CN111978342A - 一种靶向egfr的荧光淬灭探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子探针技术领域，公开了一种靶向EGFR的荧光淬灭探针及其制备方法和应用，该荧光淬灭探针的结构包括有药效骨架结构、荧光淬灭基团和荧光标记基团，所述荧光标记基团选择BODIPY FL染料；所述荧光淬灭基团选择2，4‑二硝基苯酚。其中，药效骨架结构可与EGFR蛋白靶向结合，分子探针中的淬灭基团离去，则所述荧光标记基团可进行特异性示踪、成像；利用分子影像学可对特定细胞和分子的表达过程进行实时观测，对目标靶点进行追踪，从而在分子病理水平实现对疾病发展状况的评估以及实现肺癌患者EGFR突变分型的精准检测。
Description
技术领域
本发明属于分子探针技术领域，特别涉及一种靶向EGFR的荧光淬灭探针及其制备方法与应用。
背景技术
近年来小分子靶向药物应用非常广泛，靶向药物的出现是临床肿瘤治疗的重大突破之一。例如，吉非替尼(易瑞沙)和厄洛替尼(特罗凯)是治疗非小细胞肺癌的两种靶向药物，属于表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)。
然而，靶向药物用于治疗肺癌的关键是精准检测肺癌EGFR突变分型。
在临床上，对非小细胞肺癌患者使用TKI靶向药物前需先进行EGFR基因突变状况的检测。然而，以目前现有的技术手段很难实现肺癌患者EGFR突变分型的精准检测，其面临的问题主要包括以下几个方面：
1)首先，肺癌具有非常复杂的异质性，包括个体异质性、空间异质性及时间异质性。个体异质性是指不同的肺癌患者，其EGFR突变分型存在很大的差异；空间异质是指在不同病灶、同一病灶的不同位置其EGFR的突变分型也不一样；时间异质是指在不同时间段的EGFR突变分型又存在一个动态变化的差异。因此，在活体水平实现对EGFR突变状态的实时、动态及精准的检测方法可解决肺癌异质性的问题。
2)其次，现有的EGFR突变检测方法均具有一定局限性，例如利用分子病理检测EGFR突变存在可重复性差、无法克服空间异质性的问题；相对而言，分子检测更加便捷、重复性好，但缺点是不能直接获得原发灶的突变情况、肺癌原发灶和转移灶内的异质性问题无法解决。
此外，利用CT、磁共振等传统影像学方法也不能从分子层面反映EGFR分子分型的信息。因而，为进一步突破肺癌精准诊断与治疗的瓶颈，迫切需要发展一种全新的检测技术从分子水平准确揭示EGFR的突变情况。
发明内容
为解决现有技术中，不能实现肺癌精准诊断的技术问题，发明人在研究过程中了解到，将荧光基团引入到靶向药物分子中，设计合成具有靶向特异性的生物活性荧光探针，方便研究靶标分子的生理/病理功能，探索药物分子的作用机制。
上市靶向药物吉非替尼(Gefitinib)、阿法替尼(Afatinib)以EGFR为靶标竞争性结合在该蛋白上的ATP结合域，干扰下游信号转导，抑制肿瘤的生长。以靶向药物的药效骨架结构也是当前EGFR分子探针设计的关键，通常将多种成像基团与骨架结构连接，可构建不同种类的分子探针。
基于此，本发明的首要目的在于提供一种靶向EGFR的荧光淬灭探针，通过反应基团可与EGFR蛋白靶向结合，分子探针中的淬灭基团离去，则所述荧光标记基团可进行特异性示踪、成像。
本发明的另一目的在于提供一种靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种靶向EGFR的荧光淬灭探针，结构式如下：
上述结构式中，R1为H、F或Cl中的任意一种；
R2为H、F、Cl或炔基中的任意一种。
在本发明中，该荧光淬灭探针的结构包括有药效骨架结构、荧光淬灭基团和荧光标记基团，所述荧光标记基团选择BODIPY FL染料；所述荧光淬灭基团选择2，4-二硝基苯酚。其中，药效骨架结构可与EGFR蛋白靶向结合，分子探针中的淬灭基团离去，则所述荧光标记基团可进行特异性示踪、成像。
进一步地，当所述靶向EGFR的荧光淬灭探针采用BODIPY FL染料绿色荧光检测时，结构式如下：
本发明还提供一种靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，包括：
制得第一中间体；
