CN112011580B - 一种制备屈昔多巴的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种制备屈昔多巴的方法和应用，所述制备屈昔多巴的方法是利用醛缩酶进行不对称缩合，以3,4‑二羟基苯甲醛及甘氨酸为底物，通过醛缩酶催化，仅需一步反应即可合成所需要的产物，所用的醛缩酶催化活性及手性选择性高，无需手性化学拆分，理论上原子利用率为100%，反应过程简单，绿色环保，原子经济性极高，克服了化学法合成屈昔多巴的缺陷，是一种极具竞争力的屈昔多巴制备方法，解决了现有制备屈昔多巴的方法大多存在工艺操作复杂且环境污染大的问题。

Description

一种制备屈昔多巴的方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种制备屈昔多巴的方法和应用。
背景技术
屈昔多巴(Droxidopa)，也叫屈西多巴，化学名称是(2S,3R)-2-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)-3-羟基丙酸，它是一种白至灰白色结晶或结晶粉的化学品，通常为抗帕金森症药，临床上主要用于改善由帕金森病引起的步态僵直和直立性头晕。
目前，屈昔多巴的制备方法通常是通过化学拆分法进行制备，例如，以3,4-二羟基苯甲醛为起始原料，经苄基保护制得3,4-二苄氧基苯甲醛，并与甘氨酸缩合生成外消的苏赤式-3-(3,4-二苄氧基苯基)丝氨酸，经手性拆分及催化加氢制得屈昔多巴，该方法理论收率只能达到50％，原子经济性差，而且所用试剂多，步骤繁琐，环境污染大，是一种非常不经济环保的方式。为了提高环保性，部分人是通过苄氯保护羟基得到的3,4-二苄氧基苯甲醛为底物，以醛缩酶为催化剂进行不对称缩合，并通过后续的手性拆分及钯碳加氢等操作获得屈昔多巴，该方法相较于传统的化学合成法有较大优势，但仍然存在酶手性选择性不佳的问题，并且该方法仍然存在较多步骤的化学反应，在经济性、环保等方面仍有提高的空间。因此，上述的技术方案在实际操作时存在以下不足：现有制备屈昔多巴的方法大多存在工艺操作复杂且环境污染大的问题。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种制备屈昔多巴的方法，以解决上述背景技术中提出的现有制备屈昔多巴的方法大多存在工艺操作复杂且环境污染大的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：
以3,4-二羟基苯甲醛及甘氨酸为底物，以PLP(Pyridoxal5-phosphatemonohydrate，磷酸吡哆醛)为辅酶，以醛缩酶为催化剂，并共同置于缓冲液中构成反应体系进行酶催化反应，分离，得到所述的屈昔多巴。
作为本发明进一步的方案：所述醛缩酶是由醛缩酶基因编码的酶，其中，所述醛缩酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述醛缩酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
作为本发明再进一步的方案：在所述制备屈昔多巴的方法中，所述醛缩酶基因的核苷酸序列与氨基酸序列也可以参考使用中国专利(专利公开号CN110869383A)工程化多肽及其在合成β-羟基-α-氨基酸中的应用中的工程化多肽。
作为本发明再进一步的方案：在所述制备屈昔多巴的方法中，各原料在所述反应体系中的浓度分别为：醛缩酶0.5-200g/L，磷酸吡哆醛0.01-0.5mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10-200g/L，甘氨酸5-40mol/L。
作为本发明再进一步的方案：在所述制备屈昔多巴的方法中，各原料在所述反应体系中的浓度分别为：醛缩酶1-20g/L，磷酸吡哆醛0.2-0.4mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10-40g/L，甘氨酸5-20mol/L。
作为本发明再进一步的方案：优选的，所述的醛缩酶为购自宁波酶赛生物工程有限公司的产品，其是通过在大肠杆菌重组表达出来的蛋白，为大肠杆菌表达产物，表达基因是醛缩酶基因，宿主细胞为E.Coli,BL21(DE3)。对应的，所述醛缩酶可以是表达所述醛缩酶的大肠杆菌噬菌体、细胞破碎上清或酶粉，即为大肠杆菌表达产物所对应的大肠杆菌湿菌体、细胞破碎上清或酶粉，具体根据需要进行选择，这里并不作限定。
优选的，所述醛缩酶可以是表达所述醛缩酶的大肠杆菌噬菌体或酶粉。
作为本发明再进一步的方案：所述的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)缓冲液、甘氨酸缓冲液等中的任意一种。
作为本发明再进一步的方案：所述的缓冲液的pH范围为5-9，优选地，pH是7。
进一步的，所述制备屈昔多巴的方法的具体合成路线如下：
Figure GDA0004078866450000021
作为本发明再进一步的方案：在所述制备屈昔多巴的方法中，所述酶催化反应的反应温度为20-60℃，优选的是30℃。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述的制备屈昔多巴的方法制备得到的屈昔多巴。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的制备屈昔多巴的方法在药物合成中的应用。
作为本发明再进一步的方案：上述的制备屈昔多巴的方法在制备用于增加血压的药物和/或用于治疗帕金森病的药物中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的屈昔多巴在制备用于增加血压的药物和/或用于治疗帕金森病的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明实施例提供的制备屈昔多巴的方法是利用醛缩酶进行不对称缩合，以3,4-二羟基苯甲醛及甘氨酸为底物，通过醛缩酶催化，仅需一步反应即可合成所需要的产物，所用的醛缩酶催化活性及手性选择性高，无需手性化学拆分，理论上原子利用率为100％，反应过程简单，绿色环保，原子经济性极高，克服了化学法合成屈昔多巴的缺陷，是一种极具竞争力的屈昔多巴制备方法，解决了现有制备屈昔多巴的方法大多存在工艺操作复杂且环境污染大的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种表达醛缩酶的大肠杆菌，所述醛缩酶是由醛缩酶基因编码的酶，所述醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述醛缩酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
