CN116003339B - 一种巨噬细胞迁移抑制因子mif双光子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种巨噬细胞迁移抑制因子mif双光子荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针及其制备方法和应用，所述探针结构如下任意一种，本发明包括了探针MIFP1～MIFP3，用于细胞内MIF的实时成像和追踪，从而建立了癌症疾病过程中MIF的波动与荧光信号变化之间的关系。凭借双光子探针成像的优良光学特性，可以通过代表性探针MIFP3轻松区分多种癌细胞和正常细胞。此外，MIFP3还被成功用于直接识别临床肝癌患者的病理组织。这些潜在的MIF探针可以为进一步研究MIF的生理功能提供有力的工具，并将有助于促进MIF相关恶性肿瘤的准确诊断和治疗评估。

Description

一种巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一种由114个氨基酸组成的多肽，是一种重要的多功能细胞因子。MIF广泛存在于各种细胞中并参与细胞活动，而MIF的水平异常被认为伴随着一些疾病的发病机制，包括炎症性和免疫性疾病，如关节炎、神经炎、动脉硬化和红斑狼疮等。越来越多的研究也表明MIF与神经系统疾病有关，如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、癫痫和其他神经系统疾病。MIF的过量表达有希望成为癌症(包括肝癌)早期鉴别诊断的重要病理标志。特别是在肝细胞癌的研究中，还发现MIF能协同诱导肝细胞癌细胞的生长，这使得通过调节MIF的表达和功能抑制肝细胞癌的生长成为可能。鉴于MIF是早期诊断的指标，是潜在的治疗目标，也是肝细胞癌(HCC)进展和患者预后的生物标志物，因此可靠地绘制MIF的水平是非常重要的。
尽管可靠地检测MIF很重要，但由于缺乏有效的方法来绘制细胞内MIF的分布图，这仍然是一个严峻的挑战。大多数报道的检测方法主要集中在体外间接方法，如Western印迹分析、共聚焦免疫荧光、免疫组织化学等。基于活性的探针传感策略允许以非侵入性的方式对生物标志物进行实时成像，由于其简单、高灵敏度、非侵入性和低成本，为生物标志物成像提供了一种强大的方法我们开发了一系列基于WRK活性的探针，对催化的N端脯氨酸显示出独特的反应性，用于特异性标记MIF。虽然我们通过铜或非铜辅助的点击化学策略成功实现了细胞内MIF的成像，但对生物毒性铜催化剂的要求或对两步标记的依赖使得这些探针在实际生物应用中受到一定限制。最近，也报道了其他与MIF结合的小分子探针被应用于MIF抑制剂的筛选研究，而这些新型的单光子激发探针并没有直接用于追踪内源性MIF在活细胞或组织中的分布。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针，是一种MIF靶向荧光探针，命名为MIFPs，本发明制备的这些探针实现了用一步法对活体细胞和病理组织中的内源性MIF进行特异性成像，其中具有代表性的探针MIFP3表现出优异的双光子特性，可以通过对活细胞或临床病理组织中的MIF进行实时荧光成像，成功应用于肝癌的鉴定和诊断。
本发明还提供巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针，所述MIF双光子荧光包括如下式I-III探针MIFP1～MIFP3中的任意一种：
结构式I的中文名为(E)-5-(3-((4-(2-(3(二氰基亚)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)苯氧基)甲基)苯基)-N-乙基异恶唑三氟甲磺酸盐。
结构式II的中文名为(E)-5-(4-((4-(2-(3-(二氰基亚)-5,5-二甲基环己-1-基)乙烯基)苯氧基)甲基)苯基)-N-乙基异恶唑三氟甲磺酸盐。
结构式Ⅲ的中文名为(E)-5-(4-((6-(2-(3-(二氰基亚)-5,5-二甲基环己烯-1-基)乙烯基)萘-2-基)氧)甲基)苯基)-N-乙基异恶唑三氟甲磺酸盐。
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针的制备方法，式I探针MIFP1的制备包括如下步骤：
反应物1a溶于DMFDMA，搅拌反应，反应结束后除去溶剂得到化合物1b；
将化合物1b、盐酸羟胺溶于甲醇，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物1c；
将化合物1c溶于四氯化碳，然后加入AIBN和NBS，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物1d；
将化合物1e和丙二腈溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1f；
将化合物1f、对羟基苯甲醛溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1g；
将化合物1g、化合物1d、碳酸钾溶于丙酮，回流反应后，除去溶剂得到粗产物，纯化得到产物1h；
将化合物1h溶于CH2Cl2，加入三氟甲烷磺酸乙酯，搅拌反应后，减压浓缩，
重结晶得到固体产物，即为MIFP1；
其反应式如下所示：
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针的制备方法，式II探针MIFP2的制备包括如下步骤：
将反应物2a溶于DMFDMA，搅拌反应，搅拌反应结束后，除去溶剂，得到化合物2b；
