CN110542671B

CN110542671B - 一种有机双光子荧光探针、其制备及应用

Info

Publication number: CN110542671B
Application number: CN201810530905.8A
Authority: CN
Inventors: 闫学海; 李淑坤; 邹千里; 常蕊
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2038-05-29
Also published as: CN110542671A

Abstract

本发明涉及一种有机双光子荧光探针、其制备方法及应用。所述的有机双光子荧光探针由聚集态的近红外花菁染料分子及调控因子构成。制备的双光子荧光探针方法简单，生物兼容性好，大小均匀可控，染料包封率高，具有良好的生理环境稳定性，可实现探针在体循环、累积、摄取过程捕捉，分辨率高达单细胞层次，在生物医学成像领域的应用前景广阔。

Description

一种有机双光子荧光探针、其制备及应用

技术领域

本发明涉及生物医学成像领域，涉及一种有机双光子荧光探针、其制备方法及其应用。

背景技术

疾病的诊疗与人类的健康息息相关。诊疗的效果很大程度上取决于传感、成像以及治疗技术的水平。而荧光成像技术作为一种辅助治疗手段，能够提供病灶的生物信息，具有简便实时，非侵入性等优点。其中，双光子荧光成像技术采用近红外光激发，组织穿透深度更长且避免了自体荧光；脉冲成像模式，通过对光子的压缩，瞬时荧光强度可提高至10¹⁰倍，提高成像分辨率；多维度扫描提供更全面的病灶信息，可实现动态生物信息的实时捕捉，是现行荧光成像技术中一种备受青睐的模式。

目前对于双光子荧光探针的发展，包括无机的金纳米材料、碳纳米材料等，无机材料长期的生物代谢毒性限制了进一步在体应用。有机染料主要包括方酸菁、氟化硼二吡咯(BODIPY)类荧光染料、卟啉及其衍生物类染料、异硫氰酸荧光素(FITC)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、二碘曙红等分子探针的设计。其中，CN 106970059 A公开了一种双光子纳米诊疗剂的制备及应用。采用卟吩类分子锌5,10,15,20-四(4-吡啶基)-21H，23H(ZnTPyP)作为光激活分子基体，用于组装构筑不同形貌及尺寸的微米/纳米金属-有机框架材料(ZnTPyP-MOF)作为双光子荧光探针，同时包覆催化剂TiO₂得到ZnTPyP-MOF@TiO₂(ZMT)，该设计保留了ZnTPyP-MOF的双光子吸收及高量子荧光产率，同时结合了TiO₂易修饰及催化性能优良的优势，最终利用ZnTPyP-MOF的双光子吸收特性，实现了对细胞的高分辨的双光子荧光成像及双光敏化TiO2动力学治疗。但目前对于有机双光子荧光探针的设计仍存在1)分子合成步骤繁琐，结构复杂；2)多为高分子、聚合物，存在长期的生物毒性；3)分子聚集易导致能量以非辐射的形式耗散；4)离体及在体循环稳定性差等问题。

近红外花菁染料是一类在近红外区有强烈吸收的有机小分子，源于生命有机体。其中，吲哚菁绿ICG是被美国食品和药物管理局唯一批准的用于临床肝功能成像的造影剂。花菁染料因为具有特征的供受体结构，因此具有非线性光学的性质，但其实际应用荧光效率较低，非线性光学应用需要通过进一步化学修饰，且难以对其能量耗散途径进行有效控制。而自组装是通过分子间弱键协同作用，改变分子原有排布方式的过程。因此，对染料分子的组装调控，也是改善其光学性能的有效方法，所得到的组装体由于其中染料分子由单体到聚集体的过渡，会改变光子的吸收、存储、释放等过程，而相应的辐射跃迁会表现出异于单体的状态，即具有特定的发光性能。目前，尚未有研究对近红外花菁染料的聚集体进行辐射光学性能挖掘，其中包括近红外脉冲激光激发下基于双光子吸收的上转换发光性能。

因此，在本领域，期望得到一种制备方法简单，生物来源安全，具有良好的光学及生理条件稳定性的双光子荧光探针。基于此，采用自组装技术调控近红外花菁染料形成有机双光子荧光探针及其光学成像性能的开发具有重大意义。

