BR112020017931A2 - Método de análise para analisar uma amostra biológica contendo células biológicas e aparelho de análise - Google Patents

Abstract

o método de análise compreende uma etapa de medição dos parâmetros de citometria para cada célula biológica contida em uma amostra biológica; uma etapa de determinar, para cada célula biológica da amostra biológica, um ponto em um espaço n-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para a célula biológica correspondente, em que n é um número inteiro maior ou igual a 3; uma etapa de agrupamento automático dos pontos em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostras; e uma etapa de comparação dos arquivos de agrupamento de amostras com os arquivos de agrupamento de referência, cada um dos arquivos de agrupamento de referência sendo definido a partir de parâmetros de citometria de uma respectiva amostra biológica patológica ou anormal.

Description

“MÉTODO DE ANÁLISE PARA ANALISAR UMA AMOSTRA BIOLÓGICA CONTENDO CÉLULAS BIOLÓGICAS E APARELHO DE ANÁLISE”

[001] A presente invenção refere-se a um método para analisar uma amostra biológica contendo células biológicas e, em particular, células sanguíneas, e um aparelho de análise adaptado para a implementação de tal método de análise.

[002] As células que circulam no sangue compreendem células não nucleadas que são glóbulos vermelhos ou eritrócitos (cerca de 5 milhões por mm3 de sangue normal), plaquetas (cerca de 300.000 por mm3) e compreendem células nucleadas, os leucócitos (cerca de 10.000 por mm3). O sangue pode conter outras células nucleadas, como eritroblastos, que são glóbulos vermelhos imaturos ou outras células mais raras. Cada tipo de célula constitui o que também é chamado de população.

[003] Outros fluidos biológicos contêm células sanguíneas, como líquido cefalorraquidiano ou urina. Posteriormente, trata-se de uma amostra biológica, mas este não se limita a uma amostra de sangue, mas a todos os fluidos biológicos que contêm células sanguíneas.

[004] Os analisadores de hematologia convencionais que usam a citometria de fluxo ou não, destinam-se a realizar a Contagem de Sangue Completa e entregar informação qualitativa quando anomalias quantitativas são detectadas por tipo de célula.

[005] Os equipamentos citométricos especializados em imunohematologia permitem, graças a técnicas mais sofisticadas e a implementação de reagentes específicos, ter como alvo patologias hematológicas que podem afetar todos os tipos de células.

[006] É lembrado que a citometria de fluxo consiste em realizar pelo menos um foco hidrodinâmico e ao passar as células sanguíneas uma a uma através de um dispositivo de medição que, de acordo com o que é implementado, produz um certo número de medições físicas para cada célula.

Para que as medições sejam feitas de maneira distinta, as células devem ser separadas e rolar em velocidades que permitam as medições e sua aquisição.

Além disso, deve haver contagens suficientes para permitir avaliações estatísticas apropriadas de cada população. Para fazer isso, a amostra de sangue não é analisada pura, mas diluída. Além disso, levando em conta as quantidades de glóbulos vermelhos do sangue, que são mil vezes maior do que os leucócitos, a amostra, para realizar uma análise que é estatisticamente representante e das populações de leucócitos, deve passar por um período de vários minutos no citômetro. A outra solução, para reduzir o tempo de passagem da amostra no citômetro por um fator de dez, consiste em realizar, além de uma diluição da amostra, uma lise que destrua seletivamente os glóbulos vermelhos para ter uma amostra suficientemente concentrada em leucócitos e, portanto, ter contagens estatisticamente corretas para essas populações.

[007] Existem dois tipos de parâmetros de citometria de fluxo produzidos: - quer de uma natureza física ou morfológica: medição do volume das células por impedância (efeito Coulter), medições de absorção óptica, difração em diferentes ângulos gerados pela passagem de cada célula em um feixe de laser e medição de fluorescência de ácidos nucleicos tornados fluorescentes por um ou mais fluorocromos previamente trazidos à presença das células. Esses dados permitem caracterizar cada célula por seu volume, por sua absorção óptica que depende de sua superfície e de seu conteúdo, por sua complexidade interna, pela natureza de sua superfície, por sua composição e por sua atividade nucleica para as células nucleadas; - quer de uma natureza imunológica (imunohematologia): a amostra é colocada na presença de reagentes contendo anticorpos conjugados com um fluorocromo e específicos para receptores expressos na superfície de determinadas células. A passagem das células em um ou vários raio(s) laser gera sinais proporcionais aos marcadores de superfície das células e, assim, permite caracterizar as células.