将化合物2b和盐酸羟胺溶于甲醇，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2c；
将加入化合物2c溶于四氯化碳，加入AIBN和NBS，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2d；
将化合物1e和丙二腈溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1f；
将化合物1f、对羟基苯甲醛溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1g；
将化合物1g、化合物2d、碳酸钾溶于丙酮，回流反应后，除去溶剂得到粗产物，纯化得到产物2h；
将化合物2h溶于CH2Cl2，加入三氟甲烷磺酸乙酯，搅拌反应后，减压浓缩，
重结晶得到固体产物，即为MIFP2；
其反应式如下所示：
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针的制备方法，式III探针MIFP3的制备包括如下步骤：
将反应物2a溶于DMFDMA，搅拌反应，搅拌反应结束后，除去溶剂，得到化合物2b；
将化合物2b和盐酸羟胺溶于甲醇，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2c；
将加入化合物2c溶于四氯化碳，加入AIBN和NBS，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2d；
将化合物1e和丙二腈溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1f；
将化合物1f、6-羟基2-萘甲醛溶于乙醇，加入催化量哌啶，搅拌反应，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物3g；
将化合物3g、化合物2d、碳酸钾溶于丙酮，回流反应后，除去溶剂得到粗产物，纯化得到产物3h；
将化合物3h溶于CH2Cl2，加入三氟甲烷磺酸乙酯，搅拌反应后，减压浓缩，重结晶得到固体产物，即为MIFP3；
其反应式如下所示：
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在检测MIF中的应用。
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备用于细胞内MIF的实时成像和追踪的试剂或者工具中的应用。
其中，所述细胞包括不同类型的细胞系，可分为癌细胞和正常细胞。
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备活细胞内显示MIF的内源性动态变化的试剂或者工具中的应用。
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备临床癌症样本中MIF的动态变化的试剂或者工具中的应用。
本发明所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备癌细胞/组织的成像或者检测其分布的试剂或者工具中的应用。
进一步地，所述癌细胞/组织包括肝癌细胞/组织、肾腺癌细胞/组织、肺癌细胞/组织等。
本发明所述的针对MIF的探针MIFP在体内外识别MIF的应用；其中，所述应用包括探针MIFP1-MIFP3在不同类型的细胞系中对细胞内MIF进行基于活性的感应；所述应用包括探针MIFP3在活细胞内显示MIF的内源性动态变化；所述应用包括探针MIFP3在临床病理样本，如临床癌症样本切片检测MIF的动态变化。
荧光探针MIFP1-MIFP3的设计原理：为了监测体内MIF活性，选择合适的荧光团是成功设计理想探针的关键部分，以用于复杂的生物学背景。为了开发新颖方便的荧光探针，直接追踪活细胞中的内源性MIF，本发明采用经典的供体-π-受体(D-π-A)扩展共轭体系构建电子推拉结构，并选择4-羟基苯甲醛连接良好的电子受体--双氰基异佛尔酮，这使得很容易获得环境敏感的荧光团Fluor.1
(化合物1g)。本发明开发了一系列基于WRK弹头活性的探针，对催化的N端脯氨酸显示出独特的反应性，用于特异性标记MIF，通过化学合成，将MIF靶向的标记弹头连接到这个荧光团上，由此得到了两个用于靶向MIF蛋白的荧光探针，并分别命名为MIFP1和MIFP2，考虑到生理环境的复杂性和活体细胞或组织内生物背景荧光的干扰，设想是否可以通过进一步修改探针结构来增强斯托克移位以减少激发和荧光发射之间的串扰，或者通过引入双光子荧光核心来实现双光子长波长激发，从而提高成像的信噪比。为此，本发明用6-羟基-2-萘甲醛这种具有双光子特性的荧光团取代对羟基苯甲醛，然后得到荧光团Fluor.2(化合物有3g)，进一步构建新的探针MIFP3。在此，本发明报告了一系列新的MIF靶向荧光探针，命名为MIFPs。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)作为一种重要的细胞因子，在癌症和其他一些疾病的发病机制中发挥着重要作用，也是疾病治疗的潜在药物靶点之一。然而，由于缺乏简单有效的MIF成像检测工具，MIF在活体细胞或病变部位的表达波动情况和分布仍然难以精确和实时追踪。本发明制备了一系列新的MIF靶向荧光探针，命名为MIFPs，这些探针是通过将MIF靶向弹头直接附着在具有环境敏感表征的荧光团上而构建的，这首次实现了用一步法对活体细胞和病理组织中的内源性MIF进行特异性成像。重要的是，具有代表性的探针MIFP3表现出优异的双光子特性，可以通过对活细胞或临床病理组织中的MIF进行实时荧光成像，成功应用于肝癌的鉴定和诊断。本发明构建的探针为今后MIF相关的研究工作提供了一种新颖、便捷的双光子荧光成像工具，对促进MIF蛋白相关生物医学的发展具有重要意义。
