CN112028810B

CN112028810B - 一种汞离子探针的制备方法及应用

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Publication number: CN112028810B
Application number: CN201910669995.3A
Authority: CN
Inventors: 张雨薇; 柯博文; 齐庆蓉; 康婷
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-07-23
Filing date: 2019-07-23
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2039-07-23
Also published as: CN112028810A

Abstract

本发明设计一种具有高灵敏性可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针的制备方法和应用，荧光探针的结构为：

制备方法包括：将4‑乙烯氧基‑1，3‑苯二醛溶于乙酸酐中形成溶液，加入季铵盐，即得目标产物可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针。本发明为近红外荧光探针，对于Hg(II)的检测具有选择性好，灵敏度高，细胞毒性低的性质，且制备简单，成本低，可应用于体外与体内检测，在分析化学、生物化学和环境治理与监控及医学的领域有较好的应用前景。

Description

一种汞离子探针的制备方法及应用

技术领域：

本发明属于荧光探针材料的制备方法和应用领域，特别涉及到一种具有高灵敏性可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

在20世纪50年代发生水俣湾汞中毒事件之前，汞污染并不被认为是重要的环境问题。作为环境中天然存在的元素，汞来自各种自然过程，例如火山，温泉，海洋排放和岩石风化等。几个世纪以来的采矿和废物处理等人为活动加剧了本已经严重的汞污染，并对生态系统和人类健康构成了巨大的威胁。人类接触汞的主要来源是牙科用汞合金，药品，化妆品和食品，主要是受污染的鱼类。汞和汞离子与生物分子的亲核官能团的高度结合可导致功能的扰动，包括DNA损伤，有丝分裂损伤和神经元迁移破坏。汞也被认为是一种有效的免疫刺激和抑制剂，取决于接触剂量和个体易感性，产生许多病理后遗症，包括淋巴细胞增生，高球蛋白血症和全身全身性和低反应性。已经认识到多种疾病与汞密切相关，并会对其有不利影响，包括免疫毒性，遗传毒性，致癌性以及致畸性等。饮食中的汞摄入量和汞的环境暴露会导致心律失常，口腔炎，胃炎，结肠炎，肾小管变性以及出血性胃炎。汞的积累也与认知和运动障碍有关。

所以汞积累与人类健康之间具有密不可分的相关性，建立可信且快速的检测不同环境背景下汞物种和复杂生物系统的战略，可以大大促进对汞污染后果的了解，并有助于找到适当的补救措施。当前，常见的Hg(II)的检测方法有原子吸收/发射光谱(AAS/AES)，原子荧光光谱(AFS)，气相色谱，电化学方法，电感等离子耦合-质谱，核磁共振等，传统的检测方法需要复杂的程序和昂贵的仪器，而且又不能连续的监测并对生物系统的检测有缺陷。所以传统的方法已经不能满足，我们需要新的检测方法。

发明内容：

本发明中，Hg(II)等同于“Hg²⁺”。

本发明的目的之一在于提供一种具有高灵敏性可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针。

本发明的目的之二在于提供一种具有高灵敏性可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针的制备方法，以规避此类探针传统合成复杂、难以纯化的问题。

本发明的目的之三在于提供一种具有高灵敏性可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针的应用，包括其在细胞水平可视化分析Hg(II)水平方面的应用，以解决其他Hg(II)近红外探针的灵敏性不够高或由于选择性不够好难以对细胞环境，或者细胞毒性较高难以应用于生物体系中Hg(II)特异性响应等问题。

本发明的技术方案包括：

一种具有高灵敏性可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如图1所示；其中X为卤素，优选地，X为Br。

