CN112021178B - 一种利用多壁碳纳米管促进桫椤孢子萌发的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用多壁碳纳米管促进桫椤孢子萌发的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)以桫椤孢子为外植体，进行表面灭菌，获得无菌孢子悬浮液；2)将无菌孢子悬浮液无菌播种于孢子萌发培养基上，所述孢子萌发培养基含有25～100mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。本发明可以使蕨类植物孢子的萌发速度加快，萌发率提高，萌发周期缩短，同时不影响后续生长发育。在蕨类植物离体培养体系中使用本发明方法，原来达到90％萌发率所需萌发时间为15天以上，经缩短为11天，时间缩短了27％。在优选浓度下，孢子发育正常，未发现孢子假根扭曲或膨大现象。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种适合蕨类植物孢子离体萌发的方法。
背景技术
蕨类植物通过孢子萌发形成可独立生活的配子体，配子体能够产生精子器和颈卵器，进而通过受精作用形成新的孢子体。孢子萌发是蕨类植物生活史过程中配子体世代向孢子体世代转变的关键步骤。然而，蕨类植物的孢子成熟时间不定，成熟后迅速飘散，野外采集不易，孢子寿命短，自然环境下萌发率低，且萌发和生长极易受生长环境的干扰。离体培养技术因具有不受环境、时间等外界因素的影响和高效等特点，被广泛用于植物的组培快繁和相关研究中。在无菌条件下播种孢子，研究孢子萌发及其后的生长发育对于蕨类植物的繁殖和培育具有重要意义。通常，蕨类植物孢子从消毒接种到形成配子体需要至少两个月时间。因此，缩短孢子萌发时间、提高生长速度，是蕨类植物离体培养中亟需解决的问题。目前，在离体条件下提高孢子萌发率的尝试主要集中在改善培养基成分(尤其是植物生长调节剂)和培养条件(如温度、光暗条件)等方面。
种子萌发和孢子萌发分别作为种子植物和孢子植物进行生命活动的起点，在整个植物生活史中起着重要作用。研究发现，适宜浓度的纳米材料可以明显促进种子萌发，缩短种子萌发时间。多壁碳纳米管(MWCNTs)是一种应用前景极广的纳米材料，在许多实验中发现，MWCNTs可以渗透进入种皮进而刺激种子萌发，且多表现为促进种子对水分的吸收、加快萌发进程以及提高发芽率。然而，纳米材料对蕨类植物孢子萌发是否有促进作用尚未见报道。专利《一种纳米银灭菌槲蕨孢子的方法》公布了无菌培养条件下利用纳米银溶液和次氯酸钠溶液对槲蕨孢子灭菌的无菌播种方法，该专利是目前唯一将纳米技术应用到蕨类植物离体培养中的报道。
纳米材料以独特的结构和理化特点，得到了广泛研究和应用。然而其在环境中的释放也不可避免，其对生态环境的潜在影响和风险引起各界的广泛关注。因此，在充分挖掘利用纳米材料的同时,了解纳米材料对生物体的影响已经成为一个研究热点。植物是生态系统的重要组成部分，揭示纳米材料对植物生长发育的影响及其机理是十分必要的。纳米材料对植物生长的影响已有很多报道，但至今缺少一种简单易行的检测评估方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种可以促进蕨类植物孢子萌发的离体培养方法。
本发明的方法包括如下步骤：配置含有多壁碳纳米管 (MWCNTs)的培养基；对蕨类植物孢子进行表面消毒灭菌；将灭菌后的孢子均匀播种至培养基中；置于培养室中培养；定期在光学显微镜下观察记录孢子萌发情况及假根形态。
本发明提供一种基于多壁碳纳米管(MWCNTs)的促进蕨类植物孢子萌发的离体培养方法，该发明可以提高蕨类植物孢子萌发率，缩短孢子萌发时间，为优化蕨类植物的离体培养技术、缩短繁育周期、降低成本提供了一种新方案。此外，本发明还提供一种通过观察假根形态检验纳米材料对蕨类植物潜在影响的方法，可为更加合理的开发和使用纳米材料提供技术参考。