[008] Um método para analisar uma amostra biológica contendo células biológicas compreende, de uma maneira conhecida, as seguintes etapas: - passagem das células biológicas da amostra biológica a ser analisada em uma célula de medição de um citômetro de fluxo, - medição de N parâmetros de citometria, como citometria morfológica ou imunológica, para cada célula biológica contida na amostra biológica a ser analisada, - determinação, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de um ponto no espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas de acordo com os parâmetros de citometria medidos para a célula biológica correspondente, em que N é um número inteiro maior ou igual a 2, - para o equipamento cuja função se limita a Contagem de Sangue Completa, agrupar os pontos em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostras, a etapa de agrupamento, em seguida, sendo realizada usando métodos zoneamento automático, métodos estatísticos ou ainda métodos de densidade de ponto - para equipamentos mais sofisticados que realizem medições hemato-imunológicas, • quer por análise visual por um operador, tal como um hematologista, especialista em citometria de representações dos pontos determinados em dois eixos de medição e agrupamento dos pontos em diferentes células de agrupamentos de acordo com os critérios de agrupamento por limiares ou ainda por zonas selecionadas pelo operador,

• ou agrupamento automático dos pontos em diferentes agrupamentos de células dependendo dos parâmetros de citometria medidos, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostras, e análise por computador do arquivo de agrupamento de amostras e, em particular, dos diferentes agrupamentos de células, a etapa de análise como objetivo de qualificar e quantificar os agrupamentos de células que têm características comuns, - identificação pelo operador de uma ou várias anomalia (anomalias) no arquivo de agrupamento de amostras em comparação com amostras normais.

[009] A partir das anomalias identificadas, por exemplo, por cruzamento dos limites numéricos (número anormalmente baixo ou anormalmente elevado de um tipo de célula), e com a sua experiência na citometria médica, o operador pode ser capaz de determinar diretamente a patologia do paciente cuja amostra biológica foi analisada e o tratamento associado, ou emitir um prognóstico em relação à eventual patologia do paciente cuja amostra biológica foi analisada e considerar testes sanguíneos complementares, a fim de confirmar o seu prognóstico.

[0010] No entanto, as etapas de agrupamento, análise e identificação são bastante subjetivas e dependem fortemente da experiência do operador em citometria, de modo que um diagnóstico ou prognóstico estabelecido para um paciente por um operador dependa da qualificação e experiência do operador. No entanto, essas etapas são trabalhosas e demoradas. As taxas de processamento destes equipamentos são baixos em comparação com aqueles dos contadores de hematologia.

[0011] Além disso, a citometria na imunohematologia, utilizando anticorpos para caracterizar as células de maneira muito específica, utiliza produtos caros, o que dificulta o estabelecimento da citometria como método de rotina.

[0012] Finalmente, este tipo de análise que tem como objetivo o agrupamento das células que têm características comuns destina-se a enumerar e qualificar as populações para qualificar as anomalias do mesmo por tipo de população. Portanto, este tipo de análise, portanto, não está interessada em todos os dados, como em uma imagem geral da amostra do paciente.

[0013] A presente invenção tem como objetivo superar essas desvantagens e introduzir um novo paradigma, usando os dados coletados pelo citômetro de fluxo para caracterizar as células biológicas, agrupá-las automaticamente por agrupamento, identificar e qualificar as populações dos agrupamentos, mas também considerar todos os dados como uma representação de imagem da amostra biológica e também processar essa imagem em relação às imagens de referência.

[0014] O problema técnico subjacente à invenção consiste, em particular, em fornecer um método para analisar uma amostra biológica contendo células biológicas que otimiza o processamento dos dados das medições, o que garante uma reprodutibilidade dos resultados obtidos, garantindo ao mesmo tempo que esse processo seja compatível com equipamento de alta velocidade e não requer nenhuma habilidade ou tempo específico do operador.

