CN111996228A - 一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法 - Google Patents

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任军
郭显赫
张立民
娄佳鹏
张维
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Abstract

本发明涉及一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法,包括如下步骤:步骤一、称取榛仁蛋白粉,加入蒸馏水配制成溶液,加热破坏其蛋白质结构,冷却后搅拌并将其调节至所需pH值;步骤二、在上述溶液中加入目标蛋白酶开始酶解,在酶解反应完成后,对酶解液进行灭活,然后将其冷却到第二次酶解反应所需的温度;步骤三、加入第二种目标蛋白酶进行第二次酶解,得到经过双酶解的榛仁蛋白水解液。本工艺以优化后榛仁分离蛋白提取工艺为基础,对榛仁蛋白进行酶解,提高了榛仁蛋白利用率。

Description

一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法
技术领域
本发明属于抗氧化肽技术领域,具体涉及一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法。
背景技术
我国盛产榛子,但对其开发利用方面仍处于初级的阶段。而以榛仁为原料可制备抗氧化肽,其能够在一定程度上清除体内自由基,起到延缓衰老,抵抗疲劳,预防各种疾病的作用。如今大多数抗氧化剂都是人工合成的,从天然植物中制备抗氧化剂有着易于吸收,安全无副作用的优点。同时,我国拥有极丰富的动植物蛋白资源,利用这一优势,开发天然抗氧化肽具有重要作用。目前对榛仁蛋白常用单酶解方法,为了高效制备多肽功能性产品,还需要进一步优化现有工艺。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足,提出一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法。
本发明涉及一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法,包括如下步骤:
步骤一、称取榛仁蛋白粉,加入蒸馏水配制成溶液,加热破坏其蛋白质结构,冷却后搅拌并将其调节至所需pH值;
步骤二、在上述溶液中加入目标蛋白酶开始酶解,榛仁蛋白粉溶液的质量百分比浓度为1-5%、pH 6.5-7.5,加入目标蛋白酶的质量百分比浓度为5-15%,在温度45-65℃下反应;在酶解反应完成后,对酶解液进行灭活,然后将其冷却到第二次酶解反应所需的温度;
步骤三、加入第二种目标蛋白酶进行第二次酶解,其质量百分比浓度为5-15%、pH8-9、温度55-65℃,得到经过双酶解的榛仁蛋白水解液。步骤一中,榛仁蛋白粉加入蒸馏水配制成溶液后,放入水浴锅中在95℃下加热15min,冷却后,置于磁力搅拌器上,用1mol/LNaOH溶液调节至所需pH值。
步骤二中,灭活操作具体操作为:在95℃温度下水浴15min使酶失去活性。
步骤二中,目标蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或胰蛋白酶。
步骤三中,第二种目标蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或胰蛋白酶。
步骤三中,所述榛仁蛋白水解液的水解度为39.67±0.3%。
本发明以优化后榛仁分离蛋白提取工艺为基础,对榛仁蛋白进行酶解,提高了榛仁蛋白利用率。利用蛋白酶催化特异性位点的不同,采用工业酶制剂对榛仁蛋白进行双酶复合水解,并用响应面法分析双酶复合作用对榛仁蛋白酶解效率的影响。结果表明,本发明的双酶水解程度要高于单酶解水解程度,达到39.67±0.3%。本发明提高了原料的利用率,进而提高榛子深加工企业的附加值。
具体实施方式
本发明涉及一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法,包括如下步骤:
步骤一、称取榛仁蛋白粉,加入蒸馏水配制成溶液,放入水浴锅中在95℃下加热15min,冷却后,置于磁力搅拌器上,用1mol/L NaOH溶液调节至所需pH值;