本发明提供一种利用多壁碳纳米管促进桫椤孢子萌发的方法，其包括如下步骤：
1)以桫椤孢子为外植体，进行表面灭菌，获得无菌孢子悬浮液；
2)将无菌孢子悬浮液无菌播种于孢子萌发培养基上，所述孢子萌发培养基含有25～100mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。
其中，所述孢子萌发培养基含有25～100mg/L的多壁碳纳米管 (MWCNTs)，优选含有50mg/L的多壁碳纳米管(MWCNTs)。
其中，所述孢子萌发培养基为以1/2MS为基本培养基的固体培养基。
在本发明一个实施方案中，孢子无菌播种方法优选为：在充分冷却凝固的萌发培养基中加入少量无菌水使培养基表面润滑，吸取孢子悬浮液均匀接种于培养基上，先黑暗培养24h，再光照培养，使孢子能够同步萌发。
在本发明一个实施方案中，孢子的灭菌方法优选为：称取20mg 成熟孢子置于1.5mL无菌离心管中，加入无菌水冲洗1-3遍，然后滴入1mL 5％NaClO溶液，振荡混匀，灭菌5～7分钟，无菌水冲洗 3～5次，最后加入1mL无菌水，获得无菌的孢子悬浮液。
其中，培养室条件为：温度25±1℃，光照强度为50～60 μmoL/(m2·s)，光周期为16/8h，湿度为30％。
本发明还提供一种评估纳米材料对蕨类植物潜在影响的方法，在蕨类孢子萌发过程中向蕨类孢子施用纳米材料，观察孢子的假根形态是否发生了扭曲或者顶端膨大，发育正常的假根呈长直的管状，受到纳米材料胁迫的假根发生扭曲或者顶端膨大。
蕨类植物孢子－配子体的发育过程极易受环境影响，虽然高浓度 MWCNTs提高了假根生长速度，但使形态发生异常，表明所处环境中存在不利生长的因素。
本发明可以使蕨类植物孢子的萌发速度加快，萌发率提高，萌发周期缩短，同时不影响后续生长发育。在蕨类植物离体培养体系中使用本发明方法，原来达到90％萌发率所需萌发时间为15天以上，经本方法后，萌发时间缩短为11天，时间缩短了27％。在优选浓度下，孢子发育正常，未发现孢子假根扭曲或膨大现象。同时本发明利用蕨类植物孢子检测环境中纳米材料的潜在影响的方法具有操作简便、结果可靠的特点，由于孢子假根为单细胞，对环境影响反应快速，且假根形态可在显微镜下清晰的观察到，无需检验其它生理生化指标，节约了时间和成本。
附图说明
图1所示为不同浓度MWCNTs对中华桫椤孢子假根形态的影响。
图2所示为MWCNTs对中华桫椤孢子相对含水量的影响。
图3所示为MWCNTs对中华桫椤孢子假根长度的影响。
图4所示为MWCNTs对中华桫椤孢子丝状体细胞分裂的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验材料：中华桫椤(Alsophila costularis Baker)成熟孢子。
试剂：MS粉、MWCNTs粉末、次氯酸钠、琼脂、蒸馏水等。
仪器设备：超净工作台、超声波清洗仪、一次性塑料培养皿、移液枪、滴管、1.5mL离心管等；
基本培养基：以1/2MS为基本培养基，添加7g/L琼脂，高压灭菌前调pH值为5.8～5.9；
孢子灭菌：称取20mg成熟孢子置于1.5mL无菌离心管中，加入无菌水冲洗1遍，然后滴入1mL 5％NaClO溶液，振荡混匀，灭菌5分钟，无菌水冲洗3-5次，最后加入1mL无菌水，获得无菌的孢子悬浮液；
MWCNTs悬浮液的制备：将MWCNTs粉末置于无菌水中，在 40kHz的超声波清洗仪中超声30分钟，得到MWCNTs悬浮液在超净工作台下进行无菌过滤，得到MWCNTs无菌悬浮液母液；
孢子的无菌播种：在充分冷却凝固的萌发培养基中加入少量无菌水使培养基表面润滑，吸取孢子悬浮液100μL均匀接种于培养基上；先在黑暗处放置24h，再放回正常光照条件下使孢子能够同步萌发。分别于接种后第7天、第9天、第11天和第13天时观察统计孢子萌发率，观察孢子萌发情况和假根形态；
培养室条件：温度25±1℃，光照强度50～60μmoL/(m2·s)，光周期16/8h，湿度30％；
