CN111954802A - 用于分析包含生物细胞的生物样本的方法以及用于实施该分析方法的分析设备 - Google Patents

用于分析包含生物细胞的生物样本的方法以及用于实施该分析方法的分析设备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于分析包含生物细胞的生物样本的方法以及用于实施该分析方法的分析设备。所述分析方法包括为生物样本中包含的每个生物细胞测量流式细胞术参数的步骤；为生物样本中的每个生物细胞在N维空间中确定一个点的步骤，所述点的坐标是根据为相应生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于3的整数；根据所测量的流式细胞术参数将所述点自动分组成不同的细胞簇，从而定义样本簇文件的步骤；以及将样本簇文件与参考簇文件进行比较的步骤，每个参考簇文件由相应病理或异常生物样本的流式细胞术参数定义。

Description

用于分析包含生物细胞的生物样本的方法以及用于实施该分 析方法的分析设备
技术领域
本发明涉及一种用于分析包含生物细胞尤其是血细胞的生物样本的方法，以及一种适于实施这种分析方法的分析设备。
背景技术
在血液中循环的细胞包括无核细胞和有核细胞，无核细胞为血红细胞或红细胞(每mm3的正常血液约500万个)、血小板(每mm3约300,000个)，有核细胞为白细胞(每mm3约10,000个)。血液中可能含有其他有核细胞，如成红细胞(其是未成熟的血红细胞)或其他稀有细胞。各细胞类型构成了所谓的群体。
其他生物液体如脑脊液或尿液包含血细胞。随后，它涉及生物样本，但不限于血液样本，而是包含血细胞的所有生物液体。
无论是否使用流式细胞仪，常规血液分析仪都旨在进行全血细胞计数，并在通过细胞类型检测到定量异常时提供定性信息。
由于更复杂的技术和特定试剂的应用，免疫血液学专业的流式细胞术设备可以针对影响所有细胞类型的血液病理学。
需要指出的是，流式细胞术包括进行至少一次流体动力聚焦，以及使血细胞一个接一个地通过测量装置，根据所实施的，该测量装置为每个细胞产生一定数量的物理测量值。为了清楚地进行测量，细胞应该分开，并以允许测量和采集的速度滚动。此外，必须有足够的计数，以便对每个群体进行适当的统计评估。为此，血液样本的分析不是使用纯血液而是使用稀释的血液。此外，考虑到红细胞的数量是白细胞的数千倍，为了进行统计上代表白细胞群体的分析，样本必须在血细胞计数器中经过几分钟的时间。为了将样本在血细胞计数器中的通过时间减少10倍，另一种解决方案在于，除了稀释样本之外，还进行裂解，该裂解选择性地破坏红细胞，以获得白细胞充分浓缩的样本，从而对这些群体进行统计上正确的计数。
产生的流式细胞术参数有两种类型：
-一种是物理或形态学性质：通过阻抗(Coulter效应)测量细胞体积，测量由每个细胞在激光束中通过而产生的不同角度的光吸收和衍射，以及测量核酸的荧光，这些核酸通过预先进入细胞中存在的一种或多种荧光染料发出荧光。这些数据使得能够通过每个细胞的体积、通过其光吸收(取决于其表面和内容物)、通过其内部复杂性、通过其表面、其组成的性质和通过其对有核细胞的核酸活性来表征每个细胞；
-一种是免疫学性质(免疫血液学)：将样本置于含有抗体的试剂中，该抗体与荧光染料结合并且对某些细胞表面表达的受体具有特异性。细胞在一束或几束激光束中的通过会产生与细胞表面标记成比例的信号，从而允许表征细胞。
一种用于分析包含生物细胞的生物样本的方法，以已知的方式包括以下步骤：
-使待分析的生物样本的生物细胞通过流式细胞仪的测量单元，
-为待分析的生物样本中所包含的每个生物细胞测量N个流式细胞术参数，例如形态学或免疫学流式细胞术，
-为待分析的生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为相应生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于2的整数，
-对于其功能限于全血细胞计数的设备，根据所测量的流式细胞术参数将点聚类成不同的细胞簇，从而定义样本簇文件，然后使用自动分区方法、统计学方法或其它点密度方法来执行聚类步骤，
-对于执行血液免疫测量的更复杂的设备，
·或者由操作者(例如血液学家、流式细胞术专家)对在两个测量轴上确定的点的表现进行视觉分析，并且通过阈值或通过操作者选择的区域根据聚类标准将这些点聚类成不同的细胞簇，
·或者根据所测量的流式细胞术参数将这些点自动聚类成不同的细胞簇，从而定义样本簇文件，并且对样本簇文件，特别是不同的细胞簇进行计算机分析，该分析步骤旨在对具有共同特征的细胞簇进行定性和定量，
-操作员识别样本簇文件中与正常样本相比的一个或多个异常。
根据所识别的异常，例如跨越了数值阈值(一种细胞类型的数量异常低或异常高)，以及根据他在医学流式细胞术中的经验，操作者可能能够直接确定患者(已对其生物学样本进行了分析)的病理以及相关的治疗方法，或者发布有关患者(已对其生物学样本进行了分析)的可能病理的预后，并且考虑补充血液测试以确认他的预后。
然而，聚类、分析和识别步骤是相当主观的，并且强烈依赖于操作者在流式细胞术方面的经验，因此操作者对患者的诊断或预后取决于操作者的资格和经验。然而，这些步骤既费力又耗时。与血液学计数器相比，这些设备的处理速度较低。
此外，在免疫血液学中以非常特异性的方式使用抗体来表征细胞的流式细胞术，使用昂贵的产品，这使得流式细胞术难以作为常规方法建立。