[0015] Para esse fim, a presente invenção refere-se a um método para analisar uma amostra biológica contendo células biológicas, incluindo células sanguíneas, o método de análise compreendendo as seguintes etapas: - passagem das células biológicas da amostra biológica a ser analisada em uma célula de medição de um citômetro de fluxo, - medição de N parâmetros de citometria das células biológicas contidas em uma amostra biológica a ser analisada, - determinação, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de um ponto no espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas de acordo com os parâmetros de citometria medidos para a célula biológica correspondente, em que N é um número inteiro maior ou igual a 3 - agrupamento automático dos pontos determinados em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostras, o arquivo de agrupamento de amostras sendo vantajosamente um arquivo de computador que descreve digitalmente a amostra biológica a ser analisada e, de preferência, sendo escrita de acordo com um padrão, - identificação das populações de células definidas pelos diferentes agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - contagem dos pontos de cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, - comparação do arquivo de agrupamento de amostras com os arquivos de agrupamento de referência, cada um dos arquivos de agrupamento de referência sendo definidos a partir dos parâmetros de citometria de uma respectiva amostra biológica patológica ou anormal.

[0016] Uma tal configuração do método de análise de acordo com a presente invenção permite identificar automaticamente uma possível semelhança entre o arquivo de agrupamento de amostras, que descreve digitalmente a amostra biológica a ser analisada, e um ou mais arquivo(s) de agrupamento de amostras, e, por conseguinte, melhorar a relevância das indicações retornadas a um operador (através, por exemplo, de indicações ou alarmes específicos adicionados às medições retornadas) no final da etapa de comparação, ajudando assim a fornecer ao operador as recomendações mais relevantes possíveis para acelerar o diagnóstico. Em particular, o método de análise de acordo com a presente invenção permite que o laboratório economize tempo nas decisões a serem tomadas, especifique o escopo das investigações subsequentes e direcione, se necessário, os hematologistas mais rapidamente a análises complementares que podem ser de esfregaços de sangue seguidos de análises microscópicas ou imunoensaios usando meios simples, baratos e robustos. Não se trata de substituir esse processo pela análise da imagem do esfregaço de sangue, mas de extrair o máximo de informações possíveis do hemograma digital e isso sem custo adicional, nem material, nem tempo.

[0017] O método de análise de acordo com a presente invenção consiste mais particularmente em realizar, com base em medições citométricas, uma análise morfológica comparativa da amostra biológica considerada, com amostras biológicas de referência e, mais especificamente, uma análise morfológica comparativa do arquivo de agrupamento de amostras, que é estabelecida a partir da amostra biológica analisada, com arquivos de agrupamento de referência estabelecidos a partir de amostras biológicas patológicas ou anormais cujos dados clínicos são conhecidos.

[0018] O método de análise de acordo com a presente invenção é, portanto, baseado na realização de arquivos de referência obtidos de amostras cuja patologia é conhecida. Na verdade, é um aprendizado realizado pela compilação de ensaios clínicos e que pode progredir dependendo de novos arquivos de referência correspondentes a novas anomalias ou patologias.

[0019] Cada versão de aprendizagem não é específica para cada máquina, mas é validada e aplica-se a todas as máquinas do mesmo tipo que operam com os reagentes de composições idênticas para as preparações (diluição, lise, rotulagem fluorescente).

[0020] As células que circulam no sangue resultam do que é produzido pela hematopoiese, pelo desprendimento de células endoteliais e pelas infecções por agentes alogênicos, tais como bactérias ou parasitas, tal como Plasmodium. A hematopoiese produz na medula óssea, por um lado,

leucócitos, ou seja, polinucleares ou neutrófilos, eosinófilos e granulócitos basófilos, monócitos e linfócitos, e por outro lado, eritrócitos e plaquetas. Cada tipo de célula pode ser afetado por diferentes tipos de patologias que podem causar células imaturas no sangue, como, por exemplo, eritroblastos que são eritrócitos que ainda possuem seu núcleo ou reticulócitos que não têm mais um núcleo, mas ainda têm um ribossomo e atividade mitocondrial.

[0021] De acordo com uma forma de realização da invenção, os parâmetros de citometria medidos são medições físicas, tais como o volume de cada célula biológica, a absorção óptica, a difração em grandes ângulos, a difração em pequenos ângulos.