孢子萌发率的统计：向培养皿中加入少量无菌水，轻轻晃动培养皿，使孢子脱离培养基表面，形成悬浮液，吸取孢子悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下统计孢子萌发率，以孢子壁破裂后形成一个含有叶绿素的细胞及一条无色透明的初生假根为孢子萌发的标志，在显微镜下随机选取6个视野，计算孢子萌发率，孢子萌发率＝(视野中萌发的孢子数/视野中的孢子总数)×100％；
孢子所受影响的检测：向培养皿中加入少量无菌水，轻轻晃动培养皿，使孢子脱离培养基表面，形成悬浮液，吸取孢子悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察比较孢子假根形态。在本发明的实施例中，发育正常的假根呈长直的管状，受到纳米材料胁迫的假根发生了扭曲或者顶端膨大。
实施例1不同浓度MWCNTs对中华桫椤孢子萌发率的影响
在超净工作台上将得到的MWCNTs无菌悬浮液母液添加至高压灭菌后尚未冷却的基本培养基中，使培养基中MWCNTs的浓度为 0-100mg/L，充分混匀，待培养基充分冷却凝固后，加入无菌水使培养基表面润滑，吸取无菌孢子悬浮液100μL均匀接种于培养基上。先在黑暗处放置24h，再放回正常光照条件下使孢子能够同步萌发，每个处理重复10次，结果见表1，图1。
表1不同浓度MWCNTs对中华桫椤孢子萌发率的影响
对照组(0mg/L MWCNTs)孢子在播种第7天时萌发率为28％，萌发率随培养时间增加而增加，第13d萌发率约84％。25mg/L MWCNTs处理后，孢子萌发率上升趋势与对照相似。50mg/L及以上 MWCNTs处理后，孢子萌发率在第7天时即显著高于对照；第11天时萌发率已近90％；第13天时，50-100mg/L MWCNTs处理均使孢子的萌发率达90％以上，分别比对照提高了约6％、10％和8％。表明 MWCNTs处理显著提高了孢子萌发率，缩短了萌发时间。
萌发的孢子假根无色透明，呈极性生长，50mg/L以下 MWCNTs处理的假根形态与对照相比无显著差异，75mg/L和100 mg/L MWCNTs使假根发生了明显的扭曲，扭曲率可达50％以上，少量孢子假根还出现了顶端膨大的现象。表明孢子处于含75mg/L 以上MWCNTs的环境中，不利于萌发后假根极性生长状态的维持。
结果表明，在1/2MS+7g/L琼脂培养基中加入25～100mg/L MWCNTs后能显著提高中华桫椤孢子萌发率，缩短萌发时间。但75 和100mg/L浓度的MWCNTs处理会导致假根扭曲和膨大，形态异常。因此，50mg/L MWCNTs促进孢子萌发的效果最佳。
实施例2
1.孢子含水量
在超净工作台上将得到的MWCNTs无菌悬浮液母液添加至高压灭菌后尚未冷却的基本培养基中，使培养基中MWCNTs的浓度分别为0、50、100mg/L，充分混匀，待培养基充分冷却凝固后，加入无菌水使培养基表面润滑，吸取无菌孢子悬浮液100μL均匀接种于培养基上。先在黑暗处放置24h，再放回正常光照条件下使孢子同步萌发。孢子吸水膨胀后，向培养基表面滴加无菌水，轻轻晃动培养皿，使孢子脱离培养基，用250目筛网过滤收集孢子，加入提前称重的干燥培养皿中，用分析天平秤量计算孢子鲜重。将秤量后的孢子连同培养皿置于烘箱中，80℃烘至恒重后，用分析天平秤量计算孢子干重，根据公式孢子的相对含水量＝(鲜重－干重)/鲜重，计算孢子相对含水量。每个处理重复3次，结果见图2。
对照组(0mg/L MWCNTs)孢子相对含水量为73％，50mg/L和 100mg/LMWCNTs处理后，孢子含水量均显著提高，分别达到了 80％和85％(图2)，表明MWCNTs处理加速了中华桫椤孢子的萌动。
2.假根长度