具体的，所述表达醛缩酶的大肠杆菌的构建及培养方法如下：采用现有方法将表达醛缩酶的重组的大肠杆菌接种于含有氯霉素抗性的LB(lysogeny broth)固体培养基，37℃培养20h；挑取单菌落接种于含有氯霉素抗性的50mL的LB液体培养基，振荡培养20h，培养结束后移取菌液于250mL的TB(Terrific Broth)液体培养基，培养2.5d后取菌液稀释检测OD(optical density)值为0.7，加入0.1mmol/L的IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)诱导蛋白表达，30℃振荡培养18h，8000rpm离心收集菌体，得到表达醛缩酶的大肠杆菌湿菌体。
实施例2
将实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体用0.1mol/L的缓冲液(pH＝7.0)进行回溶菌体，均质破碎，离心收集酶液上清进行冷冻干燥，得到醛缩酶酶粉。
实施例3
醛缩酶活性及手性检测：称取0.1g实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及适量的磷酸盐缓冲液进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：大肠杆菌湿菌体20g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10g/L，甘氨酸54g/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)检测转化率，经检测反应1h转化率为15％，de(diastereomer excess，非对映体过量)>99.5％，具体的de检测条件如表1所示。
表1 de检测色谱条件
色谱柱 流动相 检测波长 柱温 运行时间
AQ-C18 0.1％正庚烷磺酸钠：甲醇＝1：1 280nm 40℃ 15min
实施例4
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：以3,4-二羟基苯甲醛及甘氨酸为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以醛缩酶为催化剂，并共同置于缓冲液中构成反应体系进行酶催化反应，分离，得到所述的屈昔多巴；具体的，所述制备屈昔多巴的方法包括：
称取0.1g实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及适量的中性磷酸盐缓冲液进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：大肠杆菌湿菌体20g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛50g/L，甘氨酸10mol/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC检测反应1h的产物生成量，具体的检测结果如表2所示。
表2 HPLC检测分析结果表
反应时间 1小时产物生成量(g/L)
1h 14.4
实施例5
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：称取0.1g实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及适量的磷酸盐缓冲液进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：大肠杆菌湿菌体20g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，甘氨酸10mol/L，其中，3,4-二羟基苯甲醛在所述反应体系中的浓度分别设置为10g/L(对应加入3,4-二羟基苯甲醛0.05g)、25g/L、50g/L、100g/L、200g/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC检测反应1h的产物生成量，具体的检测结果如表3所示。
表3 HPLC检测分析结果表
Figure GDA0004078866450000051
Figure GDA0004078866450000061
从表3中数据可以看出，在3,4-二羟基苯甲醛浓度达到50g/L时即可得到1小时产物生成量14.4g/L，继续增加浓度后，1小时产物生成量增加不明显。
实施例6
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：称取0.1g实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及适量的磷酸盐缓冲液进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：大肠杆菌湿菌体20g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10g/L，其中，甘氨酸在所述反应体系中的浓度分别设置为5mol/L、10mol/L、15mol/L、20mol/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC检测转化率，具体的检测结果如表4所示。
表4 HPLC检测分析结果表
甘氨酸当量 1小时转化率
5倍当量 9.8％
10倍当量 16.7％
15倍当量 19.7％
