CN105315228B - 一种检测高碘酸根的高选择性比值型荧光探针 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测高碘酸根的高选择性比值型荧光探针，具有下式I所示结构，其中R1选自H或C1‑C4烷基；R2选自相邻的两个碳分别被1个羟基取代的C2‑C8烷基；R3选自H和C1‑C4烷基；和R4选自H和C1‑C4烷基。本发明还包括用于制备该式I化合物的中间体式II化合物、制备式I化合物的方法、含有式I化合物的检测组合物和检测试剂盒以及式I化合物作为荧光探针在检测化学体系中的高碘酸根、生物活细胞内高碘酸根的荧光成像测试、高通量水解酶测试平台的构建以及检测试纸条的开发中的应用。
Description
技术领域
本发明属于阴离子检测技术领域，具体涉及生物和化学体系中的高碘酸根含量测定技术，是一种可用于化学体系和活细胞中高碘酸根成像测定的高选择性比值型探针。
背景技术
高碘酸根是一种由七价碘和氧原子构成的含氧酸根阴离子。它在水中主要以两种形式存在，分别是偏高碘酸根(IO4-)和正高碘酸根(IO6-)，通常其以高碘酸钾(KIO4)或以高碘酸钠(NaIO4)的形式存在。在中性溶液中，高碘酸根主要以偏高碘酸根的形式存在。高碘酸根最重要的特征是它能够选择性氧化断裂含有邻近两个羟基的碳碳键，生成相应的醛基或者羰基。这种特性使得高碘酸盐在有机合成和分子生物学中应用广泛。比如，在有机合成领域，先用高碘酸钠氧化获得醛基再原位形成叶立德(ylide)这种合成路线在很多天然产物的合成中广泛应用。同时高碘酸钠也用来氧化纤维素生成生物相容性好以及可降解的医用生物材料以及药物传输载体。在分子生物学领域，高碘酸钠用于氧化各种含有相邻两个羟基的糖类，生成醛基，该类醛基可以进一步同含有氨基的荧光团或生物素等在生理条件下发生反应。这种技术目前已经被广泛用于糖蛋白、核糖等相邻碳碳骨架分子上都含有羟基的生物大分子的原位标记。与DNA相比，RNA(核糖核酸的2’和3’位含有邻二醇结构)的3’-端基被高碘酸根氧化断裂生成的醛基可以用可检测的标记物进行选择性反应从而达到对目标RNA进行示踪的目的。
高碘酸根的另外一个重要的价值在于高通量酶筛选方面的应用。Crotti,P.和Reymond,J.-L.等建立了一个基于高碘酸根的荧光检测技术用于高通量筛选水解酶。在水解酶催化水解底物后产生含邻二醇结构的化合物，该化合物被高碘酸根选择性氧化产生的氧化产物在牛血清白蛋白(BSA)催化下释放出具有荧光的伞形花内酯化合物(香豆素)，从而可以通过测量释放出的香豆素的荧光强度变化测定水解酶的类型和浓度。除了其在有机化学和生物化学中的特殊功能之外，高碘酸根与食品和环境安全也有关，因为高碘酸根可以转换为低价态的含碘化合物，而有些不同的含碘物质(如碘单质和碘离子)被认为是一种潜在的有害污染物，是食品和环境安全的重要监控对象。同时，某些含碘的化合物还是生物大分子的主要组成部分，而且他们跟生物大分子的功能密切相关。比如，据报道碘酸跟和高碘酸根与甲状腺功能衰退有关。
综合上述因素，发展一种可以监测高碘酸根的浓度变化以及较好区分高碘酸根和其它价态含碘化合物的方法将有利于实现对高碘酸根参与的反应机理的研究和相关的例如甲状腺功能衰退等疾病的发病机理研究，也有利于食品和环境的安全监控。
当前已尝试将一些光谱分析方法(紫外-可见吸收光谱分析)、色谱法、毛细管电泳和电化学方法应用于高碘酸根的检测。虽然色谱法和毛细管电泳方法有较高的实验精度，但是需要较复杂的实验预处理步骤，同时要求具有较高实验技术的专门实验操作人员进行操作分析，因此在时间、仪器和人力成本上都耗费较大。同时，因仪器和操作人员的不同，高碘酸根检测实验结果的重复性会出现差异。紫外光谱分析方法虽然可以用于定性和定量分析，但是由于灵敏度相比于荧光分析等方法较弱，因此在实验精度上有限制。电化学检测方法虽然广泛应用于高碘酸根的检测，但容易受到外来物质比如各种与高碘酸根具有相似氧化性的物质(次氯酸根，双氧水等)的干扰，从而影响了高碘酸根的定量检测。
荧光分析法是一种重要的光谱化学分析手段，具有灵敏度高、选择性好、方法简便、快速准确、线性范围宽等优点。因此，与一般的分析方法相比，荧光分析法在定量分析中具有明显的优势。
