CN109042314B - 一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效甘蓝型油菜品种的方法。一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，其特征在于包括如下步骤：1)选种；2)育苗；3)移栽；4)搜集计算指标：生物量，氮累积量，侧根长；5)利用计算指标综合判断要进行评价的油菜氮效率基因型：移栽培养21天后，当总生物量大于0.331g/株，且氮累积量大于7.88mg/株，即为氮高效型油菜；总生物量介于0.290‑0.331g/株之间，氮累积量介于6.70‑7.88mg/株之间即为中间型油菜；总生物量低于0.290g/株，氮累积量低于6.70mg/株即为低效型。本发明有效的提高了优良油菜种质资源的筛选过程，降低了劳动成本，加快高氮利用效率品种的筛选效率，筛选出氮利用效率高的基因型油菜品种。

Description

一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的 方法

技术领域

本发明涉及一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效甘蓝型油菜品种的方法(不同甘蓝型油菜品种氮效率评价方法)，属于肥效评价和植物品种筛选领域。

背景技术

在油菜生产中，过高的氮肥投入导致了农民种植成本过高，种植效益偏低，农民种植积极性不高，同时油菜氮利用效率偏低，过多的氮肥流失对环境产生了负面影响，因此，筛选油菜氮高效的种质资源或品种，油菜生产过程中明确油菜品种的氮素养分利用效率类型，挖掘油菜自身氮吸收利用遗传潜力，提高油菜氮肥施用效率，用更少的化学氮肥生产更多的油菜籽，减少油菜化学氮肥施用量，提高油菜产量，降低油菜生产成本，是提升油菜氮效率的有效生物学途径之一，也是保障我国油菜产业可持续性发展的重要方式之一。

作物氮效率包括氮素吸收效率和氮素利用效率两个方面。不同基因型作物氮效率综合差异来自氮素吸收效率和氮素利用效率两个方面的差异。作物的氮效率在不同品种间存在很大的遗传差异，筛选出自身氮素利用效率遗传潜力高的品种用于农业生产可节省大量生产成本。因此品种氮效率的筛选工作显得尤为重要。通常情况下作物养分利用效率差异筛选需要通过对整个生育期的观测进行。通过比较经济产量和生物产量中氮素吸收和氮素利用两方面效率差异作为评价筛选的依据。

但是由于试验过程会受到很多因素的影响或限制，如果试验筛选周期太长很难做到局部控制达到唯一差异性的试验原则，而且大批量品种之间的比较评价和筛选，工作量大，严重制约筛选试验的开展。因此尝试通过对作物苗期氮素养分吸收利用状况的研究分析，比较苗期不同基因型之间的氮素效率差异去替代全生育期筛选，不仅弥补了全生育期筛选难以控制影响因素以及工作量大的不足，而且大量研究表明作物在苗期对外界养分的有效性更为敏感，部分性状与作物成熟期营养性状有显著的相关关系，可以作为氮效率的评价指标，易于筛选到较为理想的基因型。由此可见，利用油菜苗期氮素营养性状指标评价不同油菜品种氮素营养效率差异在操作上具有可靠性，在实际生产上有重大的现实意义。

发明内容

为减少油菜种植中的氮肥施用，减少对环境的面源污染，本发明的目的在于提供一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，从而筛选出氮利用效率高的基因型油菜品种。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)选种：根据需求确定油菜品种，选取颗粒完整、饱满的油菜种子；

2)育苗：将上述油菜种子整齐摆放在正常营养液浸润的纱布上育苗，室温条件下育苗5天；

3)移栽：选取上述长势均一的多株幼苗(多株为10-200株幼苗)，分别移入盛有正常营养液(CK)、低氮营养液(LN)的塑料培养箱(试验设置4次生物学重复)；

4)搜集计算指标：生物量，氮累积量，侧根长；

植株根系形态和生物量的测定：分别收获正常营养液(CK)和低氮营养液(LN)处理油菜植株，用直尺准确量取主根长，用WinRHIZO根系分析软件(Pro 2012b)计算侧根长；然后将植株分为地上部分和地下部分两部分，分别称取鲜重后105℃杀青30min，75℃烘干至重量恒定后称取干重，分别得到地上部分和地下部分两个部位的干重，地上部分和地下部分两部分的干重之和为总生物量；