[0022] O método de análise pode ainda ter uma ou mais das seguintes características, tomadas sozinhas ou em combinação.

[0023] De acordo com uma forma de realização da invenção, as células biológicas a serem analisadas podem ser células do sangue, e mais particularmente as células do sangue, que tenham sido submetidas a uma preparação, seja uma diluição isotônica para preservar as células e para ser capaz de espaça-las suficientemente no citômetro e para medir, sob as melhores condições, cada parâmetro de citometria ou uma operação de lise seletiva que eliminará os glóbulos vermelhos que são aproximadamente mil vezes numerosos que os glóbulos brancos, essa operação de lise sendo capaz de identificar e contar os leucócitos em menor tempo, mas isso também resulta em modificações, dependendo do tipo de lise, do volume e da resposta óptica das células não lisadas observadas.

[0024] De fato, a forma de realização preferida da invenção utiliza dois citômetros em paralelo, um primeiro no qual a amostra biológica é apenas diluída e o segundo, que processa a amostra biológica lisada, mais particularmente para observar as células nucleadas. Isto permite coletar dados em espaços com dimensões N > 3 tanto para a amostra biológica lisada quanto para a amostra biológica não-lisada. Isto significa que as células não nucleadas que são eritrócitos e plaquetas são processadas pelos mesmos tipos de algoritmos que as células nucleadas.

[0025] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de agrupamento é realizada por um processamento automático, de acordo com algoritmos específicos, dos pontos determinados pelos N parâmetros de citometria correspondentes a cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada. Os diferentes pontos podem, por exemplo, ser agrupados em diferentes agrupamentos de pontos de acordo com critérios estatísticos ou critérios de densidade desses pontos no espaço N-dimensional, de modo a definir um arquivo que descreva digitalmente a amostra biológica a ser analisada pelos pontos que representam cada célula, agrupadas em agrupamentos posicionados no espaço N-dimensional.

[0026] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende uma etapa de amostragem e digitalização de um conjunto de sinais analógicos gerados durante a duração da etapa de medição, de modo a definir um primeiro arquivo de dados brutos semelhante a um oscilograma digital para cada um dos N canais de medição e uma etapa de sincronização e agrupamento do N sinal digitalizado para cada célula biológica da amostra a ser analisada por um primeiro nível de processamento por computador.

[0027] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de agrupamento consiste em agrupar os pontos determinados em agrupamentos de células diferentes usando métodos estatísticos ou permitindo o isolamento de agrupamentos por análise de densidade espacial dos pontos que representam as células no espaço N-dimensional.

[0028] De acordo com uma forma de realização da invenção, cada eixo de coordenada do espaço N-dimensional corresponde a um respectivo parâmetro de citometria.

[0029] De acordo com uma forma de realização da invenção, N é um número inteiro maior ou igual a 4 e pode, por exemplo, ser igual a 5.

[0030] De acordo com uma forma de realização da invenção, o arquivo de agrupamento de amostras está no formato de FCS (Citometria de Fluxo padrão).

[0031] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende ainda uma etapa de emitir uma mensagem de alarme quando o arquivo de agrupamento de amostras é pelo menos parcialmente idêntico ou semelhante a um arquivo de agrupamento de referência e, por exemplo, quando agrupamentos de células predeterminados do arquivo de agrupamento de amostras são idênticos ou semelhantes aos agrupamentos de células predeterminados do arquivo de agrupamento de referência.

[0032] De acordo com uma forma de realização da invenção, a mensagem de alarme emitida contém indicações relacionadas a uma patologia ou anormalidade associada ao arquivo de agrupamento de referência ao qual o arquivo de agrupamento de amostras é pelo menos parcialmente idêntico ou semelhante. Estas disposições permitem a comunicação, ao operador, de uma probabilidade de patologia associada à amostra biológica analisada, mas não constitui em qualquer caso um diagnóstico da patologia de que o paciente, do qual a amostra biológica analisada foi tomada, possa ser afetado.

[0033] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende ainda uma etapa de análise do arquivo de agrupamento de amostras, de modo a detectar pelo menos uma anomalia possível no arquivo de agrupamento de amostras.

[0034] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de comparação é realizada apenas quando pelo menos uma anomalia é detectada durante a etapa de análise.