一种前述探针的制备方法，它是将4-乙烯氧基-1，3-苯二醛与季铵盐于有机溶剂中反应，纯化所述探针，即得；

所述季铵盐的结构式为：

其中X为卤素；

所述有机溶剂是醇类、酸类、酯类、乙酸酐、乙腈、二氯甲烷或丙酮，优选为乙酸酐。

如前述的制备方法，4-乙烯氧基-1，3-苯二醛与季铵盐的摩尔比为1∶(1～3)。

如前述的制备方法，4-乙烯氧基-1，3-苯二醛与季铵盐的制备方法中的反应温度为20～50℃。

如前述的制备方法，4-乙烯氧基-1，3-苯二醛与季铵盐的反应时间为3～8h。

如前述的制备方法，纯化所述探针的步骤包括：

1)抽滤，滤饼用丙酮洗涤至无色，减压浓缩；

2)加入异丙醚，弃去上清液，得粘稠状物质；

3)用二氯甲烷溶解粘稠状物质，蒸馏水萃取，减压浓缩；

4)加入乙酸乙酯，析出黄色絮状物质，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤一次，干燥。

如前述的制备方法，步骤4)所述干燥为45-60℃下真空干燥。

前述探针在检测Hg(II)中的用途。

前述探针在制备Hg(II)检测试剂中的用途。

本发明具有如下有益效果：

本发明的荧光探针的自身的荧光很弱，溶于5％DMSO水中后与汞离子结合，产生强烈的荧光，在汞离子条件下，经过波长为560nm的可见光激发，在715nm波长处荧光信号显著增强，通过记录荧光强度即可检测汞离子浓度。所述的荧光强度与汞离子浓度(2.5μM-50μM范围内)成良好的线性关系。

本发明的灵敏度极高，检测限为≥5nM。

本发明的抗干扰能力强，在等浓度Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Co³⁺、Ni³⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Na⁺、K⁺等离子存在的情况下，Hg²⁺检测信号几乎不会衰减；Fe³⁺会对Hg²⁺检测有一定的干扰作用，但干扰作用不强。

本发明的选择性强，几乎不会对Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Co³⁺、Ni³⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cd² ⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Na⁺、K⁺等离子产生阳性信号。

本发明还具有很低的细胞毒性，用MTT法检测该探针在细胞内的IC₅₀≥200μM，可用于活细胞内的Hg(II)可视化分析。

基于上述效果，本发明在分析化学、生物化学和环境治理与监控及医学的领域有较好的应用前景。

附图说明：

图1为本发明探针的化学结构式；其中X为Br。

图2为本发明探针合成路线示意图。

图3为实施例2中荧光探针加入汞离子前后和随时间变化的紫外变化图谱。

图4为实施例2中荧光探针的溶液5％DMSO水(50μM)加入汞离子溶液(50μM)的荧光3D谱图(激发、发射和荧光信号)。

图5为实施例3中Hg²⁺探针对不同金属离子选择干扰新实验的荧光谱图。

图6为实施例4中Hg²⁺探针对Hg²⁺的选择性实验；metal Ions，汞离子以外的其它金属离子。

图7为实施例4中Hg²⁺探针的荧光强度与时间的关系测定。

图8为实施例5中Hg²⁺探针荧光强度与Hg²⁺浓度的关系测定及线性研究。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将4-6g 4-羟基-1，3-苯二醛溶于100ml乙腈中，加入50-60g 1，3-二溴丙烷和7.36-7.65g碳酸钾，室温条件下搅拌均匀后，抽真空并氮气保护，置于6-80℃条件下搅拌回流反应10-14h，用薄层层析硅胶板以乙腈与丙酮体积比为10：1～5：1的混合溶剂为展开剂对反应进程进行监测，反应结束后冷却至室温，抽滤，滤饼用乙腈50ml*3洗涤三次，合并滤液减压浓缩得4-溴乙氧基-1，3-苯二醛4.0-4.5g，产率：58.39-60.22％。

(2)将4-6g 4-溴乙氧基-1，3-苯二醛溶于20-25mL的DMSO中，室温条件下搅拌溶解后，将0.87-1.02g叔丁醇钾溶于20-30mL的DMSO中，再分次(少量多次)加入上述溶液中，加入完毕后在室温条件下搅拌反应24-30h，TLC(环己烷：乙酸乙酯＝3∶1)监测反应进行。反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，用乙酸乙酯50ml*3萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得橘红色液体，过柱纯化得4-乙烯氧基-1，3-苯二醛0.38-0.44g，产率：14-18％。