在超净工作台上将得到的MWCNTs无菌悬浮液母液添加至高压灭菌后尚未冷却的基本培养基中，使培养基中MWCNTs的浓度分别为0、50、100mg/L，充分混匀，待培养基充分冷却凝固后，加入无菌水使培养基表面润滑，吸取无菌孢子悬浮液100μL均匀接种于培养基上。先在黑暗处放置24h，再放回正常光照条件下使孢子同步萌发。向培养基表面滴加无菌水，轻轻晃动培养皿，使孢子脱离培养基，形成孢子悬浮液，吸取孢子悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下随机选取视野拍照，用Image J软件测量假根长度。每个处理测量50条假根，结果见图3。
对照组(0mg/L MWCNTs)假根平均长度0.11mm，50mg/L和 100mg/L MWCNTs处理后的孢子假根长度显著大于对照，分别为 0.14mm和0.18mm。假根是蕨类植物孢子萌发早期吸收营养的重要结构，MWCNTs处理提高了假根的生长速度。
3.丝状体细胞分裂速度
在超净工作台上将得到的MWCNTs无菌悬浮液母液添加至高压灭菌后尚未冷却的基本培养基中，使培养基中MWCNTs的浓度分别为0、50、100mg/L，充分混匀，待培养基充分冷却凝固后，加入无菌水使培养基表面润滑，吸取无菌孢子悬浮液100μL均匀接种于培养基上。先在黑暗处放置24h，再放回正常光照条件下使孢子同步萌发。孢子萌发后发育为丝状体，分别于播种后第7、9、11、13天，向培养基表面滴加无菌水，轻轻晃动培养皿，待丝状体培养基后，用吸管吸取丝状体悬浮液滴于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下随机选取视野拍照，统计不同生长阶段的丝状体的数量，根据公式n个细胞的丝状体比例＝(n个细胞的丝状体数/总丝状体数)× 100％，计算不同丝状体所占比例。
丝状体细胞数量随播种天数增加而增加，播种第9天时，对照约11％的丝状体处于3个细胞状态，50mg/L和100mg/L MWCNTs 处理的丝状体3个细胞的比例分别为34％和37％；第11天时，对照大多处于3个细胞状态，50mg/L MWCNTs处理使4个细胞的丝状体比率增加，100mg/L MWCNTs处理的丝状体大多处于4个细胞状态，且有约20％处于5个细胞状态；第13天时，对照3～4个细胞状态的丝状体仍占较大比例，达5个细胞状态的仅约14％，50和100mg/L MWCNTs处理的丝状体大部分已分裂成4～5个细胞，5个以上细胞的丝状体分别为10％和27％(图4)。表明MWCNTs可以促进中华桫椤孢子萌发后的细胞分裂，促进丝状体快速提高自养能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种利用多壁碳纳米管促进桫椤孢子萌发的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以桫椤孢子为外植体，进行表面灭菌，获得无菌孢子悬浮液；
2）将无菌孢子悬浮液无菌播种于孢子萌发培养基上，所述孢子萌发培养基的制备方法如下：将多壁碳纳米管无菌悬浮母液添加到高压灭菌后尚未冷却的以1/2 MS为基本培养基的固体培养基中，使基本培养基中的多壁碳纳米管的浓度为25～50 mg/L。
2.如权利要求1所述的促进桫椤孢子萌发的方法，其特征在于，所述孢子萌发培养基含有50 mg/L的多壁碳纳米管。
3.如权利要求1所述的促进桫椤孢子萌发的方法，其特征在于，孢子无菌播种方法为：在充分冷却凝固的萌发培养基中加入少量无菌水使培养基表面润滑，吸取孢子悬浮液均匀接种于培养基上，先黑暗培养 24 h，再光照培养，使孢子能够同步萌发。
4.如权利要求1所述的促进桫椤孢子萌发的方法，其特征在于，孢子的灭菌方法为：称取20 mg成熟孢子置于1.5 mL无菌离心管中，加入无菌水冲洗1-3遍，然后滴入1 mL 5%NaClO溶液，振荡混匀，灭菌5～7分钟，无菌水冲洗3～5次，最后加入1 mL无菌水，获得无菌的孢子悬浮液。
5.如权利要求1-4任一项所述的促进桫椤孢子萌发的方法，其特征在于，培养室条件为：温度25±1℃，光照强度为50～60 μmoL/(m2•s)，光周期为16/8 h，湿度为30％。
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