[0035] De acordo com uma forma de realização da invenção, quando pelo menos uma anomalia é detectada durante a etapa de análise, a mensagem de alarme emitida durante a etapa de emissão também contém informações relacionadas à pelo menos uma anomalia detectada.

[0036] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende uma etapa de análise, para cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, pelo menos um parâmetro morfológico do referido agrupamento de células.

[0037] De acordo com uma forma de realização da invenção, o pelo menos um parâmetro morfológico de cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras pode compreender o posicionamento do referido agrupamento de células, a distribuição dos pontos do referido agrupamento de células, o número de pontos do referido agrupamento de células, e/ ou a presença ou a ausência do referido agrupamento de células. Assim, a detecção de uma contagem anormal de um agrupamentos de células, de um posicionamento relativo anormal entre agrupamentos de células diferentes ou ainda da presença de um agrupamento de células relativas a uma população anormal de células permite detectar uma anomalia no arquivo de agrupamento de amostras.

[0038] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende uma etapa de detecção de uma anomalia se pelo menos um parâmetro morfológico de pelo menos um agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras exceder um respectivo valor limiar predeterminado.

[0039] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende as seguintes etapas: - comparação, para cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, do número de pontos agrupados no referido agrupamento de células com pelo menos um respectivo valor limiar predeterminado, - detecção de uma anomalia se o número de pontos agrupados em pelo menos um dos agrupamentos de células for menor e/ ou maior que o pelo menos um respectivo valor limiar predeterminado.

[0040] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende as seguintes etapas: - comparação, para cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, do número de pontos agrupados no referido agrupamento de células com um respectivo valor limiar inferior predeterminado ou com um respectivo valor limiar superior predeterminado, - detecção de uma anomalia se o número de pontos agrupados em pelo menos um dos agrupamentos de células for menor que o respectivo valor limiar inferior predeterminado ou maior que o respectivo valor limiar superior predeterminado.

[0041] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende as seguintes etapas: - análise da distribuição dos pontos em cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, - detecção de uma anomalia se a distribuição dos pontos em pelo menos um dos agrupamentos de células não for Gaussiana.

[0042] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende as seguintes etapas: - análise do posicionamento dos agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - detecção de uma anomalia se pelo menos dois agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras estiverem pelo menos parcialmente confusos.

[0043] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende as seguintes etapas: - análise dos agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - detecção de uma anomalia se for detectada a presença ou ausência de pelo menos um agrupamento de células predeterminado.

[0044] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende as seguintes etapas: - análise do arquivo de agrupamento de amostras, - detecção de uma anomalia se o número de agrupamentos de células for maior ou menor que um valor de referência predeterminado.

[0045] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende uma etapa de busca de agrupamentos de células anormais ou atípicos, isto é, localizados fora dos agrupamentos de células normais, os agrupamentos de células anormais ou atípicos podem, por exemplo, corresponder a células imaturas ou parasitas. O método de análise pode ainda compreender uma etapa de comparação desses agrupamentos de células anormais ou atípicos com os arquivos de referência.

[0046] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria compreende pelo menos uma etapa de medição dos parâmetros de citometria representativos da morfologia e/ ou da estrutura das células biológicas da amostra biológica a ser analisada.

[0047] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria compreende pelo menos uma etapa de medição de, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, pelo menos uma propriedade óptica da referida célula biológica.

[0048] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria compreende pelo menos uma etapa de medição, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de pelo menos uma propriedade elétrica e/ ou eletromagnética da referida célula biológica.

[0049] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria compreende uma etapa de medir uma quantidade de luz absorvida ou reemitida por cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada.

[0050] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria compreende: - uma etapa de medição da intensidade de um feixe de luz espalhado em pequenos ângulos por cada célula biológica, e/ ou - uma etapa de medição da intensidade de um feixe de luz espalhado a 90º por cada célula biológica e/ ou - uma etapa de medição da intensidade de um feixe de luz espalhado ao longo de um caminho óptico do feixe de luz incidente por cada célula biológica.