本发明制备了基于活性的荧光探针，命名为MIFP1～MIFP3，用于细胞内MIF的实时成像和追踪，从而建立了癌症疾病过程中MIF的波动与荧光信号变化之间的关系。凭借双光子探针成像的优良光学特性，可以通过代表性探针MIFP3轻松区分多种癌细胞和正常细胞。此外，MIFP3还被成功用于直接识别临床肝癌患者的病理组织。这些潜在的MIF探针可以为进一步研究MIF的生理功能提供有力的工具，并将有助于促进MIF相关恶性肿瘤的准确诊断和治疗评估。
MIF的可靠检测非常重要，但由于缺乏有效的方法来绘制细胞内MIF的分布图，这仍然是一个严峻的挑战。目前大多数报道的检测方法主要集中在体外间接方法，如Western印迹分析、共聚焦免疫荧光、免疫组织化学等，本发明开发了一系列基于活性的探针传感策略允许以非侵入性的方式对MIF这种生物标志物进行实时成像，其简单且可以一步到位、高灵敏度、非侵入性和低成本，为生物标志物成像提供了一种强大的方法，此外，MIFP3也被成功用于直接识别临床肝癌患者的病理组织。这些潜在的MIF探针可以为进一步研究MIF的生理功能提供有力的工具，并将有助于促进MIF相关恶性肿瘤的准确诊断和治疗评估。
本发明在MIFP3的结构中引入具有双光子性质的萘环以赋予MIFP3优异的双光子性质，在和MIF反应后MIFP3的双光子截面可以增加到200GM。这可以有效的在生物成像中避免生组织本身的自发光现象，减少成像的干扰和误差，进一步提高成像的精度。此外由于萘环的引入，对比MIFP1和MIFP2增加了整个分子结构的共轭长度，会使得MIFP3的发射发生一定的红移，更偏向近红外，增加探针成像的能力。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明构建了全新结构的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针，首次实现了用一步法对活体细胞和病理组织中的内源性MIF进行特异性成像，而无需涉及铜。重要的是，其中具有代表性的探针MIFP3表现出优异的双光子特性，可以通过对活细胞或临床病理组织中的MIF进行实时荧光成像，成功应用于肝癌的鉴定和诊断。本发明构建的探针为MIF相关的研究工作提供了一种新颖、便捷的双光子荧光成像工具，对促进MIF蛋白相关生物医学的发展具有重要意义。
本发明的针对MIF的荧光探针的制备合成方法，合成路线新颖，简单易行，成本较低，原料利用率高适合于工业化生产。
附图说明
图1中A为本发明所列MIFP1～MIFP3的化学结构；B为本发明所列MIFP1～MIFP3与MIF响应前后的荧光光谱图；C为MIFP1-MIFP3在乙醇中的Stokes位移示意图；D为本发明所列MIFP1～MIFP3的光学性质表；E为本发明所列MIFP1～MIFP3和MIF蛋白作用的分子对接模拟示意图。
图2为本发明所列MIF1-MIFP3与MIF响应前后的紫外吸收光谱图。
图3为本发明所列MIFP1本身的吸收(a)、激发(b)、发射归一化(c)图。
图4为本发明所列MIFP2本身的吸收(a)、激发(b)、发射归一化(c)图。
图5为本发明所列MIFP32本身的吸收(a)、激发(b)、发射归一化(c)图。
图6为本发明所列MIFP1与癌细胞和正常细胞裂解液孵育后的荧光光谱图，其中(a)为MIFP1(10μM)分别与PBS缓冲液、HLF正常细胞或A549癌细胞(10mg/mL)的细胞裂解液在310K下孵育20分钟后的荧光光谱，(b)为为MIFP2(10μM)分别与PBS缓冲液、HLF正常细胞或A549癌细胞(10mg/mL)的细胞裂解液在310K下孵育20分钟后的荧光光谱，(c)为MIFP3(10μM)分别与PBS缓冲液、HLF正常细胞或A549癌细胞(10mg/mL)的细胞裂解液在310K下孵育20分钟后的荧光光谱，(d)为MIFP1(10μM)分别与PBS缓冲液、HLF正常细胞或A549癌细胞(10mg/mL)的细胞裂解液在310K下孵育20分钟后565nm处荧光强度的定量，(e)为MIFP2(10μM)分别与PBS缓冲液、HLF正常细胞或A549癌细胞(10mg/mL)的细胞裂解液在310K下孵育20分钟后565nm处荧光强度的定量，(f)为MIFP3(10μM)分别与PBS缓冲液、HLF正常细胞或A549癌细胞(10mg/mL)的细胞裂解液在310K下孵育20分钟后580nm处荧光强度的定量。
图7中a为本发明所列MIFP1与不同细胞系孵育后的流式细胞图；b为本发明所列MIFP2与不同细胞系孵育后的流式细胞图；c为本发明所列MIFP3与不同细胞系孵育后的流式细胞图。
图8中A为本发明所列MIFP3与不同细胞系孵育后的荧光光强度值；B为本发明所列MIFP1～MIFP3与HepG2和L02细胞孵育后的荧光光强度值；C为本发明所列MIFP3的双光子截面值，D为双光子激发下的荧光光谱图；E为本发明所列MIFP3与与HepG2和L02细胞孵育后的荧光光谱图，F为本发明所列MIFP3与与HepG2和L02细胞孵育后的紫外吸收光谱图。
图9为本发明所列MIFP3对不同粘度值的溶液响应荧光光谱(a)和线性拟合图(b)。
图10本发明所列MIFP3和MIF蛋白反应前后的质谱图。
图11为本发明所列MIFP3与不同浓度的MIF反应后的荧光光谱图和线性拟合图。
图12为本发明所列MIFP3体外对不同物质的选择性示意图。
图13为本发明所列MIFP3体外在不同pH值的buffer中的稳定性示意图。
图14为本发明所列MIFP3的细胞毒性MTT图。
图15为MIFP3处理的不同类型的活细胞的共聚焦显微镜图像(A)和荧光强度值(B)用LPS或4-IPP预处理的HepG2细胞与MIFP3孵育的共聚焦显微镜图(C)和荧光强度值(D)；用LPS或4-IPP预处理的HepG2细胞与MIFP3孵育，用流式细胞仪量化相对荧光强度图(E)。