氮素养分测定：采用凯氏定氮法测定油菜不同部位(即地上部分和地下部分)氮素含量；

植株氮累积量：上述测得的不同部位氮素含量与对应部位的生物量相乘即为该部位植株氮素累积量，所有部位氮累积量之和为植株的氮累积量；

5)利用计算指标综合判断要进行评价的油菜氮效率基因型：

移栽培养21天后，当总生物量(干重)大于0.331g/株，且氮累积量大于7.88mg/株，即为氮高效型油菜；总生物量(干重)介于0.290-0.331g/株之间，氮累积量介于6.70-7.88mg/株之间即为中间型油菜；总生物量(干重)低于0.290g/株，氮累积量低于6.70mg/株即为低效型。

步骤5)中：辅助指标侧根长小于1433.48cm则为氮低效型，高于1433.48cm则为中间型或氮高效型。

步骤1)为：挑选饱满一致的种子蒸馏水浸泡20min后，用质量浓度为5％的NaClO溶液消毒20min，用蒸馏水(纯水)冲洗3次，选取颗粒完整，饱满的种子，得到用于筛选氮效率的种子。

步骤2)所述正常营养液(CK)包括Ca(NO₃)₂·4H₂O、KNO₃、NH₄NO₃、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、乙二胺四乙酸铁钠(EDTA-Fe)、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，浓度(μmol/L)分别为2500、2500、1000、250、1000、500、80、20、4.5、0.3、0.16、0.16。

步骤3)所述低氮营养液(CK)包括Ca(NO₃)₂·4H₂O、KNO₃、NH₄NO₃、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、乙二胺四乙酸铁钠(EDTA-Fe)、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，浓度(μmol/L)分别为125、125、50、250、1000、500、80、20、4.5、0.3、0.16、0.16。

塑料培养箱的长、宽、高分别为30cm、20cm、8cm。

本发明研究结果表明不同氮素供应条件下供试油菜品种苗期的氮素吸收和利用效率相关指标存在显著差异，非低氮含量处理掉总根长、氮积累量、侧根长可以作为苗期油菜氮效率筛选的辅助指标。不同氮素水平下的氮素吸收效率与生物量的相关系数极显著。

本发明的有益效果是：本发明有效的提高了优良油菜种质资源的筛选过程，降低了劳动成本，加快高氮利用效率品种的筛选效率，筛选出氮利用效率高的基因型油菜品种。

附图说明

图1是供试油菜品种苗期在不同氮水平处理下的生物量(单位：g/plant)图。

图2是供试油菜品种苗期在不同氮水平处理下氮累积量(单位：mg/株)图。

图3是油菜苗期氮效率指标间的相关关系图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，包括如下步骤：

1)选种：根据需要选取多个油菜品种。挑选饱满一致的种子蒸馏水浸泡20min后，用质量浓度为5％的NaClO溶液消毒20min，用蒸馏水(纯水)反复冲洗3次，选取颗粒完整、饱满的油菜种子，得到用于筛选氮效率的油菜种子。

2)育苗：试验采用正常营养液和低氮营养液水培方式于2015-2016两年连续在中国农业科学院油料作物研究所温室进行。试验设置正常和低氮(正常营养液和低氮营养液)，室外露天雨棚内培养两个氮处理，低氮营养液以正常营养液(pH5.8-6.0)作为对照(CK)，在此配方基础上设置低氮处理(LN)，两种营养液的配方如表1所示。

表1营养液的配方

将上述步骤1)油菜种子整齐摆放在正常营养液(见表1)浸润的纱布上育苗，室温条件下育苗5天；

3)移栽(移苗)：选取上述长势均一的10株幼苗(10-200株幼苗均可实现本发明)，分别移入盛有正常营养液(CK)、低氮营养液(LN)的塑料方形培养箱(长、宽、高分别为30、20、8cm)，试验设置4次生物学重复，培养期间每周换一次营养液(正常营养液、低氮营养液)；

4)搜集计算指标：选择生物量，氮累积量，侧根长(油菜苗期指标的测定)；

生物量、氮累积量和侧根长在氮素胁迫环境中差异较大，说明苗期甘蓝型油菜在响应低氮胁迫时这些指标更为灵敏。低氮处理下油菜苗期生物量的大小可以表征其对低氮胁迫的耐受能力，相比氮利用效率，氮吸收累积效率对生物量的形成影响更大，氮素累积量是衡量油菜苗期氮效率差异更重要的指标。而油菜苗期生物量与氮吸收效率存在极显著的相关性，侧根长、氮累积量与氮吸收效率存在显著正相关，因此，生物量可作为评价油菜苗期氮效率的主要指标，侧根长、氮积累量、氮素利用指数可作为辅助指标。