发明内容
本发明利用比值型基于激发态分子内质子转移(ESIPT)化合物2-(2-苯并噻唑基)-6-甲氧基苯酚作为荧光团。由于比值型荧光探针分子对靶标分子识别存在两条信息相互关联的通道，因此，当探针分子识别高碘酸根时，荧光发射在两条通道中被重新分配，识别事件同时由两个信息通道来表达。与增强型荧光探针相比，比值型荧光探针的质子转移荧光效率高，具有较先进的内部校准功能，背景信号低，并且生物相容性好，非常适合用于活细胞内高碘酸根含量测定和动态跟踪。因此，以1,2,4-丁三醇修饰的2-(2-苯并噻唑基)-6-甲氧基苯酚衍生物，可作为一种新型的小分子高碘酸根荧光探针得到应用。
本发明第一方面提供下式I所示的化合物：
式中，
R1选自H或C1-C4烷基；
R2选自相邻的两个碳分别被1个羟基取代的C2-C8烷基；
R3选自H和C1-C4烷基；和
R4选自H和C1-C4烷基。
在一个具体实施方式中，R1选自甲基和乙基。
在一个具体实施方式中，R2选自相邻的两个碳分别被1个羟基取代的C2-C6烷基。
在一个具体实施方式中，R2选自相邻的两个碳分别被1个羟基取代的C2-C4烷基。
在一个具体实施方式中，R3选自H。
在一个具体实施方式中，R4选自H。
在一个具体实施方式中，R1选自甲基和乙基；R2选自相邻的两个碳分别被1个羟基取代的C2-C4烷基；R3选自H；和R4选自H。
在一个具体实施方式中，所述式I化合物为：
本发明第二方面提供下式II所示的化合物：
式中，
R1选自H或C1-C4烷基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R4选自H和C1-C4烷基；
L为-(CH2)n-；
R5和R6各自独立为C1-C4烷基；和
n为选自1、2、3、4、5或6的整数。
在一个具体实施方式中，式II中，R1选自甲基和乙基。
在一个具体实施方式中，式II中，n为1－4的整数。
在一个具体实施方式中，式II中，R3选自H。
在一个具体实施方式中，式II中，R4选自H。
在一个具体实施方式中，式II中，R5和R6各自为甲基。
在一个具体实施方式中，式II中，R1选自甲基和乙基；n为2－4的整数；R3选自H；和R4选自H；R5和R6各自为甲基。
本发明第三方面提供式I化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)在反应溶剂中使下式III与式IV反应，获得式II化合物：
和
(2)在乙酸溶液中搅拌式II化合物，从而获得式I化合物；
其中，上述式III中，L为-(CH2)n-；X选自卤素；n为选自1、2、3、4、5或6的整数；
上述式IV中，R1选自H或C1-C4烷基；R3选自H和C1-C4烷基；R4选自H和C1-C4烷基；和R7选自C1-C4烷基；和
上述式II中，R1选自H或C1-C4烷基；R3选自H和C1-C4烷基；R4选自H和C1-C4烷基；L为-(CH2)n-；R5和R6各自独立为C1-C4烷基；和n为选自1、2、3、4、5或6的整数。
在一个具体实施方式中，步骤(1)的反应在K2CO3和DMF的存在下在50-70℃的温度下进行。
本发明第四方面提供本发明式I化合物作为荧光探针在检测化学体系中的高碘酸根、生物活细胞内高碘酸根的荧光成像测试、高通量水解酶测试平台的构建以及检测试纸条的开发中的应用。
本发明还包括一种检测组合物，该组合物含有本发明式I的化合物和溶解本发明化合物的溶剂，例如DMSO(N,N-二甲基甲酰胺)，乙醇，乙腈等。
在一个具体实施例中，本发明检测组合物的pH在6-10的范围内。
本发明还提供一种检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明式I的化合物，或本发明的检测组合物。试剂盒还可任选地含有用于指导进行检测的说明书。
本发明的荧光探针与现有技术相比，其有益效果是:
(1)稳定性好，能够长期保存使用，对检测化学体系环境要求低；
(2)具有较高的高碘酸根检测灵敏度；
(3)有很好的选择性，与其他常见的干扰离子作用基本没有荧光变化；