所述第一中间体的分子式为：
通过第一中间体制得第二中间体；
所述第二中间体的分子式为：
制得第三中间体；
所述第三中间体的分子式为：
通过第三中间体制得第四中间体；
所述第四中间体的分子式为：
通过第二中间体和第四中间体制得第五中间体体；
所述第五中间体的分子式为：
通过第五中间体制得第六中间体；
所述第六中间体的分子式为：
通过第六中间体与BODIPY FL染料制得所述靶向EGFR的荧光淬灭探针。
本发明经过大量实验验证与探索，最终确实了上述合成路线及制备方法，处理过程简单、方便操作。
进一步地，第一中间体的制备步骤包括：
将乙醇酸乙酯加入碳酸钠的四氢呋喃溶液中进行反应后，加入1-溴-2,4-二硝基苯；
上述混合物继续反应完成后，在真空下浓缩处理；
浓缩后进行萃取、洗涤，然后收集萃取液依次进行干燥、浓缩、纯化后得到第一中间体。上述制备过程简单、容易操作，而且产率高。
进一步地，第二中间体的制备步骤包括：
在第一中间体中加入浓盐酸并加热；
反应完全后，冷却至室温，并倒入水中，用乙酸乙酯进行萃取；
收集乙酸乙酯有机相后依次进行洗涤、干燥、浓缩后得到第二中间体。上述制备过程简单、容易操作，而且产率高。
进一步地，第三中间体的制备步骤包括：
将氰化钠与二甲基甲酰胺混合搅拌得到混合液，然后，将溶解在二甲基甲酰胺中的2-羟基乙基氨基甲酸叔丁酯倒入上述混合液中，然后再加入溶解在二甲基甲酰胺中的反应原料，加热并搅拌；
再加入饱和碳酸氢钠溶液，并用乙酸乙酯萃取后，得到乙酸乙酯有机相后依次进行洗涤、干燥、浓缩、纯化后得到第三中间体；上述制备过程简单、容易操作。
所述反应原料的分子式如下：
进一步地，第四中间体的制备步骤包括：
将第三中间体和氯化铵溶于乙醇溶液中，再加入铁粉，加温搅拌；
过滤并将滤饼用乙酸乙酯洗涤，收集乙酸乙酯有机相，依次进行干燥、浓缩、纯化后得到第四中间体。上述制备过程简单、容易操作。
进一步地，第五中间体的制备步骤包括：
将第二中间体溶于二甲基甲酰胺溶液中，再加入二异丙基乙二胺、第四中间体和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，反应后用水淬灭反应，并用乙酸乙酯进行萃取；
收集乙酸乙酯有机相后依次进行干燥、浓缩和纯化，得到第五中间体。上述制备过程简单、容易操作。
进一步地，第六中间体的制备步骤包括：
将第五中间体溶于二氯甲烷溶液中，再加入三氟乙酸，反应后得到反应混合物；
用碳酸氢钠将反应混合物的pH值调节至8-9，然后依次进行过滤、浓缩、纯化后得到第六中间体。上述制备过程简单、容易操作。
进一步地，通过第六中间体制备所述靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备步骤包括：
将BODIPY FL染料溶于二甲基甲酰胺溶液中，加入N,N-二异丙基乙胺、第六中间体和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
反应后用水进行淬灭反应，并用乙酸乙酯进行萃取；
收集乙酸乙酯有机相，依次进行洗涤、干燥、浓缩、纯化后得到所述靶向EGFR的荧光淬灭探针。上述制备过程简单、容易操作。
本发明还提供一种靶向EGFR的荧光淬灭探针在肿瘤细胞的示踪定位的应用或者在EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物活性评价中的应用。
本发明的有益效果在于：相比于现有技术，本发明的靶向EGFR的荧光淬灭探针包括有药效骨架结构、荧光淬灭基团和荧光标记基团，所述荧光标记基团选择BODIPY FL染料；所述荧光淬灭基团选择2，4-二硝基苯酚。其中，药效骨架结构可与EGFR蛋白靶向结合，分子探针中的淬灭基团离去，则所述荧光标记基团可进行特异性示踪、成像。
本发明还提供一种靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法及应用，其制备出的荧光淬灭探针作为荧光成像试剂能够应用于EGFR及其突变体蛋白高表达的肿瘤细胞的示踪定位；或者在EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物活性评价中的应用。
附图说明