20倍当量 24.1％
从表4中数据可以看出，在甘氨酸浓度达到10mol/L时即可得到1小时转化率是16.7％，继续增加浓度后，在甘氨酸浓度达到20mol/L时即可得到1小时转化率是24.1％。
实施例7
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：称取0.1g实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：大肠杆菌湿菌体20g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，甘氨酸10mol/L，3,4-二羟基苯甲醛10g/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：400rpm磁力搅拌，反应1小时，温度分别设置为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC检测转化率，具体的检测结果如表5所示。
表5 HPLC检测分析结果表
温度 1小时转化率
20℃ 15.7％
30℃ 16.8％
40℃ 16.4％
50℃ 15.2％
60℃ 15.3％
从表5中数据可以看出，温度在30-40℃之间的转化率最高，其余温度条件转化率反而下降。
实施例8
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：称取0.1g实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及适量的0.1mol/L的PBS(phosphate buffer saline)做为缓冲液进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：大肠杆菌湿菌体20g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，甘氨酸10mol/L，3,4-二羟基苯甲醛10g/L；调节反应体系的pH值分别是5、6、7、8、9，再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC检测转化率，具体的检测结果如表6所示。
表6 HPLC检测分析结果表
pH 1小时转化率
5 12.1％
6 16.3％
7 16.9％
8 16.1％
9 15.3％
从表6中数据可以看出，反应体系的pH在6-9都表现出较好的转化率。
实施例9
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：称取实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及适量的磷酸盐缓冲液进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：3,4-二羟基苯甲醛10g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，甘氨酸10mol/L，其中，大肠杆菌湿菌体在所述反应体系中的浓度分别设置为0.5g/L(对应加入实施例1中制备的大肠杆菌湿菌体0.0025g)、1g/L、5g/L、20g/L、50g/L、100g/L、200g/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC检测转化率，具体的检测结果如表7所示。
表7 HPLC检测分析结果表
Figure GDA0004078866450000081
Figure GDA0004078866450000091
从表7中数据可以看出，在大肠杆菌湿菌体用量浓度达到20g/L时即可得到1小时转化率16.7％，继续增加浓度后，转化率增加不明显。
实施例10
一种制备屈昔多巴的方法，包括以下步骤：称取实施例2中制备的醛缩酶酶粉，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及适量的磷酸盐缓冲液进行混合构成反应体系(总体积5mL)，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：3,4-二羟基苯甲醛10g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，甘氨酸10mol/L，其中，醛缩酶酶粉在所述反应体系中的浓度分别设置为0.5g/L(对应加入实施例2中制备的醛缩酶酶粉0.0025g)、1g/L、5g/L、20g/L、50g/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件：温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时；反应结束后用体积浓度50％的乙腈灭活，取样在HPLC检测转化率，具体的检测结果如表8所示。
表8 HPLC检测分析结果表
醛缩酶酶粉用量 1小时转化率
0.5g/L 16.2％
1g/L 16.0％
5g/L 15.8％
20g/L 16.3％
50g/L 16.3％
实施例11
与实施例4相比，除了所述反应体系的反应总体积为4mL，以及各原料在所述反应体系中的投入终浓度分别为：醛缩酶0.5g/L，磷酸吡哆醛0.01mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛0.01g/L，甘氨酸0.01mol/L外，其他与实施例4相同。
实施例12
与实施例4相比，除了所述反应体系的反应总体积为5mL，以及各原料在所述反应体系中的投入终浓度分别为：醛缩酶200g/L，磷酸吡哆醛0.5mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛200g/L，甘氨酸40mol/L外，其他与实施例4相同。
实施例13
与实施例4相比，除了所述反应体系的反应总体积为4mL，以及各原料在所述反应体系中的投入终浓度分别为：醛缩酶100g/L，磷酸吡哆醛0.3mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛100g/L，甘氨酸20mol/L外，其他与实施例4相同。