(4)与高碘酸根反应前后荧光变化迅速，适合于化学体系内高碘酸根的即时测定；
(5)容易进入活细胞，细胞毒性小，可用于活细胞内高碘酸根原位荧光检测；
(6)背景荧光弱，信噪比好；和
(7)固体荧光信号较稳定，适合应用于检测试纸条的开发。
本发明的荧光探针为高碘酸根的定量检测、相关的化学反应的实时监测和机理研究以及各类化学生物学研究的后续测试平台的建立提供了一种高效、准确的研究方法。
本发明的小分子化合物作为高碘酸根荧光探针可以负载到检测试纸条上实现固体荧光成像，成为一种方便、快捷的环境中高碘酸根含量测定的有效手段。
附图说明
图1：探针PDS-2与高碘酸根反应前后的荧光光谱变化图，探针PDS-2的浓度为5μM，高碘酸根的浓度为250μM，PBS缓冲液pH为7.4,组成为1％的DMSO,2mg/ml的BSA和1mM的CTAB。
图2：探针PDS-2与高碘酸根反应的选择性。
图3：探针PDS-2检测高碘酸根的荧光强度比值变化-浓度曲线。
图4：探针PDS-2的细胞毒性测试。
图5：探针PDS-2对于Hela细胞中高碘酸根离子的荧光成像照片，上：是普通的Hela细胞，下：是以高碘酸根处理过20min后的Hela细胞。探针PDS-2加入细胞的浓度均为5μM。
图6：探针PDS-2检测高碘酸根的固体荧光成像试纸条。
图7：pH值对水溶液中PDS-2在406nm和462nm处的荧光强度的影响。λex＝339nm。
具体实施方式
本申请中，卤素指氟、氯、溴和碘。
“烷基”指长1－8个碳原子的直链或支链烷基。通常可用长1－6个碳原子的烷基，或长1－4个碳原子的烷基，或长2－4个碳原子的烷基，或长1－3个碳原子的烷基。在其它例子中，烷基可以是长2－6个或2－4个碳原子的烷基。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本发明式I化合物中，R1优选为甲基或乙基；R2优选为相邻的两个碳分别被1个羟基取代的C2-C5烷基；R3和R4优选为H。
在本发明式I化合物的一个实施例中，R2可以是-(CH2)o-CHOHCHOH-(CH2)p-CH3或-(CH2)o-CHOHCH2OH，其中，o是0、1、2、3、4、或5，p是0、1、2或3。
因此，例如，本发明式I化合物中，R2可以是-CH2CH2CHOHCH2OH、-CHOHCHOHCH3、-CHOHCHOHCH2CH3、-CH2CH2CHOHCHOHCH2CH3、-CH2CHOHCHOHCH3等。
本发明式II化合物中，R1优选为甲基或乙基；n优选为2－4的整数；R3和R4优选为H；R5和R6优选各自为甲基。
以下流程显示了制备本发明一个具体化合物的具体实例：
HMBT或其衍生物可采用Z.Xu等(Chemical Communications,48(88),10871-10873(2012))所述的方法进行制备。
应理解，上述制备方案虽然只提供化合物PDS-2的制备，但本领域技术人员可通过改变反应物的基团而制备得到本发明的式II以及式I化合物。例如，可使用不同的具有不同碳链长度的三元醇可制备得到具有相应碳链长度的化合物A、B或C。
本发明也包括本发明式I化合物作为荧光探针在检测化学体系中的高碘酸根、生物活细胞内高碘酸根的荧光成像测试、高通量水解酶测试平台的构建以及检测试纸条的开发中的应用。
在具体实施方式中，化学体系中高碘酸根的检测首先确定测试体系中高碘酸根的浓度为100μM或者250μM，改变探针的浓度，选取合适的探针浓度再进行下面的选择性和竞争性、反应动力学和浓度滴定测试。同样的实验方案每组至少进行三次，所得到数据Origin进行处理。测试采用荧光仪中常用的Scan模块进行。利用HMBT荧光团两种构型最大发射波长(406nm和462nm)强度的比值对高碘酸根浓度作图得到的曲线即可以实现定量检测高碘酸根。
生物活细胞内高碘酸根成像测试以贴壁的细胞(例如HeLa细胞)为考察对象，所用仪器为奥林巴斯(Olympus)的荧光倒置显微镜和莱卡(Leica)激光共聚焦显微镜优化荧光成像的合适条件和相关参数(包括激发波长、时间和光强)。实现探针PDS-2对活细胞内高碘酸根荧光成像。
