种抗羟苯磺酸钙干扰的肌酐含量检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于肌酐生化诊断技术领域，涉及一种抗羟苯磺酸钙药物干扰的人血清中肌酐含量检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒中包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含：肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、以及ESPMT；R2试剂包含：肌酐胺基水解酶、过氧化物酶、4‑氨基安替比林。本发明提供的检测试剂盒可以消除羟苯磺酸钙对过氧化氢的影响，使得试剂盒最终的显色反应不受影响，从而实现了提高肌酐检测试剂盒准确性、增加试剂盒的稳定性。

Description

一种抗羟苯磺酸钙干扰的肌酐含量检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于肌酐生化检测技术领域，涉及一种抗羟苯磺酸钙干扰的肌酐含量检测试剂盒及其应用。
背景技术
肌酐(Serum creatinine，CREA)，是肌酸的终末代谢物。血浆肌酐浓度和尿中肌酐排泄量，正常时主要与体内肌肉总量关系密切。肝脏疾病时，肌酐合成减少，则尿中肌酐排泄量可减少。肌酐为小分子物质，可以顺利通过肾小球滤过。因此，血浆肌酐浓度与尿液肌酐排泄量是肾小球滤过功能的有用指标。
目前临床上对人体血清肌酐的检测主要是通过肌酐检测试剂盒来检测，而市场上售卖的肌酐检测试剂盒通常使用的是肌氨酸氧化酶法测定，肌酐肌氨酸氧化酶法试剂盒的主要反应原理大都基于Trinder反应模式，具体反应过程如下：
肌酐+H2O+肌酐胺基水解酶→肌酸
肌酸+H2O+肌酸脒基水解酶→肌氨酸+尿素
肌氨酸+H2O+O2+肌氨酸氧化酶→甘氨酸+HCHO+H2O2
2H2O2+4-氨基安替比林+*ESPMT+过氧化物酶→醌亚胺+4H2O
*ESPMT：N-乙基-N-磺丙基-间-甲苯胺(TOPS)。
但是，酶法测定肌酐的试剂盒存在以下问题：生成的H2O2会与样本中的羟苯磺酸钙迅速发生反应，消耗一部分H2O2，这样就导致H2O2在过氧化物酶的催化下与4-氨基安替比林和TOPS反应生成红色醌亚胺化合物减少，而红色醌亚胺化合物的生成量与样本中的肌酐的含量呈正比，通过测定红色醌亚胺化合物的吸光度即可得到样品中肌酐的浓度，由此测定的肌酐浓度也相应的减少，有可能造成假阴性的结果，对病情的判断带来失误。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗羟苯磺酸钙药物干扰的肌酐含量检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒中添加葡萄糖，使之先氧化产生H2O2，可以消除羟苯磺酸钙对过氧化氢的影响，使得试剂盒最终的显色反应不受影响，从而实现了提高肌酐检测试剂盒准确性、增加试剂盒的稳定性。
第一方面，本发明提供了一种抗羟苯磺酸钙药物干扰的肌酐含量检测试剂盒，所述检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包括肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、ESPMT(TOPS)及葡萄糖。
基于上述技术方案，本发明在现有技术的肌酐检测试剂盒中独创性的在R1试剂中添加葡萄糖及葡萄糖氧化酶，通过在R1试剂中加入葡萄糖，使得葡萄糖能够先氧化产生H2O2与样本中的羟苯磺酸钙发生反应，使羟苯磺酸钙失去干扰酶法肌酐检测的作用，提升肌氨酸氧化酶法检测的准确性。
本发明还可以针对上述技术方案做进一步改进，具体改进如下，
进一步地，所述R1试剂中各个物质的浓度为：
Figure BDA0002669775530000021
采用上述技术方案，进一步明确了R1试剂中各个物质的浓度，在检测过程中能够充分消耗病人血清中的羟苯磺酸钙，有效减少羟苯磺酸钙干扰酶法肌酐检测的作用，提升肌氨酸氧化酶法检测的准确性。
进一步地，所述R2试剂包括肌酐胺基水解酶、过氧化物酶及4-氨基安替比林。采用该技术方案，可以基于Trinder反应模式，快速实现血清中肌酐含量的检测。
进一步地，所述R2试剂中各物质的浓度为：
肌酐胺基水解酶 ≥400KU/L；
过氧化物酶 ≥50KU/L；
4-氨基安替比林 ≥2.95mmol/L。