发明内容

针对已有的需求及问题，本发明的目的在于提供一种使用自组装技术调控近红外花菁染料形成双光子荧光探针的方法，所用材料生物相容，制备方法简单，包封率高，光学及生理环境稳定性好，可实现探针在体生物过程捕捉。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面：本发明提供一种有机双光子荧光探针的制备方法及应用，其特征在于：所述有机双光子荧光探针中包含近红外花菁染料聚集态及调控因子，所述调控因子含有氨基或者是含有由氨基形成的肽键。

不受理论的约束，预期是由于调控因子中的氨基或肽键与近红外花菁染料之间存在的静电、氢键和/或疏水作用，使得近红外花菁染料能够形成聚集态，进而能够形成双光子荧光探针。

优选地，所述调控因子为氨基酸及其衍生物、肽及衍生物、蛋白或有机高分子聚合物中的任意一种或两种以上的组合。

出于生物兼容性的考虑，优选地，所述调控因子中氨基酸及其衍生物、肽及衍生物可以为组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸等及其衍生物中的任意一种或至少两种以上的组合；进一步优选的，所述肽的衍生物为N-苄氧羰基-L-组氨酸-C-苄酯、N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸-C-氨基中的一种或者至少两种以上的组合。

出于生物兼容性的考虑，优选地，所述调控因子中蛋白可以为白蛋白(包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胎牛血浆蛋白、卵清白蛋白)、胶原蛋白、弹性蛋白中的任意一种或两种以上的混合物。

出于生物兼容性的考虑，优选地，所述调控因子中有机高分子可以为为壳聚糖、海藻酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物及其衍生物中的任意一种或至少两种以上的混合物。

出于形成聚集体容易的考虑，优选地，所述花菁染料为吲哚菁绿ICG、红外染料IR140、红外染料IR 806，及其各自衍生物中的任意一种或两种以上的混合物。

第二方面：本发明提供第一方面所述的有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，花菁染料分子以聚集体的形式存在于胶体颗粒中，例如可以采用花菁分子高浓度自聚的方式，或者调控因子调控花菁分子形成聚集体的方式。优选为采用调控调控组装形成胶体颗粒的方式。

第三方面：本发明提供第二方面所述的有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的聚集体结构可以加入金属离子通过配位作用增强稳定性，所加金属离子可以为：锌离子、亚铁离子、铁离子、铜离子、银离子、钴离子、锰离子、铬离子中的任意一种或者两种的组合。

第四方面：本发明提供第三方面所述的有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的双光子荧光探针在后续活体使用过程中可以通过蛋白后修饰降低其在体非特异性吸附，延长循环时间。所述修饰蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胎牛血浆蛋白、卵清白蛋白中的任意一种或两种以上的混合物。

第五方面：本发明提供第四方面所述的有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于：所述有机双光子荧光探针的平均粒径为10-1000nm，例如可以是10nm，20nm，30nm，40nm，50nm，60nm，70nm，80nm，90nm，100nm，150nm，200nm，300nm，400nm，500nm，600nm，700nm，800nm，900nm或1000nm，优选为20-300nm。

第六方面，本发明提供第五方面所述的有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配制第一方面所述调控因子溶液：

所述调控因子溶液的溶剂可以是氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、硝酸、硫酸、甲醇、二甲基亚砜、四氢呋喃，优选为二甲基亚砜、盐酸、氢氧化钠。

所述调控因子溶液的体积质量浓度为10-1000mg·mL^-1，例如可以是10mg·mL^-1，20mg·mL^-1，30mg·mL^-1，40mg·mL^-1，50mg·mL^-1，60mg·mL^-1，70mg·mL^-1，80mg·mL^-1，90mg·mL^-1，100mg·mL^-1，200mg·mL^-1，300mg·mL^-1，400mg·mL^-1，500mg·mL^-1，600mg·mL^-1，700mg·mL^-1，800mg·mL^-1，900mg·mL^-1或1000mg·mL^-1，优选为100-500mg·mL^-1。体积为5-200μL，例如可以是5μL，10μL，15μL，20μL，30μL，40μL，50μL，60μL，70μL，80μL，90μL，100μL，150μL，200μL，选为10-100μL。

(2)配制第一方面所述花菁染料溶液：

所述花菁染料溶液的溶剂可以是水、氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、硝酸、硫酸、甲醇、二甲基亚砜、四氢呋喃、优选为二甲基亚砜，水。