(3)将0.1-0.2g(0.6-1.2mmol)4-乙烯氧基-1，3-苯二醛溶于4-6mL乙酸酐中，再向其中加入0.4-0.6g(1.4-2.1mmol)季铵盐，在室温(20-50℃)条件下搅拌反应3-8h，用薄层层析硅胶板以二氯甲烷和甲醇体积比为20∶1～10∶1的混合溶剂问展开剂对反应进程进行监测。反应结束后，抽滤，滤饼用丙酮洗涤至无色，滤液减压浓缩至液体不再减少，向其中加入异丙醚，倾倒出上清液，所得粘稠状物质用15-20ml DCM溶解后，用蒸馏水20ml*3萃取三次，合并有机相并减压浓缩至少量液体，向其中加入20ml乙酸乙酯，析出黄色絮状物质，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤一次，45-60℃真空干燥得目标产物近红外荧光探针0.22-0.28g，产率：55-60％。

对所得光学探针进行质谱、核磁表征，结果如下：

质谱：MS(ESI)m/z：704.18[M+H]⁺；

核磁氢谱：¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.76(s，1H)，8.84-8.58(m，3H)，8.30(d，J＝16.4Hz，1H)，8.15-8.03(m，3H)，8.01-7.89(m，2H)，7.77-7.63(m，4H)，7.58(d，J＝7.2Hz，2H)，7.01(d，J＝7.2Hz，2H)，5.47(s，2H)，4.97(s，2H)，4.84(s，2H)，1.95(s，6H)，1.93-1.85(m，4H)，1.80(s，6H)，1.18-1.06(m，4H)；

核磁碳谱：¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ183.71，182.71，159.87，155.06，147.83，145.87，144.51，143.64，140.57，139.74，135.20，130.67，130.27，129.80，129.71，129.23，123.70，123.02，116.38，114.86，114.61，114.38，113.31，100.25，53.00，52.57，49.72，49.31，27.42，27.06，22.78，22.61，11.24，11.17。

本发明的一种可特异性高灵敏识别Hg(II)的近红外荧光探针结构如图1所示。

实施例2

利用实施例1中的一种具有高灵敏性可特异性识别Hg(II)的近红外荧光探针对溶液中的汞离子进行检测，具体步骤如下：配制50μM的汞离子待测溶液，应用实施例1中合成的近红外荧光探针检测其中的汞离子，具体步骤为：

步骤1：将实施例1中合成的近红外荧光探针和HgCl2用5％DMSO水配制成浓度为50μM的溶液。

步骤2：将2mL探针溶液(50μM)分别与2mLHgCl2溶液(50μM)混合，37℃恒温孵育，在特定的时间梯度用紫外可见光光度计检测吸光度。

步骤3：将2mL探针溶液(50μM)与2mL HgCl₂溶液(50μM)混合，37℃恒温孵育60min，用分子荧光仪测定3D荧光谱图。

图3表明在5％DMSO水中探针分子本身在405nm处有较好的吸收峰，随着探针和Hg²⁺反应后，在575nm处出现新的吸收峰，并且405nm处的吸收峰逐渐降低，575nm处出现新的吸收峰逐渐升高。

图4表明在5％DMSO水中探针和汞离子充分反应后，在560nm为激发光，705nm为发射光条件下有较高的荧光信号。

实施例3

做Hg²⁺对实施例1中荧光探针的干扰实验，对常见的金属离子进行干扰测试。

具体步骤为：分别将2ml 100μM汞离子溶液与2ml 100μM的Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Co³ ⁺、Ni³⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Na⁺、K⁺、Hg²⁺离子溶液混合的混合液A，再取2ml混合A与2ml 50μM荧光探针溶液混合，在激发波长为560nm条件，检测发射波长为705mm的荧光强度(见图5)。