最后，这种旨在对具有共同特征的细胞进行聚类的分析类型是对群体进行列举和鉴定，以按群体类型鉴定其异常。因此，这种类型的分析不在乎整体数据，如对病人样本的整体情况。
发明内容
本发明旨在通过使用由流式细胞仪收集的数据来表征生物细胞，按簇对它们进行自动聚类，识别和鉴定簇的群体，但也将整体数据视为生物样本的图像表现，并相对于参考图像处理该图像，从而克服这些缺点，并引入新的范例。
本发明潜在的技术问题尤其在于提供一种用于分析包含生物细胞的生物样本的方法，该方法优化了来自测量的数据的处理，这确保了所得结果的可再现性，同时确保所述处理与高速设备兼容，并且对操作者不需要任何特殊的技能或时间。
为此，本发明涉及一种用于分析包含生物细胞(包括血细胞)的生物样本的方法，所述分析方法包括以下步骤：
-使待分析的生物样本的生物细胞通过流式细胞仪的测量单元，
-为待分析的生物样本中所包含的生物细胞测量N个流式细胞术参数，
-为待分析的生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为相应生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于3的整数，
-根据为待分析的生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数，将所确定的点自动聚类成不同的细胞簇，从而定义样本簇文件，所述样本簇文件有利地是以数字方式描述了待分析的生物样本的计算机文件，并且优选地根据标准编写，
-对由样本簇文件的不同细胞簇定义的细胞群进行识别，
-对样本簇文件的每个细胞簇的点进行计数，
-将样本簇文件与参考簇文件进行比较，每个参考簇文件由相应病理或异常生物样本的流式细胞术参数定义。
根据本发明的分析方法的这种配置使得能够自动识别样本簇文件(其以数字方式描述了待分析的生物样本)和一个或多个参考簇文件之间的可能相似性，并因此在比较步骤结束时提高返回给操作者的指示的相关性(例如，通过将特定指示或警报添加到返回的测量结果中)，并因此帮助给操作者提供可能的最相关的建议，以便加速诊断。特别地，根据本发明的分析方法使得实验室能够节省要做出的决定的时间，明确后续研究的范围，并在必要时将血液学家更快地引导至补充性分析，补充性分析可以是血液涂片，然后使用简单、廉价和可靠的方法进行显微镜分析或免疫分析。这不是用这个过程代替血液涂片图像分析的问题，而是从数字血液计数中提取尽可能多的信息，而不需要额外的成本，无论是材料还是时间。
根据本发明的分析方法更具体地在于，基于流式细胞测量，使用参考生物样本对所考虑的生物样本进行比较形态学分析，更具体地，使用从临床数据已知的病理性或异常生物样本建立的参考簇文件，对从所分析的生物样本建立的样本簇文件进行比较形态学分析。
因此，根据本发明的分析方法是基于从病理已知的样本获得参考文件。这实际上是一种通过临床试验的汇编进行的学习，它可以根据与新的异常或病理相对应的新的参考文件而进展。
每个学习版本并不特定于每台机器，而是对于使用相同组分的试剂进行制备(稀释、裂解、荧光标记)的所有相同类型的机器是有效且适用的。
血液中循环的细胞是由造血作用、内皮细胞的分离和异源因子(如细菌或寄生虫(如疟原虫))的感染产生的。造血作用在骨髓中，一方面产生白细胞，即多核细胞或中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，另一方面产生红细胞和血小板。每种类型的细胞都可能受到不同类型的病变的影响，这些病变可能在血液中导致不成熟的细胞，例如，成红细胞(仍具有细胞核的红细胞)或者网织红细胞(不再具有细胞核但仍具有核糖体和线粒体活性)。
根据本发明的一个实施方案，所测量的流式细胞术参数是物理测量值，例如每个生物细胞的体积、光吸收、大角度衍射、小角度衍射。
该分析方法可以进一步具有以下特征中的一个或多个，单独或组合使用。
根据本发明的一个实施方案，待分析的生物细胞可以是血细胞，更具体地，是已经接受了制备过程的血细胞，所述制备过程或者是等渗稀释以保存细胞，并且能够在流式细胞仪中使它们充分间隔，并且在最佳条件下测量每个流式细胞术参数，或者是选择性裂解操作，其将消除比白细胞多大约一千倍的红细胞，该裂解操作具有能够在更短的时间内识别和计数白细胞的效果，但是这也导致会根据裂解的类型而改变所观察到的未裂解细胞的体积和光学响应。
事实上，本发明的优选实施方案并行使用两个流式细胞仪，第一个是仅稀释生物样本，第二个是处理裂解的生物样本，更具体地说是观察有核细胞。这使得能够在维度N>3的空间中收集裂解的生物样本和未裂解的生物样本的数据。这意味着无核细胞(即红细胞和血小板)通过与有核细胞相同类型的算法进行处理。
根据本发明的实施方案，聚类步骤根据特定算法通过自动处理由对应于待分析的生物样本的每个生物细胞的N个流式细胞术参数确定的点来执行。不同的点可以例如根据这些点在N维空间中的统计标准或密度标准被聚类成不同的点簇，从而由代表每个细胞的点(这些点被分组在位于N维空间中的簇中)来定义一个文件，该文件以数字方式描述了待分析的生物样本。
根据本发明的实施方案，该分析方法包括以下步骤：对在测量步骤持续期间产生的一组模拟信号进行采样和数字化，从而为N个测量通道中的每一个通道定义类似于数字示波图的第一原始数据文件，以及以下步骤：通过第一级计算机处理对待分析的样本的每个生物细胞的N个数字化信号进行同步和分组。