所述溶液所含花菁染料的最终体积质量浓度为0.002mg·mL^-1-5mg·mL^-1，例如可以是0.02mg·mL^-1，0.03mg·mL^-1，0.04mg·mL^-1，0.05mg·mL^-1，0.06mg·mL^-1，0.07mg·mL^-1，0.08mg·mL^-1，0.09mg·mL^-1，0.1mg·mL^-1，0.15mg·mL^-1，0.2mg·mL^-1，0.3mg·mL^-1，0.4mg·mL^-1，0.5mg·mL^-1，0.6mg·mL^-1，0.7mg·mL^-1，0.8mg·mL^-1，0.9mg·mL^-1，1mg·mL^-1，2mg·mL^-1，3mg·mL^-1，4mg·mL^-1或5mg·mL^-1，优选为0.05mg·mL^-1-1mg·mL^-1。体积为5-100μL，例如可以是5μL，10μL，15μL，20μL，30μL，40μL，50μL，60μL，70μL，80μL，90μL，100μL，优选为10-50μL。

(3)将步骤(2)与步骤(1)所得溶液混匀并水相分散，所述加入水的体积为800-990μL，例如可以是810μL，820μL，830μL，840μL，850μL，860μL，870μL，880μL，890μL，900μL，910μL，920μL，930μL，940μL，950μL，960μL，970μL，980μL或990μL，优选为900-980μL。

(4)可以向步骤(3)得到的胶体颗粒中加入金属离子通过配位作用交联稳定双光子荧光探针，优选为加入金属锌离子，其在体系中的摩尔浓度为0-5mM，例如可以是0mM，0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，0.9mM，1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，3.5mM，4mM或5mM，选为0.1-1mM。

对步骤(4)得到的分散体系加入对应的酸性或者碱性物质进行pH调节，调节至6-7.5近中性范围，例如可以是6，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5。

所述调节pH的酸性物质为盐酸、磷酸、硝酸、硫酸中的任意一种或至少两种的混合物。

所述调节pH的碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾中的任意一种或至少两种的混合物。

(5)将步骤(4)中得到双光子荧光探针老化12-180h，例如可以是12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，108h，120h，132h，144h，156h，168h或180h，优选为24-48h；为延长循环时间可对双光子荧光探针进行蛋白后修饰，加入蛋白溶液的最终质量体积浓度为1-30mg·mL^-1，例如可以是1mg·mL^-1，2mg·mL^-1，3mg·mL^-1，4mg·mL^-1，5mg·mL^-1，6mg·mL^-1，7mg·mL^-1，8mg·mL^-1，9mg·mL^-1，10mg·mL^-1，20mg·mL^-1，30mg·mL^-1，优选为5-10mg·mL^-1。

第七方面，第一方面至第六方面所述有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，可以用于体外细胞层次及体内肿瘤部位的成像。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的有机双光子荧光探针的制备方法及应用，其特征在于，所选用的原料分子结构明确，生物安全。

(2)本发明提供的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，采用共组装调控技术，制备方法简单，原料分子充分参与组装过程，探针大小可控，同时实现染料的高效稳定包封，保证发光的高效性。

(3)本发明提供的有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，调控形成的荧光探针，由于结构的排布方式不同导致光致化学缺陷的产生，显著增强了双光子吸收的光学性能。

(4)本发明提的有机双光子荧光探针在体外细胞层次及体内肿瘤部位的成像应用中，其特征在于，该有机双光子荧光探针在应用过程中具有良好的光学稳定性及生理环境稳定性。

(5)本发明提的有机双光子荧光探针可用于细胞层次及体内肿瘤层次成像，其特征在于，具有较高的时空分辨率。

附图说明

图1为实施例1所得有机双光子荧光探针的光学图片，从左到右依次为组氨酸衍生物调控ICG、IR 140、IR 806形成的双光子荧光探针；

图2为实施例2所得的IR 806双光子荧光探针粒径图；

图3为实施例3所得的ICG双光子荧光探针扫描电子显微镜图片；

图4为实施例4所得的IR 140双光子荧光探针透射电子显微镜图片；

图5为实施例5中所得ICG双光子荧光探针与单体ICG的紫外可见吸收光谱；

图6为实施例6所得IR 140双光子荧光探针的基于双光子吸收的上转换荧光光谱；

图7为实施例7所得的双光子荧光探针用于细胞层次成像图片；

图8为实施例8所得的双光子荧光探针用于活体肿瘤组织双光子成像图片。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：