图1所示为本发明的靶向EGFR的荧光淬灭探针的总合成路线图。
图2所示为本发明的靶向EGFR的荧光淬灭探针的1H-NMR核磁谱图。
图3所示为荧光淬灭探针的1H-NMR核磁谱图的局部放大示意图1。
图4所示为荧光淬灭探针的1H-NMR核磁谱图的局部放大示意图2。
图5所示为本发明的靶向EGFR的荧光淬灭探针的13C-NMR核磁谱图。
图6所示为HX06对EGFR野生型(w.t.)及其突变体(L858R,T790M)的抑制活性(IC50值)曲线图。
图7所示为HX06及其相关荧光基团(BODIPY)在不同发射波长的发射光强度对比图。
图8所示为HX06及其相关荧光基团(BODIPY)在520nm的发射光强度对比图。
图9所示为实验三的凝胶电泳示意图。
图10所示为实验三的将荧光条带进行荧光强度定量检测后的对比图。
图11所示为实验四的检测HX06与巯基反应的特异性对比示意图。
图12所示为实验四的检测EGFR的特异性标记对比示意图。
图13所示为实验五的荧光成像示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施案例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种靶向EGFR的荧光淬灭探针，结构式如下：
其制备方法，包括：
步骤1：制得第一中间体；
所述第一中间体的分子式为：
具体地，将乙醇酸乙酯(8.4g，80.8mmol)加入到碳酸钠(16.8g，158.4mol)的四氢呋喃(50mL)溶液中。反应混合物在室温条件下搅拌，反应持续1h后，加入反应原料1-溴-2,4-二硝基苯(2.0g，4mmol)。
混合物继续在室温条件下搅拌反应24小时。通过TLC检测反应完毕后，在真空下浓缩反应混合物，在浓缩后的反应混合物中加入二氯甲烷和水进行萃取，用饱和氯化钠溶液洗涤。收集二氯甲烷的萃取液，用无水硫酸钠进行干燥、浓缩。最后，将浓缩的混合物进行硅胶柱层析纯化，得到第一中间体(1.52g，产率70％)，为白色固体。
化合物结构确证数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.30(s,1H),8.67(d,J＝3.0Hz,1H),7.82(d,J＝3.3Hz,1H),5.03(s,2H),4.55–4.52(m,2H),2.18–2.14(m,3H)。
步骤2：通过第一中间体制得第二中间体；
所述第二中间体的分子式为：
具体地，在第一中间体(1g，4mmol)中加入20mL浓盐酸并加热至100℃。通过TLC监测反应，在8小时后，将反应液冷却至室温，并倒入20mL水中，用乙酸乙酯萃取三次。收集乙酸乙酯有机相，用饱和氯化钠溶液进行洗涤，然后用无水硫酸钠干燥、浓缩，得到所需第二中间体(0.64g，产率71％)，为黄色固体。
化合物结构确证数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.35(s,1H),8.70(d,J＝3.3Hz,1H),7.80(d,J＝3.3Hz,1H),4.82(s,2H)。
步骤3：制得第三中间体；
所述第三中间体的分子式为：
具体地，在0℃下搅拌氢化钠(0.25g，10.5mmol)和二甲基甲酰胺DMF(20mL)得到混合液。然后，将溶解在10mL二甲基甲酰胺DMF中的2-羟基乙基氨基甲酸叔丁酯(1.27g，7.87mmol)缓慢加入到上述混合液中，搅拌30分钟。
然后将溶解在20mL二甲基甲酰胺DMF中的反应原料(1.76g，5.25mmol)溶液在20分钟内缓慢加入到混合液中，缓慢加热至室温并搅拌4小时。加入50mL饱和碳酸氢钠溶液，并将溶液用50mL乙酸乙酯萃取两次，分离得到的有机相用50mL蒸馏水洗涤，干燥并浓缩。最后，用硅胶柱色谱法纯化产物，得到白色固体第三中间体(1.5g，产率60％)。
LC-MS m/z:C21H21ClFN5O5[M+H]+理论值:477.1,检测值：478.2。
化合物结构确证数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),9.51(s,1H),8.40(s,1H),8.10(s,1H),8.09(d,J＝6.8Hz,1H),7.79–7.75(m,2H),6.96(s,1H),4.15(t,J＝5.6Hz,2H),3.12(t,J＝5.2Hz,2H),1.40(s,9H)。