根据本发明的实施方案，聚类步骤包括使用统计方法将所确定的点聚类成不同的细胞簇，或者使得能够通过对N维空间中代表细胞的点进行空间密度分析来分离簇。
根据本发明的一个实施方案，N维空间的每个坐标轴对应于各自的流式细胞术参数。
根据本发明的一个实施方案，N是大于或等于4的整数，并且可以例如等于5。
根据本发明的一个实施方案，所述样本簇文件是FCS(流式细胞术标准)格式。
根据本发明的一个实施方案，所述分析方法还包括以下步骤：当样本簇文件与参考簇文件至少部分地相同或相似时，例如当样本簇文件的预定细胞簇与参考簇文件的预定细胞簇相同或相似时，发出警报消息。
根据本发明的一个实施方案，所发出的警报消息包含与参考簇文件相关的病理或异常有关的指示，所述样本簇文件与所述参考簇文件至少部分相同或相似。这些设置使得能够向操作者传达与所分析的生物样本相关联的病理学的概率，但是在任何情况下都不构成对患者(所分析的生物样本来自所述患者)可能受到影响的病理学的诊断。
根据本发明的一个实施方案，分析方法还包括以下步骤：分析样本簇文件，从而检测样本簇文件中的至少一个可能的异常。
根据本发明的一个实施方案，仅当在分析步骤期间检测到至少一个异常时，才执行比较步骤。
根据本发明的一个实施方案，当在分析步骤期间检测到至少一个异常时，在发出警报步骤期间所发出的警报消息还包含与所述至少一个检测到的异常相关的信息。
根据本发明的一个实施方案，分析步骤包括以下步骤：为样本簇文件的每个细胞簇分析所述细胞簇的至少一个形态参数。
根据本发明的一个实施方案，样本簇文件的每个细胞簇的至少一个形态参数可以包括所述细胞簇的位置、所述细胞簇的点的分布、所述细胞簇的点的数量和/或所述细胞簇的存在与否。因此，检测细胞簇的异常计数、不同细胞簇之间的异常相对位置或者与异常细胞群相关的细胞簇的存在使得能够检测样本簇文件中的异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：如果样本簇文件的至少一个细胞簇的至少一个形态参数超过相应的预定阈值，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：
-对于样本簇文件的每个细胞簇，将所述细胞簇中聚类的点的数量与至少一个相应的预定阈值进行比较，
-如果至少一个细胞簇中聚类的点的数量小于和/或大于至少一个相应的预定阈值，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：
-对于样本簇文件的每个细胞簇，将所述细胞簇中聚类的点的数量与相应的预定下限阈值或相应的预定上限阈值进行比较，
-如果至少一个细胞簇中聚类的点的数量小于相应的预定下限阈值或大于相应的预定上限阈值，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：
-分析样本簇文件的每个细胞簇中的点的分布，
-如果至少一个细胞簇中的点的分布不是高斯分布，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：
-分析样本簇文件的细胞簇的位置，
-如果样本簇文件的至少两个细胞簇至少部分混淆，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：
-分析样本簇文件的细胞簇，
-如果检测到至少一个预定的细胞簇的存在或不存在，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：
-分析样本簇文件，
-如果细胞簇的数量高于或低于预定参考值，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，分析步骤包括以下步骤：搜索异常或非典型细胞簇，也就是说，位于正常细胞簇之外，异常或非典型细胞簇可以例如对应于不成熟的细胞或寄生虫。该分析方法还可以包括以下步骤：将这些异常或非典型细胞簇与参考文件进行比较。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括至少一个以下步骤：测量代表待分析的生物样本的生物细胞的形态和/或结构的流式细胞术参数。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括至少一个以下步骤：为待分析的生物样本的每个生物细胞测量所述生物细胞的至少一种光学特性。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括至少一个以下步骤：为待分析的生物样本的每个生物细胞测量所述生物细胞的至少一种电和/或电磁性质。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括以下步骤：测量待分析的生物样本的每个生物细胞吸收或再发射的光的量。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括：
-测量由每个生物细胞以小角度散射的光束强度的步骤，和/或
-测量由每个生物细胞以90°散射的光束强度的步骤，和/或
-测量由每个生物细胞沿着入射光束的光路散射的光束强度的步骤。