配制含100mg·mL^-1的N-苄氧羰基-L-组氨酸-C-苄酯的二甲基亚砜溶液，向10μL该溶液中加入985μL 0.1mg·mL^-1的ICG水溶液或0.1mg·mL^-1的IR 806水溶液，加入5μL100mM氯化锌水溶液，震荡使混合均匀，4℃下避光老化24h，分别得到ICG、IR 806双光子荧光探针；配制含100mg·mL^-1的组氨酸衍生物的二甲基亚砜溶液，向10μL该二甲基亚砜溶液中添加10μL 10mg·mL^-1的IR 806二甲基亚砜溶液，向该混合溶液中加入975μL水，加入5μL100mM氯化锌水溶液，震荡使混合均匀，4℃下避光老化24h，得到IR 140探针。

对得到的ICG、IR 140、IR 806双光子荧光探针进行光学相机拍照。所得的探针如附图1所示，从左到右依次为ICG、IR 140、IR 806双光子荧光探针。

实施例2：

配制含200mg·mL^-1的壳聚糖溶液，其中加入10μL 0.1M盐酸溶液促溶解，加入100μL的1mg·mL^-1的IR 806水溶液，加入900μL水进行分散，加入10μL0.1M氢氧化钠溶液将pH调节至6-7.5范围。制备得到的IR 806双光子双光子荧光探针在4℃下避光老化24h，使用动态光散射技术对其进行粒径、电位表征。

所得IR 806双光子荧光探针的粒径分布图如附图2，显示其粒径在113.1nm。测到IR 806双光子荧光探针的Zeta电势为-20.3mV。

实施例3：

配制900μL含10mg·mL^-1的白蛋白水溶液，向其中加入100μL 1mg·mL^-1的ICG水溶液，震荡使混合均匀，4℃下避光老化24h，得到ICG双光子荧光探针。

对所制得的ICG双光子荧光探针进行扫描电镜表征得到的结果如附图3，结果显示，所制备的探针粒径尺寸均一且具有良好的分散性，超过90％的颗粒粒径在平均粒径±10％的范围内。

实施例4：

配制含100mg·mL^-1的N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸的二甲基亚砜溶液，向10μL该溶液中加入10μL 10mg·mL^-1的IR 140二甲基亚砜溶液，向该混合溶液中加入975μL水，加入5μL 100mM氯化锌水溶液，震荡使混合均匀，4℃下避光老化24h，在8000rpm条件下离心8min，弃去无色上清液，使用5mg·mL^-1牛血清白蛋白进行超声分散30min，得到蛋白后修饰的IR 140双光子荧光探针。

对所制得的IR 140双光子荧光探针进行透射电镜表征所得结果如附图4，所制备的IR 140双光子荧光探针直径在160nm左右，粒径均一且具有良好的分散性。

实施例5：

配制含10mg·mL^-1的N-苄氧羰基-L-组氨酸-C-氨基的水溶液，向其中加入氢氧化钠调节pH范围在9-10，使得-苄氧羰基-L-组氨酸-C-氨基均匀分散于水相中，向100μL该溶液中添加895μL的0.1mg·mL^-1ICG水溶液，后加入5μL 100mM氯化锌水溶液，震荡使混合均匀，并加入适量的盐酸进行pH调节至6.5-7左右，4℃下避光老化24h，得到ICG双光子荧光探针。

分别对所制得的ICG双光子荧光探针和ICG单体进行紫外可见吸收光谱表征，结果如附图5。ICG在形成双光子荧光探针之后，其吸收峰会从780nm红移到820nm左右。说明在组装体中，ICG分子聚集态的形式导致了能量转移。

实施例6：

配制含100μL 50mg·mL^-1的多聚赖氨酸水溶液，其中加入10μL的1mg·mL^-1的IR140二甲基亚砜溶液，加入890μL水进行分散，将pH调节至6-7.5范围。

对所制得的经老化稳定的IR 140双光子荧光探针进行基于808nm飞秒脉冲激光的激发，接收到了以550nm为峰值的宽峰发射，如附图6所示。说明IR 140双光子荧光探针中的能量转移形式与调控因子调控组装有关，呈现出基于双光子吸收的上转换发射。