步骤二、在上述溶液中加入目标蛋白酶开始酶解,榛仁蛋白粉溶液浓度值为2.2%、pH7.0、加入目标蛋白酶的酶量为11.5%、温度60℃;在酶解反应完成后,对酶解液进行灭活,在95℃温度下水浴15min使酶失去活性,然后将其冷却到第二次酶解反应所需的温度;
步骤三、加入第二种目标蛋白酶进行第二次酶解,加酶量12%、pH 8.5、温度55℃,得到经过双酶解的榛仁蛋白水解液。
步骤二中,目标蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或胰蛋白酶。步骤三中,第二种目标蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或胰蛋白酶。
其中制备榛仁蛋白粉的方法如下:选取平欧杂交榛子,用去壳器去壳取榛仁,用小型粉碎机粉碎2-3min,榛仁粉与正己烷的比例为1:10,室温超声进行10min(功率240W,频率40kHz),离心5min去除上清液,重复上述操作3次,干燥得到脱脂榛仁粉,将脱脂榛仁粉粉碎过筛后,按料液比1:10(w/v)与水混合,用1mol/LNaOH调节pH值至8.5,上清液于50℃恒温水浴锅中静置90min,以5000rpm/min离心10min,不断搅拌,用0.6mol/LHCl调节pH值至5.0,之后以5000rpm/min离心10min,用蒸馏水洗涤沉淀层两次,调节pH值至7.0后冷冻干燥,获得榛仁蛋白粉。
水解度由pH stat法测定:榛仁蛋白水解液的水解度DH用NaOH的消耗量表示,计算公式为:
DH%=(VNaOH×CNaOH)/(Mp×Htot×α)×100%
式中,VNaOH为碱液的体积,mL;CNaOH为碱液的浓度,mol/L;α为氨基的解离度;MP为底物中蛋白质总质量,g;Htot为底物蛋白质中肽键的总数(取8.0),mmol/g。α=10(pH-pK)/(10(pH-pK)+1),式中pK为氨基的解离常数,一般取7.0为平均值进行计算。
下面对本发明的的工艺方法进行具体说明。
实施例1
本实施例中的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,包括如下步骤:
步骤一、称取榛仁蛋白粉,加入蒸馏水配制成溶液,放入水浴锅中在95℃下加热15min,冷却后,置于磁力搅拌器上,用1mol/L NaOH溶液调节至pH值为7;
步骤二、在上述溶液中加入木瓜蛋白酶开始酶解,榛仁蛋白粉溶液浓度值为2.2%、pH7.0、加入目标蛋白酶的酶量为11.5%,温度为60℃;在酶解反应完成后,对酶解液进行灭活,在95℃温度下水浴15min使酶失去活性,然后将其冷却到第二次酶解反应所需的温度;
步骤三、加入碱性蛋白酶进行第二次酶解,加酶量12.0%,pH 8.5,温度为55℃得到经过双酶解的榛仁蛋白水解液,水解度可到达39.7%。
实施例2
本实施例中的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,包括如下步骤:
步骤一、称取榛仁蛋白粉,加入蒸馏水配制成溶液,放入水浴锅中在95℃下加热15min,冷却后,置于磁力搅拌器上,用1mol/L NaOH溶液调节至pH值为7;
步骤二、在上述溶液中加入木瓜蛋白酶开始酶解,榛仁蛋白粉溶液浓度值为2.0%、pH7.0、加入目标蛋白酶的酶量为10.0%,温度为60℃;在酶解反应完成后,对酶解液进行灭活,在95℃温度下水浴15min使酶失去活性,然后将其冷却到第二次酶解反应所需的温度;
步骤三、加入碱性蛋白酶进行第二次酶解,加酶量10.0%,pH 8.5,温度为55℃得到经过双酶解的榛仁蛋白水解液,水解度可到达34.8%。
实施例3
本实施例中的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,包括如下步骤:
步骤一、称取榛仁蛋白粉,加入蒸馏水配制成溶液,放入水浴锅中在95℃下加热15min,冷却后,置于磁力搅拌器上,用1mol/L NaOH溶液调节至pH值为7;
步骤二、在上述溶液中加入胰蛋白酶开始酶解,榛仁蛋白粉溶液浓度值为2.0%、pH 8.0、加入目标蛋白酶的酶量为10.0%,温度为40℃;在酶解反应完成后,对酶解液进行灭活,在95℃温度下水浴15min使酶失去活性,然后将其冷却到第二次酶解反应所需的温度;