由每个生物细胞散射的光提供关于所述生物细胞的形态和结构的信息。特别地，由每个生物细胞以小角度(例如以小于15°的角度，有利地等于4°和/或9°)散射的光束的强度，基本上与所述生物细胞的大小成比例，而由每个生物细胞以90°散射的光束的强度与所述生物细胞的形状、内部结构和颗粒性成比例。此外，每个生物细胞的入射光束的光轴上的光束强度与所述生物细胞的大小和活力成比例。沿着入射光束的光路的散射的这种测量相当于测量每个生物细胞的光吸收强度。
因此，同时使用这两个或三个前述参数(阻抗测量值、光吸收测量值、不同角度的散射测量值)使得能够区分生物样品中的例如血小板、红细胞、淋巴细胞、单核细胞和多形核白细胞的不同群。
下面传递的角度值应理解为相对于入射光束的光路。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括以下步骤：测量由每个生物细胞发射的至少一个荧光束的强度，例如在90°。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤还包括以下步骤：测量由生物细胞通过测量室而产生的电阻抗变化。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括以下步骤：
-向穿过测量室的生物细胞发射入射光束，使得入射光束穿过生物细胞的路径，
-检测来自穿过测量室的每个生物细胞的至少一束光束。
根据本发明的一个实施方案，穿过步骤包括至少一个以下步骤：对通过测量室的生物细胞进行流体动力包裹。
根据本发明的一个实施方案，检测步骤包括以下步骤：同时检测由穿过测量室的每个生物细胞散射的至少一个光束和由穿过测量室的每个生物细胞发射的至少一个荧光光束。
根据本发明的一个实施方案，检测步骤包括以下步骤：同时检测由穿过测量室的每个生物细胞在至少两个不同方向上散射的光束和由穿过测量室的每个生物细胞发射的具有至少两个不同波长的至少两个荧光光束。
根据本发明的一个实施方案，分析方法包括以下步骤：确定所述生物细胞的结构和/或形状。
根据本发明的一个实施方案，分析方法包括以下步骤：确定所述生物细胞的浓度和/或所述生物细胞在相应细胞簇中的分布。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤还包括以下步骤：
-使参考生物样本的生物细胞进入流式细胞仪的测量单元，
-为参考生物样本中所包含的每个生物细胞测量N个流式细胞仪参数，
-为参考生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为所述参考生物样本的所述生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于3的整数，
-根据为参考生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数，将确定的与参考生物样本相关的点自动聚类成不同的细胞簇，从而定义参考簇文件，
-对多个参考生物样本重复所述穿过、测量、确定和聚类步骤，以定义多个参考簇文件。
根据本发明的一个实施方案，在使待分析的生物样本的生物细胞穿过的步骤之前，所述分析方法包括制备待分析的生物样本的步骤。制备步骤包括例如稀释待分析的生物样本的步骤，例如使用等渗稀释剂。除了稀释步骤之外，制备步骤还可以包括以下步骤：选择性裂解待分析的生物样本中所包含的至少一些生物细胞，例如红细胞。
根据本发明的一个实施方案，制备步骤包括以下步骤：用荧光色素(如荧光染料)标记待分析的生物样本中所包含的至少一些生物细胞，更具体地，标记待分析的生物样本中所包含的至少一些生物细胞的核酸。
根据本发明的一个实施方案，分析方法包括以下步骤：将样本簇文件整合为参考簇文件。这种整合步骤尤其是在血液学家已经识别出与待分析的生物样本相关的病理学，并且已经将与这种病理学相关的指示与样本簇文件相关联之后进行。
根据本发明的一个实施方案，所述分析方法，特别是分析步骤，包括以下步骤：将样本簇文件与正常簇文件进行比较，每个正常簇文件由相应正常生物样本的流式细胞术参数定义。在本说明书中，术语“正常”生物样本是指非病理性且非异常的生物样本。
根据本发明的一个实施方案，所述制备步骤包括在待分析的生物样本中加入一种或多种试剂，所述试剂含有特异于在生物细胞的膜上定位的受体的抗体。这些抗体或者与荧光示踪剂结合，或者与能够在每个细胞上产生一个或多个特异性信号的颗粒结合。因此，根据本发明的分析方法允许根据需要添加免疫血液学测量(除了以数字方式转换成流式细胞术参数的基本物理量之外)，以便能够更好地指定或确认诊断。
本发明还涉及一种分析设备，包括：
-一种流式细胞仪，其包括用于待分析的生物样本的生物细胞穿过的测量单元和被配置为测量待分析的生物样本的生物细胞的流式细胞术参数的测量装置，以及
-处理单元，其被配置为：
-为待分析的生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为相应生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于3的整数，
-根据为待分析的生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数，将点聚类成不同的细胞簇，从而定义样本簇文件，
-比较样本簇文件与参考簇文件，每个参考簇文件由相应病理或异常生物样本的流式细胞术参数定义。
根据本发明的一个实施方案，所述分析设备是用于体外诊断的分析设备，例如血液学设备。
根据本发明的一个实施方案，所述流式细胞仪的测量单元相对于水平方向倾斜，例如倾斜大约45度的角度。