[0051] A luz espalhada por cada célula biológica fornece informações sobre a morfologia e estrutura da referida célula biológica. Em particular, a intensidade de um feixe de luz espalhado em pequenos ângulos, por exemplo, em ângulos inferiores a 15°, vantajosamente igual a 4° e/ ou 9°, por cada célula biológica é substancialmente proporcional ao tamanho da referida célula biológica, enquanto a intensidade de um feixe de luz espalhado a 90° por cada célula biológica é proporcional à forma, à estrutura interna e à granularidade da referida célula biológica. Além disso, a intensidade de um feixe de luz no eixo óptico do feixe de luz incidente por cada célula biológica é proporcional ao tamanho e à viabilidade da referida célula biológica. Tal medida de difusão ao longo do caminho óptico do feixe de luz incidente corresponde a uma medida da intensidade da absorção de luz de cada célula biológica.

[0052] Assim, a utilização simultânea destes dois ou três parâmetros acima mencionados (medição de impedância, medição de absorção óptica, medições de difusão em diferentes ângulos) permite distinguir, em uma amostra biológica, por exemplo, plaquetas, eritrócitos, linfócitos, monócitos e diferentes populações de leucócitos polimorfonucleares.

[0053] Os valores dos ângulos comunicados abaixo são entendidos como relativos ao caminho óptico do feixe de luz incidente.

[0054] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria compreende uma etapa de medição da intensidade de pelo menos um feixe de fluorescência emitido por cada célula biológica, por exemplo, a 90°.

[0055] De acordo com uma forma de realização da invenção, uma etapa de medir de parâmetros de citometria compreende ainda uma etapa de medir a variação na impedância eléctrica produzida pela passagem das células biológicas por meio de uma câmara de medição.

[0056] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria inclui as seguintes etapas: - emissão de um feixe de luz incidente em direção às células biológicas que passam através da câmara de medição, de modo que o feixe de luz incidente atravesse o caminho das células biológicas, - detecção de pelo menos um feixe de luz de cada célula biológica que passa pela câmara de medição.

[0057] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de passagem inclui pelo menos uma etapa de revestimento hidrodinâmico das células biológicas que passam através da câmara de medição.

[0058] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de detecção compreende uma etapa de detecção simultânea de pelo menos um feixe de luz espalhado por cada célula biológica que passa através da câmara de medição e pelo menos um feixe de fluorescência emitido por cada célula biológica que passa através da câmara de medição.

[0059] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de detecção compreende uma etapa de detecção simultânea de feixes de luz espalhados em pelo menos duas direções diferentes por cada célula biológica que passa pela câmara de medição e de pelo menos dois feixes de fluorescência emitidos por cada célula biológica que passa através a câmara de medição tendo pelo menos dois comprimentos de onda diferentes.

[0060] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende uma etapa de determinação da estrutura e/ ou da forma das referidas células biológicas.

[0061] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende uma etapa de determinação da concentração das células biológicas e/ ou da distribuição das células biológicas nos respectivos agrupamentos de células.

[0062] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende ainda as seguintes etapas: - passagem das células biológicas de uma amostra biológica de referência em uma célula de medição de um citômetro de fluxo, - medição de N parâmetros de citometria para cada célula biológica contida na amostra biológica de referência, - determinação, para cada célula biológica da amostra biológica de referência, de um ponto em um espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para a referida célula biológica da amostra biológica de referência, em que N é um número inteiro maior que ou igual a 3, - agrupamento automático dos pontos determinados relacionados com a amostra biológica de referência em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica de referência, de modo a definir um arquivo de agrupamento de referência, - repetir as referidas etapas de passagem, medição, determinação e agrupamento para uma pluralidade de amostras biológicas de referência, de modo a definir uma pluralidade de arquivos de agrupamento de referência.

[0063] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende, antes da etapa da passagem das células biológicas da amostra biológica a ser analisada, uma etapa de preparação da amostra biológica a ser analisada. A etapa de preparação inclui, por exemplo, uma etapa de diluição da amostra biológica a ser analisada, por exemplo, utilizando um diluente isotônico. A etapa de preparação também pode compreender, além da etapa de diluição, uma etapa de lise seletiva de pelo menos algumas das células biológicas contidas na amostra biológica a ser analisada e, por exemplo, eritrócitos.

[0064] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de preparação compreende uma etapa de marcação de pelo menos algumas das células biológicas contidas na amostra biológica a ser analisada e, mais particularmente, os ácidos nucleicos de pelo menos algumas das células biológicas contidas na amostra biológica a ser analisada, com um fluorocromo, como um corante fluorescente.