步骤4：通过第三中间体制得第四中间体；
所述第四中间体的分子式为：
具体地，在第三中间体(1.5g，3.1mmol)和氯化铵(1.3g，25.2mmol)的乙醇(20mL)溶液中加入铁粉(1.4g，25.2mmol)，在70℃下搅拌8小时。将混合物过滤并将滤饼用乙酸乙酯(35mL)洗涤两次。将乙酸乙酯有机相干燥、浓缩后，用硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到第四中间体(0.9g，产率64％)，为黄色固体。
LC-MS m/z:C21H23ClFN5O3[M+H]+理论值:447.1,检测值：448.2。
化合物结构确证数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.58(s,1H),8.51(s,1H),8.14(dd,J＝6.8,2.6Hz,1H),7.86–7.75(m,2H),7.45(t,J＝9.0Hz,1H),7.19(s,1H),6.92(s,1H),4.16(t,J＝5.6Hz,2H),3.14(t,J＝5.2Hz,2H),1.39(s,9H)。
步骤5：通过第二中间体和第四中间体制得第五中间体体；
所述第五中间体的分子式为：
具体地，在第二中间体(242mg，1mmol)的二甲基甲酰胺DMF(20mL)溶液中加入二异丙基乙二胺(258mg，2mmol)，第四中间体(447mg，1mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HATU(570mg，1.5mmol)。将混合物在室温下搅拌反应2小时后，用水淬灭反应，并用乙酸乙酯进行萃取。将乙酸乙酯有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，然后用硫酸钠进行干燥，将有机溶剂浓缩后，将浓缩混合物进行硅胶柱色谱法纯化，得到第五中间体，为黄色固体(268mg，产率40％)。
LC-MS m/z:C29H27ClFN7O9[M+H]+理论值:671.2,检测值：672.2。
化合物结构确证数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,):δ9.89(s,1H),9.00-8.82(m,1H),8.65-8.24(m,1H),8.48-8.50(m,2H),8.02(dd,J＝12.0,5.0Hz,1H),7.75-7.72(m,1H),7.67(d,J＝9.4Hz,1H),7.42-7.40(m,1H),7.26(s,1H),4.56-4.53(m,1H),4.23-4.18(m,1H),4.01-4.05(m,3H),3.06-3.02(m,1H)，1.39(s,9H).
步骤6：通过第五中间体制得第六中间体；
所述第六中间体的分子式为：
具体地，在第五中间体(268mg，0.4mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中加入三氟乙酸(1.0mL)，在室温下搅拌反应2h。用碳酸氢钠将反应混合物的pH值调节至8-9，然后进行过滤，将滤液进行浓缩，所得混合物利用HPLC进行纯化，得到第六中间体(114mg，产率50％)，为棕色固体。
LC-MS m/z:C24H19ClFN7O7[M+H]+理论值:571.1,检测值：572.1。
化合物结构确证数据为：1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,):δ9.86(s,1H),9.04-8.96(m,1H),8.82-8.74(m,1H),8.56-8.52(m,2H),8.08(dd,J＝12.0,5.2Hz,1H),7.76-7.74(m,1H),7.64(d,J＝9.6Hz,1H),7.44-7.39(m,1H),7.31(s,1H),4.59-4.57(m,1H),4.29-4.27(m,1H),4.06-4.04(m,3H),3.10-3.08(m,1H).