附图说明
在任何情况下，本发明将通过以下参考附图的描述而被清楚地理解，附图以非限制性的实施例的方式表示了该流式细胞仪的一个实施方案。
图1和2是属于根据本发明的流式细胞仪的流式细胞仪的透视图。
图3是图1的流式细胞仪的横截面图。
图4是图3细节的放大视图。
图5是图1的流式细胞仪的横截面图。
图6是沿图2的VI-VI线的截面图。
图6和7是图3细节的放大视图。
图8是包括根据本发明的流式细胞仪的分析设备的俯视图。
具体实施方式
图1至7代表属于根据本发明的分析设备2的流式细胞仪3，也称为流式细胞测量头。
所述流式细胞仪3包括单件式支撑件4，其可以是例如金属支撑件。支撑件4是平行六面体形状，并且界定了内部接收壳体5。支撑件4特别包括分别形成在支撑件4的六个外表面上的六个通道开口。
所述流式细胞仪3还包括至少部分界定了测量室7的测量单元6(在图4中更具体地示出)、设置成将生物细胞流F注射到测量室7中的注射装置8、以及设置成将注射到测量室7中的生物细胞流F排出到流式细胞仪3外部的排出装置9。
如图4所示，测量单元6是环形的，并且以密封的方式插入在注射装置和排出装置8、9之间。测量单元6容纳在由支撑件4界定的接收壳体5中，并且与接收壳体5在流体上隔离。测量单元6有利地由电绝缘且透光的材料制成，例如由聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃或石英制成，以避免自发荧光。
注射装置和排出装置8、9分别固定在支撑件4的两个相对的外表面上，例如固定在支撑件4的相对的横向外表面上。然而，注射装置和排出装置8、9也可以分别固定在支撑件4的两个上部和下部外表面上。
更具体地如图3和6所示，所述注射装置8包括界定了内室12的注射喷嘴11。所述注射喷嘴11设置有通向测量室7的注射孔13，并设置成将内室12在流体上连接到测量室7。
所述注射装置8还包括第一管状供应导管14，其用于向内室12供应待分析的生物样本，所述样本包含悬浮液中的待分析的生物细胞。
如图1所示，所述注射装置8还包括与内室12在流体上连接的输送导管15，用于将内室12的内容物输送到流式细胞仪3的外部。输送导管15更具体地用于将引入内室12的冲洗流体经由第一供应导管14输送到流式细胞仪3的外部。
注射装置8还包括第二供应导管16，所述第二供应导管16用于向内室12供应包覆流体。所述注射喷嘴11和第二供应导管16被构造成使得经由第二供应导管16引入内室12的包覆流体能够在生物样本通过注射孔13之前流体动力学地包覆引入内室12的生物样本。
如图7所示，所述排出装置9界定了通向测量室7的内室17，并且还包括管状排出导管18，所述管状排出导管18在流体上连接到测量室7，并且用于将注射到测量室7中的生物细胞流F向流式细胞仪3的外部排出。所述排出导管18部分地延伸到内腔17中，并通向与注射孔13相对的测量室7。
所述排出装置9还包括第三供应导管19，所述第三供应导管19在流体上连接至测量室7，并用于向测量室7供应包覆流体。所述测量室7和第三供应导管19被构造成使得经由第三供应导管19引入测量室7的包覆流体能够流体动力学地包覆流经测量室7的生物细胞流F。
如图1和7所示，所述排出装置9还包括输送导管21，所述输送导管21在流体上连接到测量室7，并用于将测量室7的内容物输送到流式细胞仪3的外部。所述输送导管21更具体地用于将引入测量室7的冲洗流体经由第三供应导管19输送到流式细胞仪3的外部。
所述流式细胞仪3还包括测量装置，所述测量装置被配置为测量待分析的生物细胞的流式细胞术参数，特别是测量待分析的生物细胞的光学和电学特性。
根据图1至图7所示的实施方案，所述测量装置包括发射装置22，所述发射装置22被设置成在测量室7的方向发射入射光束，并且能够与引入测量室7的生物细胞流F交叉，也就是说相交，以及几个收集装置23a、23b、23c，这些收集装置相对于生物细胞流F成角度地偏移，并且被设置成收集源自穿过测量室7的生物细胞的光束。然而，所述测量装置可以例如包括几个相对于生物细胞流成角度偏移的发射装置，以及一个或几个收集装置。
发射装置和收集装置安装在支撑件4的上下外表面上，并在基本垂直于生物细胞流F的流动方向的平面内延伸。收集装置23a例如相对于测量单元6与发射装置22相对设置，而收集装置23b和23c相对于测量单元6垂直于发射装置22设置。然而，根据本发明的变型，发射装置22和收集装置23a可以安装在支撑件4的横向外表面上。
所述发射装置22包括光源24，其被设置成产生入射光束。所述光源24例如可以被设置成产生激光束的激光源。
根据图1至图7所示的实施方案，更具体地说，如图1所示，所述收集装置23a包括多个收集光学元件，更具体地说，包括一根中心收集光纤25a和一根或几根外围收集光纤25b。例如，所述中心收集光纤25a用于沿着入射光束的光路(也就是说在0°处)收集来自测量室7的光束，所述外围收集光纤25b一些用于在4°范围内的角度收集来自测量室7的光束，而另一些用于在9°范围内的角度收集来自测量室7的光束。然而，所述收集装置23a可以包括单个外围收集光纤25b。
所述收集装置23b可以例如包括单个收集光学元件，例如中心收集光纤，并且收集装置23c也可以例如包括单个收集光学元件，例如中心收集光纤。
测量装置还包括多个检测元件(图中未示出)，每个检测元件与各自的收集装置23a-23c相关联。每个检测元件被设置成输出测量信号，所述测量信号根据由相应的收集装置收集的光束来确定。当每个生物细胞穿过入射光束时，每个检测元件输出的每个测量信号例如与所述生物细胞吸收或再发射的光的量成比例。每个检测元件例如可以是光电探测器，例如光电二极管或者光电倍增器。