图16为本发明所列MIFP3的细胞器共定位示意图。
图17中A为本发明所列MIFP3与正常组织和临床肝癌组织样本切片孵育后共聚焦图；B和C为本发明所列MIFP3与使用LPS或4-IPP处理后的临床肝癌组织样本切片孵育后共聚焦图以及荧光强度定量图；D为本发明所列MIFP3与正常组织和临床肝癌组织样本切片孵育后深度扫描共聚焦图。
图18中A和B为本发明所列MIFP3与使用不同浓度的LPS或4-IPP处理后临床肝癌组织样本切片孵育后共聚焦图以及荧光定量分析图；
图19为本发明所列MIFP3与临床肝癌组织样本切片孵育后扫描深度共聚焦图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
1、针对MIF的探针MIFP1的制备方法，其制备过程如下：
在氮气气体保护下，(1.34mL，10mmol)3-甲基苯乙酮1a溶于DMF-DMA
(2.64mL，20mmol)120℃加热反应72小时。TLC监测反应结束后，冷却至室温后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤有机层三次，然后收集并在无水Na2SO4上干燥，减压浓缩。无需进一步提纯，即可得到粗品1b(1.77g，93.6％)；
将化合物1b(1.59g，8.66mmol)和盐酸羟胺(662mg，9.52mmol)溶于15mL甲醇，在氮气下于50℃加热8小时。TLC监测反应结束后，冷却到室温后，加入200mL乙酸乙酯，有机层用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤三次，然后收集并在无水Na2SO4上干燥，减压浓缩，并通过硅胶柱色谱法(PE：EA＝50：1-15：1，v/v)提纯，得到透明的油1c(1.03g，74.8％)。
将化合物1c(1.00g，6.29mmol)溶于15mL CCl4中，然后加入NBS(1.14g，6.93mmol)和催化量的偶氮二异丁腈(103mg，0.693mmol)，在77℃加热10小时。反应冷却到室温后，减压浓缩混合物，并通过硅胶柱色谱法(PE：EA＝50：1，v/v)提纯，得到1d(0.96g，66.5％)，为透明油状固体。
将异佛尔酮(化合物1e)(6.9g，50mmol)和丙二腈(3.9g，60mmol)溶于50mL乙醇，向该溶液中加入哌啶(102μL，1mmol)，并在80℃下加热8小时。反应冷却到室温后，减压浓缩，得到粗品。粗品通过无水乙醇重结晶，得到白色固体化合物1f(8,41g，90.3％)。
将化合物1f(1.86g，10mmol)和对羟基苯甲醛(1.22g，10mmol)溶解在干燥的30mL乙醇中，向溶液中加入哌啶(51μL，0.5mmol)，并在80℃下加热8小时。反应冷却到室温后，减压浓缩，得到粗品。将粗品溶解在尽量少的CH2Cl2中，通过滴加正己烷和无水乙醇将溶液重新结晶，得到1g(Fluor.1)，为红色固体(2.47g，80.2％)。
将化合物1g(0.871g，3mmol)、化合物1d(0.784g，3mmol)和K2CO3(0.622克，4.5mmol)溶于20mL丙酮并在60℃加热回流12小时。反应冷却到室温后，通过硅藻土过滤收集滤液。向滤液中加入60mL乙酸乙酯，并分别用5％KOH水溶液(1x 30mL)、饱和盐水(2x30mL)进行洗涤。收集有机层并在无水Na2SO4上干燥。减压浓缩后，通过快速硅胶柱色谱法纯化粗品(DCM：MeOH＝100：1)，得到粗品。将粗品溶解在尽量少的二氯甲烷中，使其恰好溶解，加入无水乙醇重新结晶，得到黄色固体1h(311.5毫克，23.2％)。
将化合物1h(100mg，0.223mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入三氟甲磺酸乙酯(400μL)，在氮气下于室温搅拌过夜。混合物减压浓缩，溶于尽量少的二氯甲烷，用乙醚重结晶，得到黄色固体，即探针MIFP1(62.3mg，44.7％)。.1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.90(s,1H),7.99(s,1H),7.86(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(d,J＝7.7Hz,1H),7.65(t,J＝7.7Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,2H),7.43(s,1H),7.06–6.96(m,3H),6.88(d,J＝16.0Hz,1H),6.81(s,1H),5.21(s,2H),5.01–4.88(m,2H),2.60(s,2H),2.46(s,2H),1.79(t,J＝6.7Hz,3H),1.08(s,6H).13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ17171.22,170.83,159.76,156.83,149.88,143.54,137.95,130.12,129.66,129.02,128.05,127.97,123.00,122.44,122.21,120.07,115.83,114.50,113.70,104.47,75.93,68.97,50.75,42.77,40.51,38.64,32.16,27.92,13.12.HRMS(ESI)＝m/z calculated for[C31H30N3O]+476.23；found 476.2329.