实施例14
与实施例4相比，除了所述反应体系的反应总体积为5mL，以及各原料在所述反应体系中的投入终浓度分别为：醛缩酶1g/L，磷酸吡哆醛0.2mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10g/L，甘氨酸5mol/L外，其他与实施例4相同。
实施例15
与实施例4相比，除了所述反应体系的反应总体积为5mL，以及各原料在所述反应体系中的投入终浓度分别为：醛缩酶20g/L，磷酸吡哆醛0.4mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛40g/L，甘氨酸20mol/L外，其他与实施例4相同。
实施例16
与实施例4相比，除了所述反应体系的反应总体积为5mL，以及各原料在所述反应体系中的投入终浓度分别为：醛缩酶10g/L，磷酸吡哆醛0.3mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10g/L，甘氨酸0.5mol/L外，其他与实施例4相同。
实施例17
与实施例4相比，除了所述反应体系的反应总体积为5mL，以及各原料在所述反应体系中的投入终浓度分别为：醛缩酶10g/L，磷酸吡哆醛0.3mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛40g/L，甘氨酸0.5mol/L外，其他与实施例4相同。
实施例18
与实施例4相比，除了所述磷酸盐缓冲液替换为硼酸盐缓冲液外，其他与实施例4相同。
实施例19
与实施例4相比，除了所述磷酸盐缓冲液替换为Tris缓冲液外，其他与实施例4相同。
实施例20
与实施例4相比，除了所述磷酸盐缓冲液替换为甘氨酸缓冲液外，其他与实施例4相同。
由上述结果可知，本发明实施例提供的制备屈昔多巴的方法是采用醛缩酶高效催化甘氨酸与3，4-二羟基苯甲醛缩合生成屈昔多巴，手性选择性高，理论上原子利用率为100％，整个反应只需一步合成，所用试剂少，大大的简化了采用化学工艺合成屈昔多巴所用的手性拆分、催化加氢等繁琐步骤，是一种更为经济环保的方式。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 宁波酶赛生物工程有限公司
<120> 一种制备屈昔多巴的方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcgtcacc tgtttaacac cgatgcggaa atctacgaag ccatcgttaa agaatacgaa 60
cgccagtttt accatctgga actgattgcg agcgaaaact tcacctctct ggcggttatg 120
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tacggcggtt gcgaatttgt tgatattgca gaagacctgg ctatcgaacg cgcaaaagct 240
ctgttcgatg cagaacacgc taacgtccag ccgcattccg gcacccaagc gaatatggcc 300
gtttatatgg cggtcctgaa accgggcgat accattatgg gtatggacct gagccatggc 360
ggtcacctga cgcatggcgc aaaagtgaac ttctctggta aaatctacaa cgctgtgtac 420
tacggtgttc acccggaaac ccatctgatc gattatgacc agctgtaccg tctggcaaaa 480
gaacacaaac cgaaactgat tgtgggcggt gcgagtgcct atccgcgtgt tattgattgg 540
gcgaaactgc gcgaaatcgc agactccgtg ggcgcttatc tgatggttga tatggcacat 600
tacgctggtc tgatcgcggg cggtgtctat ccgaatccgg tgccgtacgc ccactttgtt 660
acctcaacca cgcataaaac gctgcgtggc ccgcgttcgg gttttattct gtgcaaaaaa 720
gaattcgcca aagatatcga caaatcagtg ttcccgggta tccagggcgg tccgctgatg 780
cacgtcatcg cggccaaagc agtggctttt aaagaagcga tgtcgcagga attcaaagaa 840
tatgcccgtc aagtggttgc gaacgcccgc gtgctggccg aagaatttat taaagaaggc 900
ttcaaagtcg tgagtggcgg taccgactcc catatcgtcc tgctggatct gcgtgacacc 960
ggcctgacgg gtcgcgaagt ggaagaagcg ctgggtaaag ccaatattac ggttaacaaa 1020
aatgcagtcc cgtttgatcc gctgccgccg gttaaaacca gcggcatccg tctgggtacg 1080
ccggcaatga ccacgcgtgg tatgaaagaa gaccagatgc gtattatcgc tcgcctgatc 1140
tctaaagtga tcaaaaacat cggtgatgaa aaagtcatcg aatatgtgcg tcaggaagtt 1200
atcgaaatgt gtgaacaatt cccgctgtac ccggaactgc gcgaagaaat caaccatctg 1260
gcaaaaatca aagctaccta t 1281
<210> 2
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Arg His Leu Phe Asn Thr Asp Ala Glu Ile Tyr Glu Ala Ile Val