步骤三、加入碱性蛋白酶进行第二次酶解,加酶量10.0%,pH 8.5,温度为55℃得到经过双酶解的榛仁蛋白水解液,水解度可到达30.6%。
双酶解的效果要高于单酶解,这是由于不同蛋白酶对蛋白的酶切位点不同有关,合适的双酶组合酶解蛋白时能起到相互促进的作用,从而提高水解度,增强酶解效果。
酶解后的榛仁多肽分子量大部分(80%)在7.8KDa以下,利用葡聚糖凝胶层析联用AKTA蛋白纯化系统对榛仁多肽进行分离纯化,获得分子量分别介于5.8-7.8KDa、3.3-5.8KDa、小于3.3KDa的三个混合肽组分。通过本发明的方法得到的榛仁多肽,是一定分子量范围的多肽混合物,多种肽的混合物可使其功能累加和相互作用,表现出更强的活性。
抗氧化实验:
在DPPH自由基清除实验中,在榛仁多肽组分浓度达到9mg/mL时,对DPPH自由基的清除率可达到Vc的91.32%;在对ABTS自由基清除实验中,在榛仁多肽组分浓度为7%时,对ABTS自由基的清除率可达到97.76%,达到Vc对ABTS自由基清除能力的97.74%。
抗疲劳实验:
在小鼠负重游泳实验中,利用本发明的方法得到的榛仁多肽,能大幅度的延长小鼠负重游泳时间,小鼠全血乳酸含量大幅降低了,这说明在榛仁多肽的作用下,能够调节小鼠蛋白质能量供应的比例,相对减少肌肉中蛋白质的能量消耗,使肌肉中的能量平衡能够被较好的控制,同时能增强小鼠机体适应负荷的能力,对乳酸堆积现象起到了预防和减少作用,同时协同维护机体供能系统的正常,进而对运动中疲劳的发生起到一定的延缓作用。
通过上述实验可发现,小鼠负重实验结果证明其具有明显的抗疲劳作用,同时对DPPH自由基及ABTS自由基具有较强的清除作用,具有较强的抗氧化活性,对DPPH自由基的清除率达到91.32%。
上述内容仅为本发明的较佳实施例,并非用于限制本发明的实施方案,本领域普通技术人员根据本发明的主要构思和精神,可以十分方便地进行相应的变通或修改,故本发明的保护范围应以权利要求书所要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种榛仁蛋白双酶解的工艺方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、称取榛仁蛋白粉,加入蒸馏水配制成溶液,加热破坏其蛋白质结构,冷却后搅拌并将其调节至所需pH值;
步骤二、在上述溶液中加入目标蛋白酶开始酶解,榛仁蛋白粉溶液的质量百分比浓度为1-5%、pH 6.5-7.5,加入目标蛋白酶的质量百分比浓度为5-15%,在温度45-65℃下反应;在酶解反应完成后,对酶解液进行灭活,然后将其冷却到第二次酶解反应所需的温度;
步骤三、加入第二种目标蛋白酶进行第二次酶解,其质量百分比浓度为5-15%、pH 8-9、温度55-65℃,得到经过双酶解的榛仁蛋白水解液。
2.根据权利要求1所述的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,其特征在于,步骤一中,榛仁蛋白粉加入蒸馏水配制成溶液后,放入水浴锅中在95℃下加热15min,冷却后,置于磁力搅拌器上,用1mol/LNaOH溶液调节至所需pH值。
3.根据权利要求1所述的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,其特征在于,步骤二中,灭活操作具体操为:在95℃温度下水浴15min使酶失去活性。
4.根据权利要求1所述的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,其特征在于,步骤二中,目标蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或胰蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,其特征在于,步骤三中,第二种目标蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或胰蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的榛仁蛋白双酶解的工艺方法,其特征在于,步骤三中,所述榛仁蛋白水解液的水解度为39.67±0.3%。
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