2、针对MIF的探针MIFP2的制备方法，其制备过程如下：
将4-甲基苯乙酮2a(1.34mL，10mmol)溶于DMF-DMA(2.64mL，20mmol)，并在氮气下于120℃加热72小时。TLC监测反应结束后，冷却至室温后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤有机层三次，然后收集并在无水Na2SO4上干燥，减压浓缩。无需进一步提纯，即可得到粗品2b(1.75g，92.5％)。
将化合物2b(1.59g，8.66mmol)和盐酸羟胺(662mg，9.52mmol)溶于15mL甲醇，在氮气下于50℃加热8小时。TLC监测反应结束后，冷却至室温后，加入200mL乙酸乙酯，用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤有机层三次，然后收集有机相，并在无水Na2SO4上干燥，减压浓缩，并通过硅胶柱色谱法(PE：EA＝50：1，v/v)提纯，得到白色固体2c(1.12克，81.2％)。
将化合物2c(1.00g，6.29mmol)溶于15mLCCl4中，加入NBS(1.14g，6.93mmol)和催化量的偶氮二异丁腈(103mL，0.693mmol)，在77℃加热10小时。反应冷却到室温后，将混合物减压浓缩，并通过硅胶柱色谱法(PE：EA＝50：
1-20:1)提纯，得到白色固体2d。
将化合物1g(Fluor.1)(0.871g，3mmol)、化合物2d(0.784g，3mmol)和K2CO3(0.622g，4.5mmol)溶于20mL丙酮并在60℃下加热回流12小时，反应冷却至室温后，通过硅藻土过滤收集滤液。向滤液中加入60mL乙酸乙酯，并分别用5％ KOH水溶液(1x 30mL)和饱和盐水(2x 30mL)洗涤。收集有机层并在无水Na2SO4上干燥。减压浓缩后，粗品通过硅胶柱色谱法(DCM MeOH＝100：1)提纯。将粗品溶解在少量的二氯甲烷中，用无水乙醇滴注重结晶，得到黄色固体2h(209mg，15.6％)。
将化合物2h(30mg，0.0671mmol)溶于二氯甲烷，加入三氟甲磺酸乙酯(150μL)，在室温下氮气搅拌过夜。混合物减压浓缩，溶于尽量少的二氯甲烷，使其刚好完全溶解，后加入乙醚重新结晶，得到黄色固体MIFP2。(MIFP2.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.78(d,J＝2.7Hz,1H),8.12(d,J＝8.0Hz,2H),7.90(d,J＝2.8Hz,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,2H),7.69(d,J＝8.4Hz,2H),7.33–7.24(m,2H),7.09(d,J＝8.4Hz,2H),6.84(s,1H),5.32(s,2H),4.77(m,2H),2.61(s,2H),2.54(s,2H),1.62(t,J＝7.2Hz,3H),1.02(s,6H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ172.37,169.33,159.41,154.12,150.38,143.75,136.45,129.29,128.30,127.78,127.60,123.03,122.20,121.65,115.39,113.65,112.91,103.95,78.10,68.90,51.30,43.01,39.22,32.07,28.06,13.48.HRMS(ESI)＝m/z calculated for C31H30N3O+476.23；found 476.2321。
3、针对MIF的探针MIFP3的制备方法，其制备过程如下：
将化合物1f(1.86g，10mmol)和6-羟基-2-萘甲醛(1.72g，10mmol)溶于30mL乙醇。向溶液中加入哌啶(102μL，1mmol)，并在80℃下加热8小时。反应冷却到室温后，减压浓缩，得到粗品。将粗品溶解在少量的CH2Cl2中，并通过滴加正己烷对溶液进行重结晶，得到红色固体的产品3g(Fluor.2)(2.68g，78.7％)。
将化合物3g(Fluor.2)(1.021g，3mmol)、化合物2d(0.784g，3mmol)和K2CO3(0.622g，4.5mmol)溶于30mL丙酮并在60℃下加热回流12小时，反应冷却至室温后，通过硅藻土过滤收集滤液。向滤液中加入60mL乙酸乙酯，并分别用5％ KOH水溶液(1x 30mL)和饱和盐水(3x 30mL)洗涤。收集有机层并在无水Na2SO4上干燥。减压浓缩后，粗品通过硅胶柱色谱法提纯。将粗品溶于尽量少的二氯甲烷，使其刚好完全溶解，用无水乙醇滴注重新结晶，得到黄色固体化合物3h(276mg，18.5％)。
将化合物3h(50mg，0.1mmol)溶于3mL二氯甲烷，加入三氟甲磺酸乙酯
(150μL)，在室温下氮气搅拌过夜。混合物减压浓缩，溶于少量二氯甲烷，用乙醚滴注重结晶，得到黄色固体MIFP3(45.8毫克，72.1％)。
MIFP3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.78(d,J＝2.7Hz,1H),8.13(dd,J＝
6.8,5.0Hz,3H),7.93–7.85(m,3H),7.82(dd,J＝8.3,5.9Hz,3H),7.54–7.40(m,3H),7.31(m,1H),6.92(s,1H),5.40(d,J＝5.8Hz,2H),4.77(m,2H),2.68–2.54(m,4H),1.62(t,J＝7.2Hz,3H),1.04(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ171.28,170.71,157.44,156.46,149.88,143.55,138.30,135.27,132.18,130.68,129.50,129.29,129.10,129.04,127.99,127.88,125.21,123.00,119.81,114.41,113.61,108.31,104.48,76.45,69.05,65.39,50.77,42.76,38.65,32.14,27.92,13.11.HRMS(ESI)＝m/z calculated for C35H32N3O+526.25；found 526.2500.