植株根系形态和生物量的测定：分别收获正常营养液(CK)和低氮营养液(LN)处理油菜植株，用直尺准确量取主根长，并用二维根系扫描仪(EPSON J221A)获取根部图片，用WinRHIZO根系分析软件(Pro 2012b)计算侧根长和总根长(总根长为主根长和侧根长之和)；然后将植株分为地上部分和地下部分两部分，分别称取鲜重后105℃杀青30min，75℃烘干至重量恒定后称取干重，分别得到地上部分和地下部分两个部位的干重，地上部分和地下部分两部分的干重之和为总生物量；

根冠比：由上述步骤中得到的油菜植株的地下部分与地上部分干重的比值即为根冠比；

氮素养分测定：采用凯氏定氮法测定油菜不同部位(即地上部分和地下部分)氮素含量；

植株氮累积量：上述测得的不同部位氮素含量与对应部位的生物量相乘即为该部位植株氮素累积量，所有部位氮累积量之和为植株的氮累积量；

氮素利用效率(Nitrogen use efficiency，％)为：生物量与植株氮累积量的比值；

氮素吸收效率(Nitrogen uptake efficiency，％)为：植株体内氮素吸收总量/介质中供氮量；介质供氮量定义为营养液中氮素含量，累计更换营养液的体积计算介质中总的供氮量；其中正常营养液(CK)处理整个试验期累积更换营养液中总氮含量为349.13g，低氮营养液(LN)处理整个试验期累积更换营养液中总氮含量为17.46g；

氮素利用指数(Nitrogen utilization index，g²·g^-1)＝生物量×(生物量/植株氮累积量)。

5)利用计算指标综合判断要进行评价的油菜氮效率基因型：

以编号57，58，124和139号品种为例

根据前面提到在低氮环境中，当总生物量(干重)大于0.331g/株且氮累积量大于7.88mg/株，或即为氮高效型油菜，总生物量(干重)介于0.290-0.331g/株之间，氮累积量介于6.70-7.88mg/株之间即为中间型油菜，总生物量(干重)低于0.290g/株，氮累积量低于6.70mg/株即为低效型。辅助指标侧根长小于1433.48cm则为氮低效型，高于1433.48cm则为中间型或氮高效型。由此判断编号57，58，124和139号油菜品种分别为氮低效型，中间型，氮高效型和中间型油菜品种。

下面是前期做的试验结果:

油菜苗期对不同氮水平的响应

供试162个甘蓝型油菜品种(含上述品种编号57,58,124,139)连续两年在LN(A)和CK(B)的生物量以及生物量数据特征参数(C)如图1所示{供试油菜品种苗期在不同氮水平处理下的生物量(单位：g/plant)}；供试162个甘蓝型油菜品种连续两年在LN(A)和CK(B)处理下氮累积量数据以及氮素累积量数据特征参数(C)如图2所示{供试油菜品种苗期在不同氮水平处理下氮累积量(单位：mg/株)}。

随着培养介质中氮水平的提高，油菜苗期生物量和植株氮累积量均增加，变化范围也因氮水平的提高而增大。低氮胁迫时生物量的变幅在两年试验结果分别为0.235-0.563g/plant和0.153-0.470g/plant，平均值分别为0.380g/plant和0.291g/plant；植株氮累积量的变幅分别为2.07-11.26mg/plant和4.05-13.79mg/plant，平均值分别为7.73mg/plant和8.16mg/plant；对照处理油菜生物量在两年中的变幅分别为0.402-1.176g/plant和0.193-0.879g/plant平均值分别为0.828g/plant和0.460g/plant植株氮累积量的变幅分别为20.77-59.86mg/plant和11.69-51.51mg/plant，平均值分别为38.34mg/plant和26.45mg/plant。氮水平提高后两年试验生物量平均增幅分别为117％和58％；植株氮累积量平均增幅分别为396％和224％。

对两年试验结果不同氮效率基因型油菜在不同氮水平下生物量、根冠比、主根长、侧根长、氮累积量、氮利用效率、氮利用指数和氮吸收效率之间进行相关性分析，各指标之间的相关性分析结果如图3所示(油菜苗期氮效率指标间的相关关系)。可以看出，2015年不同氮处理下所有氮效率类型油菜的生物量与氮累积量、氮利用指数、氮吸收效率以及侧根长之间存在极显著的相关性；生物量与氮利用率、根冠比和主根长的相关性不显著。2016年油菜苗期生物量在不同氮水平下均与氮累积量、氮利用指数、氮吸收效率呈现极显著正相关，与主根长和侧根长呈现显著正相关，而与氮素利用率以及根冠比相关性不显著。

两年的试验均表明吸氮量氮累积量与氮素利用率呈负相关或相关关系不显著，氮素利用指数和氮吸收效率与生物量呈现极显著的正相关，说明当生长基质中氮含量较高时，油菜对氮素的吸收存在奢侈吸收；相较于氮素利用率，油菜氮吸收效率与苗期生物量更相关，说明氮素吸收效率对油菜生物量的形成影响更大。