所述测量装置还有利地包括电阻抗变化测量装置，所述电阻抗变化测量装置被设置成测量由生物细胞穿过注射孔13而产生的电阻抗变化。所述电阻抗变化测量装置包括例如第一电极和第二电极(图中未示出)，分别设置在注射孔13的两侧。所述第一电极和第二电极旨在与生物细胞流F电接触，从而通过注射孔13建立电场。根据电阻抗变化测量装置的变型，后者可以包括至少部分设置在内室17中的单个电极，并且内室12的电势可以接地，使得电阻抗变化测量装置被设置为测量内室12和放置在内室17中的电极之间的电阻抗变化。
这种电阻抗变化测量装置使得能够对通过注射孔13的生物细胞的数量进行计数，并且还能测定生物细胞的大小，更具体地说是体积。所述电阻抗变化测量设备的操作对于本领域技术人员来说是已知的，因此不再详细描述。然而，应该注意的是，每个生物细胞通过注射孔13会产生与所述生物细胞的大小或体积成比例的电脉冲。
如图8所示，所述分析设备2还包括处理单元32，处理单元32被配置为分析由流式细胞仪3的测量装置测量的流式细胞术参数，特别是分析由每个检测元件提供的测量信号。所述处理单元32更具体地被配置为区分和识别待分析的生物样本的生物细胞，并且特别地，根据由测量装置测量的流式细胞术参数来确定生物细胞的结构和形状。所述处理单元32更具体地包括至少一个配备有微处理器的电子处理卡。
如图8所示，所述分析装置2可以包括两个流式细胞仪3，以及装载模块33、卸载模块34、搅拌模块(在图8中不可见)，所述装载模块33被设置成沿第一位移方向D1移动至少一个支架，所述卸载模块34被设置成沿第二位移方向D2移动至少一个支架，所述搅拌模块被设置成在装载模块和卸载模块之间移动至少一个支架，搅拌模块以及装载模块和卸载模块限定了大致U形的架子运输路径。有利的是，所述分析设备2还包括采样模块36，所述采样模块36被设置成对位于搅拌模块中的支架中的容器中的生物液体进行取样。
所述分析设备2还可以包括：
-装载转子37，其设置在装载模块和卸载模块之间，并且具有基本垂直的旋转轴，装载转子37包括多个壳体38，壳体38能够接收包含待分析的生物流体样本或反应产物的容器，并且特别地能够接收药筒(cartridges)以对全血执行可配置的免疫血液学以及免疫学测试，所述采样模块36被设置成从装载转子37中接收的容器中获取样本或反应产物，
-旋转驱动装置，其与装载转子37相关联，并被设置成驱动装载转子37绕其旋转轴旋转。
-具有基本上垂直的旋转轴的制备转子39，该制备转子39包括多个制备试管41，采样模块36被设置为向制备试管41提供生物流体样本或预先获取的反应产物，以及
-旋转驱动装置，其与制备转子39相关联，并被设置成驱动装载转子39绕其旋转轴旋转。
所述装载转子37上的药筒的存在使得能够添加额外的制备试剂，因此，除了物理或形态学性质的流式细胞术参数的测量之外，还增加了免疫血液学性质的流式细胞术参数的测量。
此外，分析设备2可以在制备转子39处设置有允许捕获溶液中的磁性颗粒的磁性装置。这些磁性颗粒被抗体包覆，使得能够选择性地捕获某些类型的细胞，例如所有的白细胞。因此，在等渗稀释剂中重悬后，所制备的生物样本仅包含白细胞，而不必使用裂解来破坏数千倍的红细胞。因此，白细胞是完整的，进而有可能调整稀释率，以便能够对大量细胞进行N个流式细胞术参数的测量，从而有可能识别很少或罕见的细胞。此外，白细胞也可以选择性地标记用于常规免疫鉴定(例如T淋巴细胞)。
现在将描述使用根据本发明的流式细胞仪2分析包含生物细胞的生物样本的方法。
这种分析过程包括以下步骤：
-待分析的生物样本的制备，该制备步骤包括例如以下步骤：稀释待分析的生物样本，例如使用等渗稀释剂，和/或以下步骤：选择性裂解待分析的生物样本中所包含的至少一些生物细胞(如红细胞)，和/或以下步骤：用荧光染料标记待分析的生物样本中所包含的至少一些生物细胞，
-使待分析的生物样本中所包含的生物细胞进入流式细胞仪3的测量室7中，
-使用流式细胞仪3，为待分析的生物样本中所包含的每个生物细胞测量N个流式细胞术参数，例如代表待分析的生物样本的生物细胞的形态和/或结构的流式细胞术参数，
-为待分析的生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为待分析的生物样本的所述生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，N维空间的每个坐标轴对应于相应的测量的流式细胞术参数或根据所述相应的测量的流式细胞术参数计算的值，
-根据为待分析的生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数，将与待分析的生物样本相关的点自动聚类成不同的细胞簇，从而定义样品簇文件，所述样品簇文件例如是FCS(流式细胞标准)格式，
-对由样本簇文件的不同细胞簇定义的细胞群进行自动识别，
-对样本簇文件的每个细胞簇的点进行自动计数，
-将样本簇文件与参考簇文件进行比较，每个参考簇文件由相应病理或异常生物样本的流式细胞术参数定义，
-当样本簇文件与参考簇文件至少部分相同或相似时，特别是当样本簇文件的预定细胞簇与参考簇文件的预定细胞簇相同或相似时，发出警报消息，发出的警报消息有利地包含与参考簇文件(样本簇文件与该参考簇文件至少部分相同或相似)相关的病理或异常有关的指示，所述确定、聚类、比较和发出警报消息步骤由处理单元32执行。