实施例2
MIFP1-MIFP3的合成及初步评价
实施例1制备的探针MIFP1-MIFP3的最终结构通过1H和13C NMR光谱和质谱完全确认，结构如图1A。然后，在PBS缓冲液(pH 7.4，1％DMSO)中进行了初步的体外试验。单独的MIFP1-MIFP3(10μM)表现出非常弱荧，相对应的，将MIFP1-MIFP3(10μM，PBS缓冲液(pH 7.4，1％DMSO))与MIF
(碧云天，重组人MIF)(2.25μg/mL，在PBS中终浓度)在37℃温育20分钟后，使用F7000荧光光谱仪测试荧光光谱，观察到分别在约580nm处有显著荧光强度的增加(图1B)。并且MIFP1-MIFP3表现出加大的stokes位移变化(图1C)；对三个探针进行了log P的测试：将探针(MIFP1～MIFP3)(10μM)在氯化钠水溶液(0.9％辛醇饱和)中的等分试样加入等体积的辛醇(0.9％ NaCl饱和)中，并将混合物摇晃3天，以便在298K下进行分配。在7,000rpm下离心5分钟后，通过荧光光谱法测定有机相和水相中的探针含量(图1D)，Log Po/w被定义为有机相和水相中探针浓度的对数比，图1D表明三个探针的光学性能都比较良好。随后进行了计算机模拟对接研究，以便更直观地观察这些探针与蛋白质的结合情况，以RCSB蛋白质数据库中的人MIF蛋白(PDB ID：3b9s)的晶体结构作为对接研究的受体。使用Schrodinger软件套件2021-2对MIFP1～MIFP3与MIF的结合口袋进行共价对接。结合点中心的坐标(x＝-29.937,y＝17.176,z＝-15.012)是由配体4-IPP定义的。对接研究的所有参数设置都是默认的。蛋白质文件使用Maestro 12.8中的OPLS 4力场进行了最小化。三个配体以.sdf格式输入，保存在ChemBioDraw 13.0中，随后使用Schrodinger软件包的LigPrep工具以默认参数制备。在-C＝C＝N-和MIF的N端脯氨酸-1的N原子之间的反应类型是自定义的。对接研究的所有参数设置都是默认的。图像结果由pymol处理得出，对接结果显示，MIFP3表现出更好的结合，并显示出相对较低的结合能量(图1E)。
同样的，在PBS缓冲液(pH 7.4，1％DMSO)中进行了初步的体外试验。单独的MIFP1-MIFP3(10μM)表现出非常弱的紫外吸收。相对应的，将MIFP1-MIFP3(10μM，PBS缓冲液(pH7.4，1％DMSO))与MIF(2.25μg/mL，PBS)在37℃温育20分钟后，观察到分别在约460nm处有显著的吸收增强。
(图2)。上述实验发现MIFP1-MIFP3在体外能够与MIF蛋白发生反应而造成荧光发射和紫外吸收上的变化，说明MIFP1-MIFP3能够承担检测MIF的功能。
进一步研究这三种探针在不同溶剂中的光物理和化学特性。按终浓度将MIFP1-MIFP3(10μM)，加入到的不同溶剂中(Dioxane、Toluene、CHCl3、EtOAc、THF、EtOH、Acetone、MeOH、CH3CN、DMF、DMSO、DCM)配制200μL测试液，使用UV2550紫外吸收光谱仪测试紫外吸收光谱，使用F7000荧光光谱仪测试荧光激发光谱/荧光发射光谱(激发/发射:435/565,狭缝：10/10)，这些探针在不同溶剂中的吸收光谱相对稳定，而在不同溶剂中的发射光谱则表现出较大的斯托克斯位移(>100纳米)(图3、图4、图5)，萘环结构的引入延长了π-共轭长度，导致MIFP3在不同溶剂中表现出更敏感的荧光强度变化，其发射光谱进一步红移。此外，使用甲醇-甘油配制(0-945cP)不同粘度的溶液，将MIFP1-MIFP3(10μM)，加入到的不同粘度的溶剂中，配制200μL测试液，使用F7000荧光光谱仪测试荧光发射光谱(激发/发射:435/565,狭缝：10/10)，发现MIFP3在0-945cp的粘度范围内表现出线性荧光增强。(图9)表明探针能够适应更复杂的体内环境，有希望作为体内成像MIF的有效工具。
实施例3
MIFP1-MIFP3的区分癌细胞和正常细胞
鉴于MIF在癌症病理过程中的过度表达，验证这些新型的MIF探针直接区分癌细胞和正常细胞。首先将活的HLF和A549细胞(细胞浓度约3.5x106个/mL)分别与MIFP1～MIFP3(终浓度10μM)进行孵育30分钟后，丢弃旧的培养基，用PBS洗涤细胞两次，并在37℃、5％CO2培养箱中用胰蛋白酶/EDTA溶液孵育2分钟。用新的细胞生长培养基对细胞进行稀释。通过离心分离细胞(2.0krpm，5分钟)。用PBS清洗细胞两次。使用RIPA裂解缓冲液(含10mM PMSF)裂解细胞。细胞混合物在冰上孵化20分钟，以13.4k rpm离心(20分钟，4℃)以分离可溶性部分，并收集上清液。用BCA测定法检测蛋白质浓度，将制备的可溶性蛋白质组样品在PBS缓冲液中稀释到10mg/mL，并在-80℃下储存，直到使用。扫描裂解液的荧光光谱，结果发现，MIFP1～MIFP3对癌细胞的荧光反应强于正常细胞(图6)，这说明可以在活细胞中进一步探索这些探针。将培养瓶中生长至70％(细胞浓度约3.5x106个/mL)的六种不同类型的细胞((人肝细胞癌(HepG2)、人肾腺癌(ACHN)、人肺癌(A549)以及正常人肝细胞(L02)、正常人胚胎肾细胞(293T)和人肺成纤维细胞(HLFs))分别与MIFP1～MIFP3(终浓度10μM)在37℃下孵育60分钟，并通过流式细胞仪对其荧光强度进行定量。结果显示(图7)，MIFP1～MIFP3对肝癌细胞都表现出最佳的标记和识别性能。同时MIFP3表现出比探针MIFP1和MIFP2更好的荧光反应特性，特别是在识别肺癌和肝癌细胞方面(图8A，8B)，本发明中MIFP3探针的光学性质最好，在体内成像的的前景最好。
此外，为了适应更复杂的环境，进一步研究了探针的双光子荧光成像的潜力，MIFP3的双光子吸收截面(σ2)值因此被测试，
通过双光子诱导荧光测量技术测量MIFP3和反应产物的双光子吸收截面值(σ2)，公式如下。
σx＝[Fx/Fs][Φs/Φx][cs/cx][ns/nx]σs