水解酶酶测试平台的构建主要利用以上已经建立的比值型高碘酸根检测技术，将PDS-2加入含有水解酶的反应体系中，再加入一定浓度的高碘酸根，在高碘酸根同水解酶产物充分反应后，剩余浓度的高碘酸根用PDS-2进行定量检测。从而通过origin 7.0(originLab)软件处理数据获得水解酶浓度和PDS-2荧光强度的关系，实现对水解酶活性的定量测定。
检测试纸条的开发主要基于硝酸纤维膜制成1厘米长的试纸条，将试纸条浸入目标探针(PDS-2)50μM的溶液中1小时后，取出烘箱37度烘干过夜。将化学反应液或者自然环境中含高碘酸根的污水等溶液滴入试纸条后晾干，在手提荧光灯照射下对试纸条进行荧光显色检测。
本发明的上述应用当然不限于上述具体实施例。在知晓本发明式I化合物的性能和用途的情况下，本领域技术人员当然能在不同的检测、测试应用中适当改变检测、测试的各种参数，以获得最佳的检测结果。
下面通过实施例具体地说明本发明。实施例中所使用的所有化学试剂和溶剂都购自商业途径，并不需要进一步纯化即可使用，除DMF(N,N-二甲基甲酰胺)需要按Armarego,W.L.F.；Perrin,D.D.,Purification of Laboratory Chemicals(4th Edition).Elsevier:1997所述进行纯化。在硅胶板上进行薄层层析(TLC)。使用200－300目的硅胶(Hailang，青岛)进行柱层析。用以ppm表示化学位移的Bruker AV-400光谱仪(在氘氯仿中，用Me4Si作为内标)上记录1H和13C NMR。在HP 1100LC-MS光谱仪上进行ESI质谱。
实施例1：探针PDS-2的合成路线
(1)2-(2-苯并噻唑基)-6-甲氧基苯酚(HMBT)的制备
参照文献(Z.Xu等，Chemical Communications,48(88),10871-10873(2012))进行。
(2)2-(2,2-二甲基-1,3-4-二氧杂戊环基)乙醇(A)的制备
称取2～4g的1,2,4-丁三醇溶解于丙酮中，再加入300～400mg的对甲苯磺酸一水合物(TsOH)，然后将上述反应混合液在室温下搅拌两天，最后加入0.7mL三乙胺中止反应，用旋转蒸发仪蒸干，得到粗产物，再用柱层析硅胶进行分离，得到无色油状产物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.19(br,1H),4.01(br,1H),3.69(br,2H),3.51(br,1H),1.74(br,2H),1.34(s,3H),1.29(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ108.85,74.53,69.38,59.89,35.79,26.80,25.60；MS(ESI)m/z 147.09[M+H]+。
(3)2-(2,2-二甲基-1,3-4-二氧杂戊环基)乙基-4-苯磺酸甲酯(B)的制备
将0.9g的A和1.4～1.5mL的三乙胺溶解于脱水的二氯甲烷中(DCM)，冰浴冷却至0℃，在氩气保护的条件下加入1.5～1.7g对甲苯磺酰氯，反应混合液搅拌22h，薄层色谱法(TLC)跟踪反应，反应结束，过滤，将滤液用旋转蒸发仪蒸干，得到粗产物，再用柱层析硅胶提纯，石油醚:乙酸乙酯＝10:1作为展开剂，得到无色油状的目标产物B。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝8.4Hz,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),4.14-4.04(m,3H),3.96(t,J＝7.6Hz,1H),3.47(t,J＝7.6Hz,1H),2.40(s,3H),1.99-1.82(m,2H),1.29(s,3H),1.24(s,3H)；13C NMR(100HMz,CDCl3)δ144.85,132.86,129.87,127.84,108.91,72.24,69.00,67.44,33.06,26.79,25.49,21.55；MS(ESI)m/z 301.11[M+H]+。