实施例7：

本发明将实施例1中的样品进行细胞层次的成像测试。测试步骤如下：人宫颈癌细胞Hela按5000个细胞的密度接种于共聚焦培养皿，37℃下孵育24h，添加实施例1中的IR806双光子荧光探针，控制终浓度为20mg·mL^-1，孵育12h后使用PBS清洗两次，后用质量分数为4％的多聚甲醛进行固定，最后置于共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况。

所制得的IR 806双光子荧光探针在细胞内的摄取情况如附图7所示，使用808nm的飞秒脉冲激光进行激发，左图为发射范围为575-630nm荧光场图，右图为明场与荧光场的复合图。结果表明，IR 806双光子荧光探针可以被细胞摄取，均匀分布于细胞质中，在一定程度上说明了探针的生物安全性。

实施例8：

本发明将实施例1中的样品进行活体肿瘤组织的成像测试。测试步骤如下：建立雌性BALB/c裸鼠肿瘤模型，将重悬好的人乳腺癌细胞MCF 7按照5*10⁶个细胞的密度接种于裸鼠背部左下，每天对肿瘤体积进行测量，当肿瘤体积长到150±30mm³的时候对小鼠进行成像。尾静脉注射用体积分数为5％葡萄糖溶液分散的ICG双光子荧光探针(40mg ICG/kg)，24h后对裸鼠进行麻醉，腹腔注射体积分数为4％水合氯醛(100μL/10g)，剥开肿瘤部位表皮皮肤，并置于显微镜下观察。

所制得的ICG双光子荧光探针在活体水平上的荧光成像层切图如附图8，可精确观察到样品在单个肿瘤细胞中的摄取情况。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施，所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种有机双光子荧光探针，其特征在于：所述有机双光子荧光探针由聚集态的近红外花菁染料分子及调控因子组成，或者所述有机双光子荧光探针由聚集态的近红外花菁染料分子、调控因子以及金属离子组成，所述金属离子为锌离子、亚铁离子、铁离子、铜离子、银离子、钴离子、锰离子、铬离子中的任意一种或者两种的组合；

所述有机双光子荧光探针中调控因子为肽的衍生物、蛋白中的任意一种或两种以上的组合；所述肽的衍生物为N-苄氧羰基-L-组氨酸-C-苄酯、N-苄氧羰基-L-组氨酸-L-苯丙氨酸、N-苄氧羰基-L-组氨酸-C-氨基中的一种或者至少两种以上的组合；所述蛋白为白蛋白；所述近红外花菁染料分子以聚集体的形式存在于胶体颗粒中，所述探针的平均粒径为20-300nm，

所述有机双光子荧光探针中近红外花菁染料为吸收位于近红外吸收范围即>750nm范围的多甲川菁染料，所述多甲川菁染料为吲哚菁绿ICG、红外染料IR 140、红外染料IR 806，结构如下图，及其各自衍生物中的任意一种或两种以上的混合物，

2.根据权利要求1所述的有机双光子荧光探针，其特征在于：超过90％的有机双光子荧光探针的粒径位于平均粒径±10％的范围内。

3.权利要求1或2所述的有机双光子荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤，

(1)配制近红外花菁染料溶液：

溶剂包括水、氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、硝酸、硫酸、甲醇、二甲基亚砜、四氢呋喃；所述溶液中花菁染料的体积质量浓度为0.002mg·mL^-1-5mg·mL^-1；

(2)配制调控因子溶液：

溶剂包括氢氧化钠、氢氧化钾碱溶液或盐酸、硝酸、硫酸酸溶液以及甲醇、二甲基亚砜、四氢呋喃；所述调控分子最终体积质量浓度为0.05mg·mL^-1-5mg·mL^-1；

(3)将步骤(2)与步骤(1)所得溶液混匀并水相分散；

(4)向步骤(3)中得到的胶体颗粒中加入金属离子—锌离子，使其在最终体系中的摩尔浓度为0.1-5mM；

(5)调节水相分散液的pH值，调节至6-7.5范围；

(6)将步骤(5)中得到探针老化12-180h；离心后得有机双光子荧光探针；离心后加入白蛋白水溶液进行后修饰，蛋白溶液的最终质量体积浓度为1-30mg·mL^-1。

4.权利要求1或2所述的有机双光子荧光探针在制备活体成像检测试剂中的应用。