进一步地，所述R1试剂和R2试剂中还分别包括缓冲液和防腐剂，所述防腐剂的质量百分比为1％～20％，所述R1试剂中所述缓冲液的浓度为10～100mmol/L。
进一步地，所述试剂盒中R1试剂和R2试剂的体积比是3:1。
进一步地，所述R1试剂的pH值为7.2-7.5，优选为7.4。葡萄糖氧化酶最适温度30-50℃，最适pH值为5.0，在Ph＝8.0以上或pH＝3.0以下失活很快(40℃，处理2小时)，葡萄糖是该酶的稳定剂，肌酐酶法测定试剂盒R1试剂PH值7.4，葡萄糖氧化酶在此环境中能稳定存在。
第二方面，本发明还提供了所述肌酐含量检测试剂盒的应用，具体地，在检测的过程中以全自动日立生化分析仪7100为例。主波长为546nm(或附近)；副波长800nm(或附近)；吸光度范围0～3.2A；比色杯光径为1.0cm。
步骤S1:J将R1试剂加入待检测样本中，混匀，置37℃孵育5分钟，读取第一次吸光度(A1)；
步骤S2：再加入R2试剂，混匀，37℃孵育约5分钟，然后以纯化水校零，在波长546nm处比色，读取各管吸光度(A2)；
步骤S3：采用Linear 2点校准曲线定标法。以空白样本定值为
0.00μmol/L，对校准品测定相应的△A，以△A为Y轴，浓度为X轴。在自动分析仪上，采用Linear 2点建立校准曲线。
步骤S4：样品中肌酐浓度计算：
Figure BDA0002669775530000041
Figure BDA0002669775530000042
Figure BDA0002669775530000043
本发明相对于现有技术具有的技术效果：
本发明在原有未加葡萄糖的酶法测定试剂盒R1试剂基础上加入葡萄糖及葡萄糖氧化酶，使葡萄糖在37℃反应杯中发生氧化反应产生H2O2，先将样本中存在的羟苯磺酸钙反应掉，即可阻止羟苯磺酸钙与肌酐产生的H2O2反应，同时R1中过氧化氢酶会将剩余的H2O2反应掉。这样便消除羟苯磺酸钙对过氧化氢的影响，使得试剂盒最终的显色反应不受影响，从而实现了提高肌酐检测试剂盒准确性、增加试剂盒稳定性的目的。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
实施例1
本发明试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂主要成分包含：肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、以及ESPMT；R2试剂包含：肌酐胺基水解酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林。
其中，R1试剂中各物质的浓度如下：
Figure BDA0002669775530000051
其中，R2试剂中各物质的浓度如下：
肌酐胺基水解酶 ≥400KU/L；
过氧化物酶 ≥50KU/L；
4-氨基安替比林 ≥2.95mmol/L。
其中，R1试剂与R2试剂的体积比为3:1。
实施例2
与实施例1区别的是本实施例中还包含防腐剂，具体为，本发明试剂盒包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含：肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、以及ESPMT、缓冲液；R2试剂包含：肌酐胺基水解酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林及缓冲液。
其中，R1试剂中各物质的浓度如下：
Figure BDA0002669775530000052
Figure BDA0002669775530000061
其中，R2试剂中各物质的浓度如下：
Figure BDA0002669775530000062
其中，R1试剂与R2试剂的体积比为3:1。
实施例3
采用本发明实施例1或实施例2的试剂盒检测样品中肌酐的步骤如下：
其中，在检测的过程中以全自动日立生化分析仪7180为例。主波长为546nm(或附近)；副波长800nm(或附近)；吸光度范围0～3.2A；比色杯光径为1.0cm。试剂加样比见表1：
表1各个试剂加样比
Figure BDA0002669775530000063
Figure BDA0002669775530000071
本试剂盒默认单位为：μmol/L。
校准曲线的绘制：采用Linear 2点校准曲线定标法。以空白样本定值为0.00μmol/L，对校准品测定相应的△A，以△A为Y轴，浓度为X轴。在自动分析仪上，采用Linear 2点建立校准曲线。计算时根据样本的△A值在校准曲线上找到相应的浓度。