(4)4-(2-碘代乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊烷(C)的制备
C的合成是在文献(Taber,D.F.，Xu,M.等，Journal of the American ChemicalSociety,124(44),13121-13126(2002))的基础上稍加改进进行的。具体操作为，将900～1000mg的化合物B和20～25mg的铜粉加到脱水丙酮中，室温下搅拌，反应烧瓶外用铝箔纸包覆，再加入700～800mg的碘化钠，将上述反应混合液在25℃下搅拌2d。TLC跟踪反应，直至化合物B反应完全，用旋转蒸发仪蒸干，加入二氯甲烷，依次用水和盐水进行洗涤有机相，油相用无水硫酸钠干燥，过滤，用旋转蒸发仪蒸干，得到粗产物，再用柱层析硅胶提纯，石油醚:乙酸乙酯＝20:1～10:1作展开剂，得到淡黄色油状的产物C。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.16-4.10(m,1H),4.06-4.02(m,1H),3.55-3.51(m,1H),3.24-3.17(m,2H),2.07-1.98(m,2H),1.36(s,3H),1.31(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ109.09,75.64,68.61,37.87,27.00,25.58,1.32；MS(ESI)m/z257.01[M+H]+。
(5)2-(2-{2-(2,2-二甲基)-1,3-4-二氧杂戊环基}乙氧基)-3-甲氧基苯基)苯并噻唑(PDS-1)的制备
将400～450mg的化合物HMBT和400～450mg的碳酸钾(K2CO3)加到脱水二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入400～450mg的化合物C，反应混合液在避光搅拌12h，TLC跟踪反应，待HMBT反应完全后，用旋转蒸发仪蒸干，得到粗产物，再用柱层析硅胶提纯，石油醚:乙酸乙酯＝30:1～10:1作展开剂，得到淡白色固体的产物C。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝8.0Hz,1H),8.07(d,J＝8.0Hz,2H),7.95(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),7.40(t,J＝8.0Hz,1H),7.20(t,J＝8.0Hz,1H),7.03(d,J＝8.0Hz,1H),4.51-4.44(m,1H),4.30-4.18(m,1H),3.92(s,3H),3.72(t,J＝7.6,1H),2.33-2.18(m,2H),1.47(s,3H),1.42(s,3H)；
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ162.89,152.98,152.24,146.49,136.14,127.43,126.04,124.99,124.36,123.01,121.36,120.92,114.17,108.65,73.74,70.18,69.72,55.96,34.35,27.01,25.83；HRMS(ES+):C21H24NO4S[M+H]+计算值386.1426,实际值386.1423。
(6)4-(2-(2-苯并噻唑基)-6-甲氧基苯氧基)-1,2-丁二醇(PDS-2)的制备
将350～400mg的原料PDS-1加入4～5mL含80％水的乙酸溶液中，室温下搅拌12h，TLC跟踪反应，待原料PDS-1反应完全，用旋转蒸发仪蒸干反应混合液，得到粗产物，用柱层析硅胶提纯，石油醚:乙酸乙酯＝2:1～1:1作展开剂，得到无色浆状物，逐渐转变为淡白色固态物PDS-2。
探针PDS-2的基本数据：