结果表明：低氮处理下油菜苗期生物量的大小可以表征其对低氮胁迫的耐受能力，相比氮利用效率，氮吸收效率对生物量的形成影响更大，氮吸收效率可能是衡量油菜苗期氮效率差异更重要的指标。而油菜苗期生物量与氮吸收效率存在极显著的相关性，侧根长、氮累积量与氮吸收效率存在显著正相关，因此，生物量可作为评价油菜苗期氮效率的主要指标，侧根长、氮积累量可作为辅助指标。在上述研究基础上，以不同氮水平下植株生物量的平均值为阈值，对162个油菜品种氮效率进行分类，其中双高效型油菜品种23个、双低效型油菜品种28个、中间型油菜品种111个。进一步分析表明，双高效型油菜生物量、氮累积量、氮吸收效率均高于双低效油菜品种，且低氮胁迫下双高效型油菜在氮利用方面更有优势。

综上所述，本发明提供一种利用苗期油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，利用该方法研究油菜氮素效率具有一定优势。此外，利用本发明提供的油菜氮效率鉴定方法耗时少，工作量小，易于控制并且能节省空间。可见，本发明提供的一种利用苗期油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法是较优的油菜氮效率鉴定方法。

Claims (4)

1.一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)选种：根据需求确定油菜品种，选取颗粒完整、饱满的油菜种子；

2)育苗：将上述油菜种子整齐摆放在正常营养液浸润的纱布上育苗，室温条件下育苗5天；

所述正常营养液包括Ca(NO₃)₂·4H₂O、KNO₃、NH₄NO₃、K₂ SO₄、MgSO₄·7H₂O、KH₂ PO₄、乙二胺四乙酸铁钠、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，浓度分别为2500、2500、1000、250、1000、500、80、20、4.5、0.3、0.16、0.16，浓度的单位μmol/L；

3)移栽：选取上述长势均一的多株幼苗，分别移入盛有正常营养液、低氮营养液的塑料培养箱；

所述正常营养液包括Ca(NO₃)₂·4H₂O、KNO₃、NH₄NO₃、K₂ SO₄、MgSO₄·7H₂O、KH₂ PO₄、乙二胺四乙酸铁钠、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，浓度分别为2500、2500、1000、250、1000、500、80、20、4.5、0.3、0.16、0.16，浓度的单位μmol/L；

所述低氮营养液包括Ca(NO₃)₂·4H₂O、KNO₃、NH₄NO₃、K₂ SO₄、MgSO₄·7H₂O、KH₂ PO₄、乙二胺四乙酸铁钠、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，浓度分别为125、125、50、250、1000、500、80、20、4.5、0.3、0.16、0.16，浓度的单位μmol/L；

4)搜集计算指标：生物量，氮累积量；

植株根系形态和生物量的测定：分别收获正常营养液和低氮营养液处理油菜植株，将植株分为地上部分和地下部分两部分，分别称取鲜重后105℃杀青30min，75℃烘干至重量恒定后称取干重，分别得到地上部分和地下部分两个部位的干重，地上部分和地下部分两部分的干重之和为总生物量；

氮素养分测定：采用凯氏定氮法测定油菜不同部位氮素含量；

植株氮累积量：上述测得的不同部位氮素含量与对应部位的生物量相乘即为该部位植株氮素累积量，所有部位氮累积量之和为植株的氮累积量；

5)利用计算指标综合判断要进行评价的油菜氮效率基因型：

移栽培养21天后，当总生物量大于0.331g/株，且氮累积量大于7.88mg/株，即为氮高效型油菜；总生物量介于0.290-0.331g/株之间，氮累积量介于6.70-7.88mg/株之间即为中间型油菜；总生物量低于0.290g/株，氮累积量低于6.70mg/株即为低效型；

辅助指标侧根长小于1433.48cm则为氮低效型，高于1433.48cm则为中间型或氮高效型。

2.根据权利要求1所述的一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，其特征在于：步骤1)为：挑选饱满一致的种子蒸馏水浸泡20min后，用质量浓度为5％的NaClO溶液消毒20min，用蒸馏水冲洗3次，选取颗粒完整，饱满的种子，得到用于筛选氮效率的种子。

3.根据权利要求1所述的一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，其特征在于：步骤3)中多株幼苗为10-200株幼苗。

4.根据权利要求1所述的一种利用苗期甘蓝型油菜培养试验筛选氮高效油菜品种的方法，其特征在于：步骤4)中不同部位为地上部分和地下部分。

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