其中，s＝标准；x＝样品；F是在相同功率的激发光束下测量的综合荧光强度；Φ是荧光量子产率；n是溶剂的折射率；c是溶液中分子的数量密度，σs为罗丹明6G双光子截面值。在本实验中，选择罗丹明6G(1μM，Φ＝0.69，λex＝920nm)作为标准双光子染料。使用徕卡TCS SP8-MP共聚焦显微镜对MIFP3(10μM)以及MIFP3(10μM)与MIF(4.5μg/mL)反应后的样本和罗丹明标准品6G，在相同功率的激发光束下测量的综合荧光强度进行扫描。
MIFP3表现出优异的双光子特性，其在920纳米处的双光子吸收截面的最大值被发现约为70GM，与MIF(4.5μg/mL)结合后增加到大于200GM(图8C)。
此外，该探针在920纳米的激发下，在红色波长区域(约600纳米)表现出明显的荧光发射(图8D)。
接下来将活的HepG2和L02细胞在培养基中生长到70％(细胞浓度约3.5x106个/mL)分别与MIFP3(终浓度10μM)进行孵育30分钟后。丢弃旧的生长培养基后，用PBS洗涤细胞两次，并在37℃、5％CO2培养箱中用胰蛋白酶/EDTA溶液孵育2分钟。用新的细胞生长培养基对细胞进行稀释。通过离心分离细胞(2.0k rpm，5分钟)。用PBS清洗细胞两次。使用RIPA裂解缓冲液(含10mM PMSF)裂解细胞。细胞混合物在冰上孵化20分钟，以13.4k rpm离心(20分钟，4℃)以分离可溶性部分，并收集上清液。用BCA测定法检测蛋白质浓度，将制备的可溶性蛋白质组样品在PBS缓冲液中稀释到1毫克/毫升，并在-80℃下储存，将150μL蛋白质样品(每个样品约150μg)稀释到200μL(85μl 1x PBS和100μl ddH2O)。之后，使用超滤管(3KDa)在13.4k rpm(4℃，20分钟)下进行超滤离心，以回收浓缩的溶质，并使用ddH2O稀释至200μL。然后，将溶液转移到石英池中，测量荧光(λex/λem＝435/585nm；狭缝宽度＝10nm)和吸收光谱，再次显示HepG2细胞的吸收和荧光信号比L02细胞明显增强(图8E，8F)，进一步证明本发明的探针可以通过MIF的变化来区分癌细胞和正常细胞。
为了研究MIFP3对MIF的结合方式，将MIF和MIFP3反应后的产物进行质谱确认，也观察到了明显的信号峰(图10)，表明MIF可以靶向到MIF蛋白并和蛋白共价结合。测试了不同浓度的MIF与MIFP3(10μM)在37℃孵化20min后的荧光光谱，在一定浓度内(0-0.45μg/mL)，随着MIF浓度的增加，出现了线性荧光增强(R2＝0.9901)(图11)，说明探针具有浓度依赖性。总之，这些发现表明，MIFP3具有潜在的双光子特性，这有利于大大抑制组织成像过程中的组织自发荧光背景和自发荧光现象。
为了进一步研究MIFP3是否受到生物体内其他干扰物种的影响，按终浓度将MIFP1-MIFP3(10μM)，加入到100μL的PBS中，后加入不同的底物如金属离子(Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cu2+,Fe2+,终浓度为50μM)，氨基酸(Val,Lys,Ile,His,Ala,Cys,终浓度为50μM)和其他生物硫醇(GSH,终浓度为50mM)，最后使用超纯水稀释体系至200μL，转移到适应皿中，在Hitachi F7000荧光光谱仪测试荧光发射光谱，并收集580nm处荧光强度值。这些物种对该探针的荧光的影响几乎可以忽略不计(图12)。此外，MIFP3对L02细胞的细胞毒性作用是通过MTT试验来评估的。L02细胞被培养到96孔板中。然后，用不同浓度的MIFP3(0.01、0.1、1、10、50和100μM)处理细胞，再培养24小时。随后，用10μL 5mg/mL MTT处理细胞，再培养4小时(37℃，5％ CO2)。然后弃去上清液，加入150μL DMSO，在Infinite M200 Pro多模微孔板阅读器(Tecan，瑞士)上以570nm(参考波长630nm)读取平板吸光度，结果表明MIFP3在生理系统中也保持相对稳定(图13)，没有明显的细胞毒性，即使浓度高达100μM(图14)。
实施例4
活细胞成像
为了直接探索MIFP3在活细胞成像中的应用，将培养瓶中生长至70％(细胞浓度约3.5x106个/mL)的两组细胞(HepG2和L02；A549和HLFs)分别与MIFP3(终浓度10μM，37℃，2小时)孵化，然后进行共聚焦成像，评估MIFP3识别癌细胞的能力。两种癌细胞的共聚焦图像，特别是HepG2，与正常细胞相比显示出明显的荧光增强(图15A)。它们的平均荧光强度是L02细胞的两倍以上(图15B)。此外，用LPS(1μg/mL，12小时)或4-IPP(250μM，4小时)预处理生长在12孔板上的活体HepG2细胞(7x105细胞/孔)，以诱导MIF活性的上调/抑制，然后用PBS清洗细胞，在含有MIFP3(10μM)的1mLDMEM培养基中37℃再培养30分钟。使用共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP8 MP)进行显微成像，激发波长为458nm，收集波长范围为550-590nm。在LPS预处理的细胞中，共聚焦荧光强度增强。相反，用4-IPP预处理抑制MIF活性后，共聚焦荧光信号明显减少(图15C，图15D)，这也与流式细胞仪分析的实验结果一致(图15E)。共定位实验表明，荧光信号主要分布在细胞的溶酶体和线粒体中(图16)。总之，这些结果证实MIFP3可以可靠地检测和成像活细胞中的内源性MIF。
实施例5
临床组织成像
为了进一步证明MIFP3是否能有效区分肝细胞癌(HCC)，并验证MIFP3在HCC诊断中的适用性，因此研究了MIFP3在临床HCC患者的病理组织样本上的可视化和诊断成像的有效性。肝细胞癌组织和肝切除术中切除的细胞旁组织被直接冷冻在液氮中。在最佳切割温度(O.C.T.)下进行复合包埋和低温显微镜