淡白色固体粉末；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),7.50(t,J＝7.6Hz,1H),7.39(t,J＝7.6Hz,1H),7.20(t,J＝8.0Hz,1H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),4.28-4.19(m,3H),3.91(s,3H),3.81-3.78(m,1H),3.69-3.64(m,1H),2.07-2.02(m,2H)；
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ163.04,152.82,152.33,146.17,135.87,127.47,126.19,125.16,124.66,123.03,121.41,121.30,114.12,70.77,70.14,66.58,56.03,33.28；HRMS(ES+):C18H20NO4S[M+H]+计算值346.1113,实际值346.1111。
实施例2：pH值对水溶液中PDS-2的荧光强度的影响
在水中进行pH滴定。在纯水体系中，加入1mM的探针DMSO母液得到10μM的探针水溶液，利用盐酸和氢氧化钠水溶液调节获得不同pH下的探针水溶液，分别测定响应的荧光光谱。根据pH和最大发射波长处(406nm和462nm)荧光强度作图获得pH滴定曲线图。从而确定测试体系的最适pH条件。
结果如图7所示。在6-10的pH范围内PDS-2的荧光强度无变化。因此，选用pH为7.4、含有1％DMSO的PBS缓冲液作为测试介质。
实施例3：探针PDS-2与高碘酸根反应的荧光光谱变化
将探针PDS-2溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配成探针母液。配制PBS缓冲液，组成为1％DMSO，2mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，1mM溴化十六烷基三甲铵(CTAB)和250μM的高碘酸根。加入探针PDS-2母液，至终浓度为5μM，每隔1min测定一次荧光强度，20min后结束测试，激发波长为339nm，结果可参见图1。
从图1中可看出在探针PDS-2没有与高碘酸根反应时，荧光的最大发射波长在406nm处，当加入高碘酸根后，随着反应的进行，最大发射波长逐渐向长波长方向移动，反应15min后，最终稳定在在462nm处，位移为56nm。荧光信号变化快速且明显，说明该探针PDS-2适合用于高碘酸根离子的即时检测。
实施例4：探针PDS-2对高碘酸根的选择性
将探针PDS-2溶于DMSO中，配成探针母液。配制PBS缓冲液，组成为1％DMSO，2mg/mLBSA和1mM CTAB，将配好的缓冲液分装至12个4mL EP管中，再分别加入次氯酸钠，过氧化氢，硝酸钾，草酸钠，高碘酸钠，硼酸钠，柠檬酸钠，氟化钠，碘化钠，碘酸钠，和不加空白对照，至每种试剂浓度为250μM，而后分别加入探针PDS-2母液，使终浓度为5μM，反应20min，测定荧光强度。激发波长均为339nm，结果如图2所示。
从图2中可以看出，探针PDS-2对高碘酸根具有很高的选择性，可以专一的与分析物反应，在反应前后荧光信号有明显的变化，而常见的化学体系或生物环境中存在的阴离子并不能使其荧光信号发生改变，因此，该探针可以用于高碘酸根的检测和成像。
实施例5：探针PDS-2对高碘酸根的荧光比值-浓度曲线
将探针PDS-2溶于DMSO中，配成探针母液。配制PBS缓冲液，组成为1％DMSO,2mg/mLBSA,将配好的缓冲液若干4mL EP管中，加入探针PDS-2母液，至浓度为5μM，分别加入不同浓度的高碘酸根(终浓度为30μM～100μM)。反应20min后，测定406nm和462nm处的荧光强度，计算出荧光强度比值F462/F406,作出荧光比值变化对浓度的变化曲线，结果如图3所示。
从图3可以得出，探针PDS-2对高碘酸根的最低检测下限为30μM，荧光强度比值变化与高碘酸根浓度呈线性关系。这种探针的灵敏度满足常规高碘酸根检测要求，可用于高碘酸根的定量分析。
实施例6：探针PDS-2的细胞毒性测试