步骤7：通过第六中间体与BODIPY FL染料制得所述靶向EGFR的荧光淬灭探针；
具体地，在原料BODIPY FL染料(20mg，0.068mmol)的二甲基甲酰胺DMF(2mL)溶液中，加入N,N-二异丙基乙胺DIEA(18mg，0.14mmol)，第六中间体(41mg，0.07mmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HATU(31mg，0.082mmol)。然后，反应混合液在室温条件下搅拌反应2小时，TLC检测反应完全后，用水进行淬灭反应，并用乙酸乙酯进行萃取。所得乙酸乙酯有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，合并有机相，用硫酸钠干燥，浓缩后，将所得混合物进行纯化，得到终产物为靶向EGFR的荧光淬灭探针，简称HX06(18mg，产率31％)，为红棕色固体。LC-MS m/z:C38H32BClF3N9O8[M+H]+理论值:845.2,检测值：846.2。
化合物结构确证数据为：1H NMR(800MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),9.56(s,1H),9.00(s,1H),8.75(d,J＝2.8Hz,1H),8.59(d,J＝3.3Hz,1H),8.50(dd,J＝9.3,2.8Hz,1H),8.33(t,J＝5.8Hz,1H),8.14(dd,J＝6.8,2.6Hz,1H),7.83-7.80(m,1H),7.62(d,J＝9.6Hz,1H),7.62(s,1H),7.47(t,J＝9.1Hz,1H),7.37(s,1H),7.02(d,J＝3.9Hz,1H),6.36(d,J＝4.0Hz,1H),6.29(s,1H),5.35(s,2H),4.34(t,J＝5.3Hz,2H),3.69-3.66(m,2H),3.14(t,J＝7.6Hz,2H),2.63(dd,J＝14.8,7.2Hz,2H),2.46(s,3H),2.27(s,3H)。
13C NMR(201MHz,DMSO-d6)δ172.49,165.35,159.71,157.86,157.38,155.75,154.29,153.57,153.08,149.14,144.55,140.43,138.81,137.24(d,J＝4.02Hz),134.89,133.27,129.59,129.09,127.17,125.59,124.25,123.18,121.75(d,J＝6.03Hz),120.69,119.13(d,J＝18.09Hz),116.90(d,J＝22.11Hz),116.53,113.69,109.53,107.54,79.42,69.04,68.55,38.39,34.33,24.43,14.87,11.36。
本发明经过大量实验验证与探索，最终确实了上述合成路线及制备方法，处理过程简单、方便操作。
本发明还提供一种靶向EGFR的荧光淬灭探针在肿瘤细胞的示踪定位的应用或者在EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物活性评价中的应用。
以下结合具体实验进一步地对本发明的靶向EGFR的荧光淬灭探针(简称HX06)进行说明。
实验一
激酶活性实验：通过激酶活性实验测试荧光淬灭探针HX06对EGFR野生型(w.t.)及其突变体(L858R,T790M)的抑制活性(IC50值)。
如图6所示，实验结果表明，荧光淬灭探针HX06对EGFR野生型及EGFR L858R突变型具有较强的抑制作用，其IC50值分别为89nM和34nM。
荧光淬灭探针HX06对EGFR T790M突变型也具有一定的抑制作用，但其活性弱于EGFR野生型及EGFR L858R突变型。
因此，荧光淬灭探针HX06对EGFR野生型及EGFR突变型具有一定结合作用。
实验二
荧光光谱实验：通过检测荧光淬灭探针HX06及其相关荧光基团(采用BODIPY FL染料)在488nm激发光下的荧光强弱，从而探究荧光淬灭探针HX06的荧光淬灭效率。
如图7-8所示，实验结果表明单一的BODIPY荧光基团在520nm具有很强的发射光，而荧光淬灭探针HX06在500-650nm范围内无明显发射光。
通过定量分析BODIPY和荧光淬灭探针HX06在520nm的发射光强度，进一步表明HX06具有很高的荧光淬灭效率。