这种自动聚类步骤可以以本领域技术人员已知的不同方式执行，因此在本说明书中不再详细描述。
根据本发明的一个实施方案，所述分析方法包括以下步骤：对在测量步骤持续期间产生的一组模拟信号进行采样和数字化，从而为N个测量通道中的每一个定义第一数字化原始数据文件，以及以下步骤：通过第一级计算机处理为待分析的样本的每个生物细胞的N个数字化信号进行同步和聚类。所述采样和数字化步骤由处理单元32执行，处理单元32通过以太网链路将文件传输到PC型计算机单元(图8中未示出)，PC型计算机单元对其进行分析。
根据所述分析方法的实施方案，后者还包括以下步骤：分析样本簇文件，从而检测样本簇文件中的至少一个可能的异常，所述分析步骤由处理单元32执行。有利的是，仅当在所述分析步骤期间检测到至少一个异常并且在发出警报步骤期间所发出的警报消息还包含与该至少一个检测到的异常相关的信息时，才执行比较步骤。这些设置，一方面，使得能够在待分析的生物样本是正常的而不是病理的情况下避免执行比较步骤，因此减少了执行计算的时间，并且更快地将分析结果提供给操作者，另一方面，当待分析的生物样本是病理的或异常的时，尽可能详细地向操作者传达警报消息。
所述分析步骤有利地包括以下步骤：
-对于样本簇文件的每个细胞簇，分析所述细胞簇的至少一个形态参数，例如所述细胞簇的位置、所述细胞簇的点的分布、所述细胞簇的点的数量和/或所述细胞簇的存在与否，
-如果样本簇文件的至少一个细胞簇的至少一个形态参数超过相应的预定阈值，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤更具体地包括以下步骤：
-对于样本簇文件的每个细胞簇，将所述细胞簇中聚类的点的数量与至少一个相应的预定阈值进行比较，
-分析样本簇文件的每个细胞簇中的点的分布，
-分析样本簇文件的细胞簇的位置，
-分析至少某些预定细胞簇的存在和/或不存在，
-如果至少一个细胞簇中的点的分布不是高斯分布，则检测到异常，
-如果样本簇文件的至少两个细胞簇至少部分混淆，则检测到异常，
-如果检测到至少一个预定的细胞簇的存在或不存在，则检测到异常，
-如果细胞簇的数量大于或小于预定参考值，则检测到异常，
-如果至少一个细胞簇中聚类的点的数量低于和/或大于相应的预定阈值，则检测到异常。
根据本发明的一个实施方案，所述分析步骤包括以下步骤：将样本簇文件与正常簇文件进行比较，每个正常簇文件由相应正常生物样本的流式细胞术参数定义。这些设置特别有利于检测样本簇文件中的异常。
根据本发明的一个实施方案，测量流式细胞术参数的步骤包括以下步骤：
-使用发射装置22向穿过测量室7的生物细胞发射入射光束，使得入射光束穿过生物细胞的路径，
-使用收集装置23a-23c检测来自穿过测量室7的每个生物细胞的不同光束。
鉴于不同收集装置23a-23c的配置和设置，测量流式细胞术参数的步骤特别包括以下步骤：
-使用收集装置23a的收集光纤25b、25c测量每个生物细胞以小角度散射的光束的强度，
-使用收集装置23a的中心收集光纤25a测量每个生物细胞沿着入射光束的光路散射的光束强度，
-使用收集装置23b测量每个生物细胞以90°散射的光束的强度，以及
-使用收集装置23c测量每个生物细胞在90°发射的荧光束的强度。
有利地，测量流式细胞术参数的步骤还包括以下步骤：使用电阻抗变化测量装置测量由生物细胞通过测量室7而产生的电阻抗变化。
有利的是，所述分析方法包括以下初始步骤：
-使用流式细胞仪3测量参考生物样本中所包含的每个生物细胞的流式细胞术参数，
-为参考生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的点，该点的坐标根据为参考生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数来定义，所述N维空间的每个坐标轴对应于各自测量的流式细胞术参数，
-根据为参考生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数，将与参考生物样本相关的点自动聚类成不同的细胞簇，从而定义参考簇文件，每个参考簇文件例如是FCS(流式细胞标准)格式，确定和聚类步骤由处理单元32执行，
-对多个参考生物样本重复所述初始测量、确定和聚类步骤，从而定义多个参考簇文件。
当然，本发明并不局限于流式细胞仪的唯一实施方案和分析方法的唯一实施方案，以上通过举例的方式进行了描述，相反，本发明包括其所有变体。

Claims (17)

1.一种用于分析包含生物细胞的生物样本的分析方法，所述生物细胞包括血细胞，所述分析方法包括以下步骤：
-使待分析的生物样本的生物细胞通过流式细胞仪的测量单元，
-为待分析的生物样本的每个生物细胞测量N个流式细胞术参数，
-为待分析的生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为相应生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于3的整数，
-根据所测量的流式细胞术参数将所确定的点自动聚类成不同的细胞簇，从而定义样本簇文件，
-对由样本簇文件的不同细胞簇定义的细胞群进行识别，
-对样本簇文件的每个细胞簇的点进行计数，