实验结果表明：荧光探针中其他金属离子对Hg²⁺的干扰较小，只有Fe³⁺、Cr³⁺导致荧光强度减弱，说明本发明荧光探针对Hg²⁺的检测具有较好的特异性。

实施例4

做实施例1中荧光探针对Hg²⁺的选择性实验，对常见的金属离子进行选择性测试。

具体步骤为：分别将2ml 50μM荧光探针溶液与2ml 50μM的Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Co³ ⁺、Ni³⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Na⁺、K⁺、Hg²⁺离子溶液混合，在激发波长为560nm条件下，检测发射波长为705nm的荧光强度(见图6)。

实验结果表明：荧光探针对重金属Hg²⁺具有专一的选择性和较好的灵敏性。

实施例5

做Hg²⁺对荧光探针的时间依赖性实验，将荧光探针溶于5％DMSO水中，配制成50μM荧光探针溶液，用5％DMSO水将HgCl₂配制成浓度为50μM的Hg²⁺金属离子溶液，进行时间依赖性实验。

具体步骤：将2mL 50μM荧光探针溶液和2mL 50μM HgCl₂溶液混合37℃恒温孵育，在特定的时间梯度，用分子荧光仪在激发波长为560nm条件下，检测发射波长为705nm的荧光强度(见图7)。

实验结果表明：荧光探针对重金属Hg²⁺反应在120min荧光强度达到最大值并趋于稳定，表达了荧光探针在较快的时间内可以检测到重金属Hg²⁺。

实施例6

做Hg²⁺对荧光探针的浓度依赖性(线性)实验，将荧光探针溶于5％DMSO水中，配制成50μM荧光探针溶液，用5％DMSO水将HgCl₂配制成不同浓度的Hg²⁺金属离子溶液，进行浓度依赖性(线性)实验。

具体步骤：将2mL 50μM荧光探针溶液和2mL不同浓度的HgCl₂溶液混合37℃恒温孵育120min，用分子荧光仪在激发波长为560nm条件下，检测发射波长为705nm的荧光强度(见图8)。

实验结果表明：检测Hg²⁺在2.5μM-50μM的范围内有一个较好的线性，且检测限为≥5nM，这说明本探针对于Hg(II)具有较高的灵敏性。

综上，本发明的探针具有良好的特异性、抗干扰能力和灵敏度，在产业上具有良好的应用前景。

Claims

1.一种近红外荧光探针在检测Hg(II)中的用途，所述近红外荧光探针的结构式为：

；

其中X为卤素；所述用途是非疾病治疗目的或者非疾病诊断目的的用途。

2.一种近红外荧光探针在制备Hg（II）检测试剂中的用途，所述近红外荧光探针的结构式为：

；

其中X为卤素。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，X为Br。

4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述近红外荧光探针的制备方法是将4-乙烯氧基-1,3-苯二醛与季铵盐于有机溶剂中反应，纯化所述探针，即得；

所述季铵盐的结构式为：

，其中X为卤素；

所述有机溶剂是醇类、酸类、酯类、乙酸酐、环己烷、二氯甲烷或丙酮。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述有机溶剂是乙酸酐。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，4-乙烯氧基-1,3-苯二醛与季铵盐的摩尔比为1 : ( 1~3)。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，4-乙烯氧基-1,3-苯二醛与季铵盐于有机溶剂中反应温度为20~50 ˚C。

8.如权利要求4所述的用途，其特征在于，4-乙烯氧基-1,3-苯二醛与季铵盐于有机溶剂中反应时间为3~8 h。

9.如权利要求4所述的用途，其特征在于，纯化所述探针的步骤包括：

1）抽滤，滤饼用丙酮洗涤至无色，减压浓缩；

2）加入异丙醚，弃去上清液，得粘稠状物质；

3）用二氯甲烷溶解粘稠状物质，蒸馏水萃取，减压浓缩；

4）加入乙酸乙酯，析出黄色絮状物质，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤一次，干燥。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，步骤4）所述干燥为45-60 ℃下真空干燥。