实验三
凝胶荧光成像实验：将荧光淬灭探针HX06(5μM)加入到EGFR及其突变体(L858R,T790M)中孵育30分钟，然后将所得样品用SDS-PAGE凝胶电泳进行荧光分析，检测荧光淬灭探针是否能够标记靶标蛋白EGFR突变体L858R和T790M。
另外，通过竞争性实验可进一步验证荧光淬灭探针标记的EGFR突变体L858R和T790M的靶向性，即在孵育荧光淬灭探针HX06之前，先将EGFR的抑制剂(吉非替尼，阿法替尼和HX07)加入到EGFR突变体L858R和T790M中孵育30分钟，然后再加入荧光淬灭探针HX06，最后通过凝胶电泳比较分析，荧光淬灭探针标记的EGFR突变体L858R和T790M的条带是否会被EGFR抑制剂阻断，即条带消失。
如图9-10所示，实验结果表明，荧光淬灭探针HX06可靶向性标记EGFR突变体L858R和T790M，且其标记的条带均可被三种所测EGFR抑制剂阻断。其中，从HX06标记的荧光条带的强度可明显看出探针对EGFR突变体L858R的标记效果高于EGFR野生型及EGFR突变体T790M。
另外，将荧光条带进行定量检测分析后，可明显表明HX06标记的EGFR及其突变体L858R和T790M均可被EGFR抑制剂抑制，且HX06对EGFR突变体L858R的标记效果更佳。以上实验表明，HX06可用于标记EGFR及其突变体L858R和T790M，且其标记作用具有一定靶向性。
实验四
验证HX06对EGFR标记的特异性实验：为验证荧光淬灭探针HX06对EGFR的标记具有特异性，将荧光淬灭探针与其他靶点进行孵育，从而检测荧光淬灭探针与其他靶点是否也具有结合作用。
如图11-12所示，其中，BSA中含有活泼巯基，可检测荧光淬灭探针HX06与巯基反应的特异性，进一步验证HX06靶向EGFR的特异性；AKT作为信号通路中另一重要激酶，检测HX06与AKT的结合可进一步验证HX06靶向EGFR的特异性。实验结果表明，HX06仅对EGFR具有明显标记，进一步验证荧光淬灭探针HX06对EGFR的标记具有特异性。
实验五
活细胞成像实验：为验证荧光淬灭探针HX06是否可用EGFR及其突变体高表达的细胞系中进行靶向示踪及定位，本实验选择两种细胞Hela(EGFR野生型)和H1975(EGFRL858R/T790M)进行荧光淬灭探针HX06的应用研究。
将5μM的荧光淬灭探针HX06加入都细胞中孵育30分钟后，直接用激光共聚焦对测试细胞进行荧光检测。
如图13所示，实验结果表明，HX06在Hela和H1975中均具有很强的荧光信号，且荧光信号具有特异性。由于该探针为荧光淬灭型探针，当荧光淬灭探针跟靶蛋白无结合时，其背景荧光信号很低，当荧光淬灭探针与靶蛋白结合后，荧光信号会迅速增强，因此荧光淬灭探针HX06具有较低信噪比，较高的准确性及靶向性，适合在细胞、组织切片等中进行EGFR的靶向示踪和定位。
综合上述实验可知，本发明所得的靶向EGFR的荧光淬灭探针具有靶向定位高表达EGFR及其突变体(L858R,T790M等)蛋白的肿瘤细胞，并将所携荧光分子定向转移至EGFR及其突变体高表达的区域，具有良好的生物相容性、稳定性、低毒性等优点，可实现对肿瘤等病理部位EGFR及其突变体的特异性结合和荧光成像。
本发明的荧光淬灭探针靶向性高、制备成本低廉，实用性强；本发明所述荧光淬灭探针具有荧光点燃(turn-on)的特性，背景信号低，对于高浓度、长时间的细胞实时、动态成像更适合；此外，所述荧光淬灭探针对细胞生长具有低毒性，可在活细胞中进行示踪、成像。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向EGFR的荧光淬灭探针，其特征在于，结构式如下：
上述结构式中，R1为H、F或Cl中的任意一种；
R2为H、F、Cl或炔基中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针，其特征在于，结构式如下：
3.一种靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，其特征在于，包括：
制得第一中间体；
所述第一中间体的分子式为：
通过第一中间体制得第二中间体；
所述第二中间体的分子式为：
制得第三中间体；
所述第三中间体的分子式为：
通过第三中间体制得第四中间体；
所述第四中间体的分子式为：
通过第二中间体和第四中间体制得第五中间体体；