(Leica CM1950)切片。每张切片的厚度约为20μm，还准备了50μm厚的肝癌组织切片，以确定MIFP3的组织穿透深度。将切片与探针孵化后(将探针MIFP3用HBSS溶液稀释成10μM溶液，取200μL覆盖于切片上放置30min)，用PBS清洗，用双光子共聚焦荧光显微镜(LeicaTCS SP8 MP)观察和成像不同深度的切片。在920纳米的激发下，在550-590纳米之间收集荧光发射。与癌旁组织的对照组相比，用MIFP3孵育后的肝癌组织样本出现了强烈的荧光信号(图17A)。用LPS(0.1、1和10μg/mL，12小时)或4-IPP(100、250和500μM，4小时)预处理肝癌组织以诱导MIF活性的上调/抑制，处理过程为将LPS、4-IPP用HBSS配制成相应浓度之后，取200μL覆盖于组织切片上，孵育不同时间即可，然后用PBS清洗组织并与MIFP3(10μM)在汉克缓冲液中再孵育30分钟。用PBS清洗两次后，用一光子共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP8MP)进行成像。对于探针通道，激发。458纳米，发射：550-650纳米。观察到明显的荧光信号增强或抑制(图17B和C，和图18)。此外，由于双光子成像的优良性能，通过使用双光子激发对深部组织进行MIFP3成像，可以清楚地观察到肝癌组织中的荧光信号明显强于正常组织(非癌组织)的对照组(图17D，17E)。对HCC患者的临床组织进行约50μm深度的成像，再次证实MIFP3可以实现深度成像并有效区分HCC(图19)。综上所述，所有这些发现表明，MIFP3可以有效地检测和成像临床病理组织中的内源性MIF，从而有望实时检测其分布和肝癌组织的分化。

Claims (10)

1.一种巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针，其特征在于，所述MIF双光子荧光探针为如下式I-III探针MIFP1～MIFP3中的任意一种：
。
2.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，式I探针MIFP1的制备包括如下步骤：
反应物1a溶于DMFDMA，搅拌反应，反应结束后除去溶剂得到化合物1b；
将化合物1b、盐酸羟胺溶于甲醇，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物1c；
将化合物1c溶于四氯化碳，然后加入AIBN和NBS，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物1d；
将化合物1e和丙二腈溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1f；
将化合物1f、对羟基苯甲醛溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1g；
将化合物1g、化合物1d、碳酸钾溶于丙酮，回流反应后，除去溶剂得到粗产物，纯化得到产物1h；
将化合物1h溶于CH2Cl2，加入三氟甲烷磺酸乙酯，搅拌反应后，减压浓缩，重结晶得到固体产物，即为MIFP1；
其反应式如下所示：
3.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，式II探针MIFP2的制备包括如下步骤：
将反应物2a溶于DMFDMA，搅拌反应，搅拌反应结束后，除去溶剂，得到化合物2b；
将化合物2b和盐酸羟胺溶于甲醇，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2c；
将加入化合物2c溶于四氯化碳，加入AIBN和NBS，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2d；
将化合物1e和丙二腈溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1f；
将化合物1f、对羟基苯甲醛溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1g；
将化合物1g、化合物2d、碳酸钾溶于丙酮，回流反应后，除去溶剂得到粗产物，纯化得到产物2h；
将化合物2h溶于CH2Cl2，加入三氟甲烷磺酸乙酯，搅拌反应后，减压浓缩，重结晶得到固体产物，即为MIFP2；
4.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，式III探针MIFP3的制备包括如下步骤：
将反应物2a溶于DMFDMA，搅拌反应，搅拌反应结束后，除去溶剂，得到化合物2b；
将化合物2b和盐酸羟胺溶于甲醇，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2c；
将加入化合物2c溶于四氯化碳，加入AIBN和NBS，搅拌反应后，除去溶剂，纯化得到化合物2d；
将化合物1e和丙二腈溶于乙醇，加入催化量哌啶搅拌反应后，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物1f；
将化合物1f、6-羟基2-萘甲醛溶于乙醇，加入催化量哌啶，搅拌反应，除去溶剂得到粗产物，重结晶得到化合物3g；
将化合物3g、化合物2d、碳酸钾溶于丙酮，回流反应后，除去溶剂得到粗产物，纯化得到产物3h；
将化合物3h溶于CH2Cl2，加入三氟甲烷磺酸乙酯，搅拌反应后，减压浓缩，重结晶得到固体产物，即为MIFP3；
其反应式如下所示：
5.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备检测MIF的试剂或者工具中的应用。
6.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备细胞内MIF的实时成像和追踪的试剂或者工具中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞包括不同类型的细胞系可分为癌细胞和正常细胞。
8.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备活细胞内显示MIF的内源性动态变化的试剂或者工具中的应用。
9.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备临床肝癌组织样本中MIF的动态变化的试剂或者工具中的应用。
10.一种权利要求1所述的巨噬细胞迁移抑制因子MIF双光子荧光探针在制备肝癌细胞/组织的成像或者检测其分布的试剂或者工具中的应用。
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