1 5 10 15
Lys Glu Tyr Glu Arg Gln Phe Tyr His Leu Glu Leu Ile Ala Ser Glu
20 25 30
Asn Phe Thr Ser Leu Ala Val Met Glu Ala Gln Gly Ser Val Met Thr
35 40 45
Asn Lys Tyr Ala Glu Gly Leu Pro His Lys Arg Tyr Tyr Gly Gly Cys
50 55 60
Glu Phe Val Asp Ile Ala Glu Asp Leu Ala Ile Glu Arg Ala Lys Ala
65 70 75 80
Leu Phe Asp Ala Glu His Ala Asn Val Gln Pro His Ser Gly Thr Gln
85 90 95
Ala Asn Met Ala Val Tyr Met Ala Val Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile
100 105 110
Met Gly Met Asp Leu Ser His Gly Gly His Leu Thr His Gly Ala Lys
115 120 125
Val Asn Phe Ser Gly Lys Ile Tyr Asn Ala Val Tyr Tyr Gly Val His
130 135 140
Pro Glu Thr His Leu Ile Asp Tyr Asp Gln Leu Tyr Arg Leu Ala Lys
145 150 155 160
Glu His Lys Pro Lys Leu Ile Val Gly Gly Ala Ser Ala Tyr Pro Arg
165 170 175
Val Ile Asp Trp Ala Lys Leu Arg Glu Ile Ala Asp Ser Val Gly Ala
180 185 190
Tyr Leu Met Val Asp Met Ala His Tyr Ala Gly Leu Ile Ala Gly Gly
195 200 205
Val Tyr Pro Asn Pro Val Pro Tyr Ala His Phe Val Thr Ser Thr Thr
210 215 220
His Lys Thr Leu Arg Gly Pro Arg Ser Gly Phe Ile Leu Cys Lys Lys
225 230 235 240
Glu Phe Ala Lys Asp Ile Asp Lys Ser Val Phe Pro Gly Ile Gln Gly
245 250 255
Gly Pro Leu Met His Val Ile Ala Ala Lys Ala Val Ala Phe Lys Glu
260 265 270
Ala Met Ser Gln Glu Phe Lys Glu Tyr Ala Arg Gln Val Val Ala Asn
275 280 285
Ala Arg Val Leu Ala Glu Glu Phe Ile Lys Glu Gly Phe Lys Val Val
290 295 300
Ser Gly Gly Thr Asp Ser His Ile Val Leu Leu Asp Leu Arg Asp Thr
305 310 315 320
Gly Leu Thr Gly Arg Glu Val Glu Glu Ala Leu Gly Lys Ala Asn Ile
325 330 335
Thr Val Asn Lys Asn Ala Val Pro Phe Asp Pro Leu Pro Pro Val Lys
340 345 350
Thr Ser Gly Ile Arg Leu Gly Thr Pro Ala Met Thr Thr Arg Gly Met
355 360 365
Lys Glu Asp Gln Met Arg Ile Ile Ala Arg Leu Ile Ser Lys Val Ile
370 375 380
Lys Asn Ile Gly Asp Glu Lys Val Ile Glu Tyr Val Arg Gln Glu Val
385 390 395 400
Ile Glu Met Cys Glu Gln Phe Pro Leu Tyr Pro Glu Leu Arg Glu Glu
405 410 415
Ile Asn His Leu Ala Lys Ile Lys Ala Thr Tyr
420 425

Claims (3)

1.一种制备屈昔多巴的方法，其特征在于，包括以下步骤：以3,4-二羟基苯甲醛及甘氨酸为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以醛缩酶为催化剂，并共同置于缓冲液中构成反应体系进行酶催化反应，分离，得到所述的屈昔多巴；
所述醛缩酶是由醛缩酶基因编码的酶；其中，所述醛缩酶基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，所述醛缩酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；
制备屈昔多巴的方法具体包括以下步骤：称取大肠杆菌湿菌体，所述大肠杆菌湿菌体为表达醛缩酶的大肠杆菌湿菌体，然后加入磷酸吡哆醛、3,4-二羟基苯甲醛、甘氨酸以及磷酸盐缓冲液进行混合构成反应体系，使各原料在所述反应体系中的浓度分别是：大肠杆菌湿菌体20g/L、磷酸吡哆醛0.3mmol/L，3,4-二羟基苯甲醛10g/L，甘氨酸54g/L；再将反应体系置于反应瓶中进行酶催化反应，反应条件为温度30℃，400rpm磁力搅拌，反应1小时。
2.根据权利要求1所述的制备屈昔多巴的方法，其特征在于，所述的缓冲液的pH范围为5-9。
3.一种如权利要求1-2任一所述的制备屈昔多巴的方法在药物合成中的应用。
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