采用MTT法测试探针PDS-2的细胞毒性，配制1mg/mL MTT溶液，收集对数期Hela细胞，铺板，96孔板每孔加入100μL完全培养基(10％小牛血清和90％DMEM培养基)，5％CO2，37℃孵育12h，至细胞单层贴壁，加入浓度梯度的探针PDS-2，孵育6h，吸去上清液，每孔加入100μL的MTT溶液，孵育4h，弃去上清液，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，用酶标仪测吸光度，Origin 7.0(OriginLab)处理数据得到图4。
从图4可以得出，当探针PDS-2的浓度达到500μM时，细胞存活率仍然在90％以上，该探针生物相容性高，利于探针在后续生物样品测试中的应用。
实施例7：探针PDS-2对于Hela细胞中高碘酸根离子的荧光成像
Hela细胞以含有10％小牛血清的DMEM培养基进行培养。细胞分为两组，分别为普通细胞和以高碘酸根处理过20min后的细胞。将探针PDS-2溶于DMSO中，配成母液，分别加入各组细胞，终浓度为5μM，5％CO2，37℃孵育20min，置于激光共聚焦显微镜下观测，细胞中含有和不含高碘酸根的荧光成像的结果如图5所示。
由图5可观察出，探针PDS-2与高碘酸根反应前后在Hela细胞中荧光图像均非常明显，在普通的Hela细胞中，蓝色荧光较强，没有绿色荧光表达；在以高碘酸根处理过20min后的细胞中，蓝色荧光微弱，然而却有明显的绿色荧光，高碘酸根成功进入细胞并与探针PDS-2作用。从而证明，探针PDS-2作为检测高碘酸根荧光探针可以应用于活细胞，即时反应活细胞中高碘酸根的浓度变化情况，所得结果可靠。
实施例8：高碘酸根探针PDS-2的试纸条固体荧光成像
将探针PDS-2溶于DMSO中，配制含1％DMSO和2mg/mL BSA的PBS缓冲液，加入探针，至终浓度为5μM，完全浸润玻璃纤维膜试纸条，晾干，置鼓风干燥箱烘干。将试纸条放入不同浓度梯度的高碘酸根溶液中，反应20min后，置于紫外灯暗箱中观察，结果如图6所示。
从图6可得，探针PDS-2试纸条检测不同浓度高碘酸根具有不同颜色的荧光成像表达，ESIPT荧光团具有的固体荧光性质为检测化学反应液或者自然环境中的高碘酸根提供了一种便捷的方法。
虽然已以具体实施例的方式描述了本发明，但应理解的是，本发明并不限于上述具体实施方式。在不偏离本发明精神和范围的情况下对本发明作出的任何改动都落入本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.下式I所示的化合物：
式中，
R1为甲基；
R2为3,4-二羟基丁基；
R3为H；和
R4为H。
2.下式II所示的化合物：
式中，
R1为甲基；
R3为H；
R4为H；
L为-(CH2)n-；
R5和R6各自独立为C1-C4烷基；和
n为2。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R5和R6各自为甲基。
4.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在反应溶剂中使下式III与式IV反应，获得式II化合物：
和
(2)在乙酸溶液中搅拌式II化合物，从而获得权利要求1所述的化合物；
其中，上述式III中，L为-(CH2)n-，X选自卤素；n为2；
上述式IV中，R1为甲基；R3为H；R4为H；和R7为H；和
上述式II中，R1为甲基；R3为H；R4为H；L为-(CH2)n-；R5和R6各自独立为C1-C4烷基；和n为2。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的反应在K2CO3和DMF的存在下在50-70℃的温度下进行。
6.权利要求1所述的化合物在制备检测高碘酸根的荧光探针中的应用。
7.一种检测组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的化合物。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的化合物或权利要求7所述的检测组合物。
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