-将样本簇文件与参考簇文件进行比较，每个参考簇文件由相应病理或异常生物样本的流式细胞术参数定义。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其还包括以下步骤：当所述样本簇文件与参考簇文件至少部分地相同或相似时，发出警报消息。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其中，所发出的警报消息包含与病理或异常相关的指示，所述病理或异常与与样本簇文件至少部分相同或相似的参考簇文件相关联。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法，其还包括以下步骤：分析所述样本簇文件，从而检测所述样本簇文件中的至少一个可能的异常。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其中，比较步骤仅在分析步骤中检测出至少一个异常的情况下才进行。
6.根据权利要求4或5所述的分析方法，其中，分析步骤包括以下步骤：
-对于样本簇文件的每个细胞簇，分析所述细胞簇的至少一个形态参数，
-如果样本簇文件的至少一个细胞簇的至少一个形态参数超过相应的预定阈值，则检测到异常。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的分析方法，其中，分析步骤包括以下步骤：
-对于样本簇文件的每个细胞簇，将所述细胞簇中聚类的点的数量与至少一个相应的预定阈值进行比较，
-如果至少一个细胞簇中聚类的点的数量小于和/或大于至少一个相应的预定阈值，则检测到异常。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的分析方法，其中，分析步骤包括以下步骤：
-分析样本簇文件的每个细胞簇中的点的分布，
-如果至少一个细胞簇中的点的分布不是高斯分布，则检测到异常。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的分析方法，其中，分析步骤包括以下步骤：
-分析样本簇文件的细胞簇的位置，
-如果样本簇文件的至少两个细胞簇至少部分混淆，则检测到异常。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的分析方法，其中，分析步骤包括以下步骤：
-分析样本簇文件的细胞簇，
-如果检测到至少一个预定的细胞簇的存在或不存在，则检测到异常。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的分析方法，其中，测量流式细胞术参数的步骤包括至少一个以下步骤：测量代表待分析的生物样本的生物细胞的形态和/或结构的流式细胞术参数。
12.根据权利要求11所述的分析方法，其中，测量流式细胞术参数的步骤包括至少一个以下步骤：对于待分析的生物样本的每个生物细胞，测量所述生物细胞的至少一个光学特性。
13.根据权利要求12所述的分析方法，其中，测量流式细胞术参数的步骤包括：
-测量由每个生物细胞以小角度散射的光束强度的步骤，和/或
-测量由每个生物细胞以90°散射的光束强度的步骤，和/或
-测量由每个生物细胞沿着入射光束的光路散射的光束强度的步骤。
14.根据权利要求12或13所述的分析方法，其中，测量流式细胞术参数的步骤包括以下步骤：测量由每个生物细胞例如在90°发射的至少一个荧光束的强度。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的分析方法，其中，测量流式细胞术参数的步骤包括以下步骤：
-向穿过测量室的生物细胞发射入射光束，使得入射光束穿过生物细胞的路径，
-检测来自穿过测量室的每个生物细胞的至少一束光束。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分析方法，其还包括以下步骤：
-使参考生物样本的生物细胞进入流式细胞仪的测量单元，
-为参考生物样本的每个生物细胞测量N个流式细胞术参数，
-为参考生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为参考生物样本的所述生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于3的整数，
-根据为参考生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数，将确定的与参考生物样本相关的点自动聚类成不同的细胞簇，从而定义参考簇文件，
-对多个参考生物样本重复上述通过、测量、确定和聚类步骤，从而定义多个参考簇文件。
17.一种分析设备，其包括：
-一种流式细胞仪，其包括用于待分析的生物样本的生物细胞穿过的测量单元和被配置为测量待分析的生物样本的生物细胞的流式细胞术参数的测量装置，以及
-处理单元(32)，其被配置为：
-为待分析的生物样本的每个生物细胞确定N维空间中的一个点，该点的坐标是根据为相应生物细胞测量的流式细胞术参数而定义的，其中N是大于或等于3的整数，
-根据为待分析的生物样本的每个生物细胞测量的流式细胞术参数，将点聚类成不同的细胞簇，从而定义样本簇文件，
-比较样本簇文件与参考簇文件，每个参考簇文件由相应病理或异常生物样本的流式细胞术参数定义。
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