所述第五中间体的分子式为：
通过第五中间体制得第六中间体；
所述第六中间体的分子式为：
通过第六中间体与BODIPY FL染料制得所述靶向EGFR的荧光淬灭探针。
4.根据权利要求3所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，其特征在于，第一中间体的制备步骤包括：
将乙醇酸乙酯加入碳酸钠的四氢呋喃溶液中进行反应后，加入1-溴-2,4-二硝基苯；
上述混合物继续反应完成后，在真空下浓缩处理；
浓缩后进行萃取、洗涤，然后收集萃取液依次进行干燥、浓缩、纯化后得到第一中间体。
5.根据权利要求3所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，其特征在于，第二中间体的制备步骤包括：
在第一中间体中加入浓盐酸并加热；
反应完全后，冷却至室温，并倒入水中，用乙酸乙酯进行萃取；
收集乙酸乙酯有机相后依次进行洗涤、干燥、浓缩后得到第二中间体。
6.根据权利要求3所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，其特征在于，第三中间体的制备步骤包括：
将氰化钠与二甲基甲酰胺混合搅拌得到混合液，然后，将溶解在二甲基甲酰胺中的2-羟基乙基氨基甲酸叔丁酯倒入上述混合液中，然后再加入溶解在二甲基甲酰胺中的反应原料，加热并搅拌；
再加入饱和碳酸氢钠溶液，并用乙酸乙酯萃取后，得到乙酸乙酯有机相后依次进行洗涤、干燥、浓缩、纯化后得到第三中间体；
所述反应原料的分子式如下：
7.根据权利要求3所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，其特征在于，第四中间体的制备步骤包括：
将第三中间体和氯化铵溶于乙醇溶液中，再加入铁粉，加温搅拌；
过滤并将滤饼用乙酸乙酯洗涤，收集乙酸乙酯有机相，依次进行干燥、浓缩、纯化后得到第四中间体。
8.根据权利要求3所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，其特征在于，第五中间体的制备步骤包括：
将第二中间体溶于二甲基甲酰胺溶液中，再加入二异丙基乙二胺、第四中间体和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，反应后用水淬灭反应，并用乙酸乙酯进行萃取；
收集乙酸乙酯有机相后依次进行干燥、浓缩和纯化，得到第五中间体；
第六中间体的制备步骤包括：
将第五中间体溶于二氯甲烷溶液中，再加入三氟乙酸，反应后得到反应混合物；
用碳酸氢钠将反应混合物的pH值调节至8-9，然后依次进行过滤、浓缩、纯化后得到第六中间体。
9.根据权利要求3所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备方法，其特征在于，通过第六中间体制备所述靶向EGFR的荧光淬灭探针的制备步骤包括：
将BODIPY FL染料溶于二甲基甲酰胺溶液中，加入N,N-二异丙基乙胺、第六中间体和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
反应后用水进行淬灭反应，并用乙酸乙酯进行萃取；
收集乙酸乙酯有机相，依次进行洗涤、干燥、浓缩、纯化后得到所述靶向EGFR的荧光淬灭探针。
10.一种根据权利要求1所述的靶向EGFR的荧光淬灭探针在肿瘤细胞的示踪定位的应用或者在EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物活性评价中的应用。
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| CN103097533A (zh) * | 2010-02-26 | 2013-05-08 | 固德基因公司 | Y型探针及其变形型及利用该y型探针的dna微陈列、试剂盒以及基因分析方法 |
| CN107629077A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-01-26 | 深圳市声光动力生物医药科技有限公司 | 酸敏感的吉非替尼‑氟硼二吡咯衍生物及其制备方法和在医药上的应用 |
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