样品中肌酐浓度按下述公式计算：
Figure BDA0002669775530000072
Figure BDA0002669775530000073
注意事项：
1：试剂和样本用量可以按仪器要求进行增减。
2：如果样本是尿液，应按1:100的比例稀释，结果乘以100。
实施例4
为了验证发明的试剂盒与市售的肌酐测定试剂盒抗羟苯磺酸钙的能力，最好的方法是使用在售试剂盒进行验证。
其中，两种试剂盒分别为：市售的未加葡萄糖及葡萄糖氧化酶的酶法测定试剂盒(其余成分与实施例2相同)、本发明实施例2中加葡萄糖的酶法测定试剂盒。市售的未加葡萄糖与葡萄糖氧化酶的酶法试剂盒的参考范围是健康成年人：59-104μmol/L(男性)；45-84μmol/L(女性)，本发明实施方式中试剂盒的参考范围是健康成年人：59-104μmol/L(男性)；45-84μmol/L(女性)。
标本来源：配制两组不同血清基质羟苯磺酸钙高值样本稀释成不同梯度，血清基质的选择：为医院收集正常人血清样本。
两组试剂盒同时检测两组不同血清基质羟苯磺酸钙高值样本稀释后的不同浓度羟苯磺酸钙样本，检测结果如表2所示：
表2两组试剂盒检测样本结果
Figure BDA0002669775530000081
通过对表2中检测结果的统计分析，结果如表3所示：
表3两组试剂盒检测偏差分析结果
Figure BDA0002669775530000082
Figure BDA0002669775530000091
通过上述实验，本实施方式中的酶法肌酐测定试剂盒与市售的未加葡萄糖的酶法肌酐检测试剂盒相比，其检测结果偏差明显降低，说明其抗羟苯磺酸钙能力明显增强，由此可以说明未加葡萄糖的试剂盒中在检测反应的过程中产生的过氧化氢与人血样本中的羟苯磺酸钙反应被消耗，使得过氧化氢与4-氨基安替比林和TOPS反应生成的红色醌亚胺化合物的量减少，导致结果偏低而造成假阴性。而本发明的检测试剂盒，在检测过程中加入葡萄糖之后，葡萄糖通过氧化反应产生过氧化氢与样本中的羟苯磺酸钙反应，消除了样本中的羟苯磺酸钙对过氧化氢产生的影响，使假阴性率明显降低，从而实现了提高肌酐酶法检测试剂盒准确性、增加试剂盒稳定性的目的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (10)

1.一种抗羟苯磺酸钙干扰的肌酐含量检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包括肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、ESPMT及葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中各个物质的浓度为：
Figure FDA0002669775520000011
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂包括肌酐胺基水解酶、过氧化物酶及4-氨基安替比林。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中各物质的浓度为：
肌酐胺基水解酶 ≥400KU/L；
过氧化物酶 ≥50KU/L；
4-氨基安替比林 ≥2.95mmol/L。
5.根据权利要求1-4任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂和R2试剂中还分别包括缓冲液和防腐剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂的质量百分比为1％～20％。
7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中所述缓冲液的浓度为10～100mmol/L。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中R1试剂和R2试剂的体积比是3:1。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的pH值为7.2-7.5。
10.根据权利要求19所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的pH值为7.4。
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