[0065] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise inclui uma etapa de integração do arquivo de agrupamento de amostras como um arquivo de agrupamento de referência. Essa etapa de integração é realizada, em particular, após um hematologista ter identificado a patologia relacionada à amostra biológica a ser analisada e ter associado indicações relacionadas a essa patologia ao arquivo de agrupamento de amostras.

[0066] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise, e em particular a etapa de análise, compreende uma etapa de comparar o arquivo de agrupamento de amostras com os arquivos de agrupamento normais, cada um dos arquivos de agrupamento normais sendo definido a partir de parâmetros de citometria de uma respectiva amostra biológica normal. Na presente descrição, o termo amostra biológica “normal” significa uma amostra biológica que não é patológica e que não é anormal.

[0067] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de preparação compreende a adição, na amostra biológica a ser analisada, de um ou mais reagente(s) contendo anticorpos específicos para os receptores localizados nas membranas das células biológicas. Estes anticorpos são conjugados, quer a marcadores fluorescentes, ou a partículas que permitem a geração de um ou mais sinal(is) específico(s) em cada célula. Assim, o método de análise de acordo com a invenção permite adicionar, às magnitudes físicas básicas digitalmente convertidas em parâmetros de citometria, medições imuno- hematológicas sob demanda para poder especificar ou confirmar melhor um diagnóstico.

[0068] A presente invenção refere-se ainda a um aparelho de análise que compreende: - um citômetro de fluxo compreendendo uma célula de medição destinada à passagem de células biológicas de uma amostra biológica a ser analisada e meios de medição configurados para medir parâmetros de citometria das células biológicas da amostra biológica a ser analisada, e - uma unidade de processamento configurada para: - determinar, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, um ponto em um espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para a célula biológica correspondente, em que N é um número inteiro maior ou igual a 3, - agrupar os pontos em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostras, - comparar o arquivo de agrupamento de amostra com arquivos de agrupamento de referência, cada um dos arquivos de agrupamento de referência sendo definido a partir de parâmetros de citometria de uma respectiva amostra biológica patológica ou anormal.

[0069] De acordo com uma forma de realização da invenção, o aparelho de análise é um aparelho de análise para diagnóstico in vitro, como um dispositivo de hematologia.

[0070] De acordo com uma forma de realização da invenção, a célula de medição do citômetro de fluxo é inclinada em relação à horizontal e, por exemplo, em um ângulo de cerca de 45°.

[0071] Em qualquer caso, a invenção será claramente compreendida através da seguinte descrição com referência aos desenhos esquemáticos em anexo que representam, a título de exemplo não limitativo, uma forma de realização deste citômetro de fluxo.

[0072] As Figuras 1 e 2 são vistas em perspectiva de um citômetro de fluxo pertencente a um citômetro de fluxo de acordo com a presente invenção.

[0073] A Figura 3 é uma vista em corte transversal do citômetro de fluxo da Figura 1.

[0074] A Figura 4 é uma vista ampliada de um detalhe da Figura 3.

[0075] A Figura 5 é uma vista em seção transversal do citômetro de fluxo da Figura 1.

[0076] A Figura 6 é uma vista em corte ao longo da linha VI-VI da Figura 2.

[0077] As Figuras 6 e 7 são vistas em escala ampliada dos detalhes da Figura 3.

[0078] A Figura 8 é uma vista superior de um aparelho de análise compreendendo o citômetro de fluxo de acordo com a presente invenção.

[0079] As Figuras 1 a 7 representam um citômetro de fluxo (3), também chamado de cabeça de medição citométrica, pertencente a um aparelho de análise (2) de acordo com a presente invenção.

[0080] O citômetro de fluxo (3) compreende um suporte de peça única (4) que pode, por exemplo, ser um suporte de metal. O suporte (4) tem a forma de um paralelepípedo e delimita um invólucro interno de recepção (5). O suporte (4) inclui, em particular, seis aberturas de passagem formadas respectivamente nas seis faces externas do suporte (4).

[0081] O citômetro de fluxo (3) compreende ainda uma célula de medição (6) (mostrada mais particularmente na Figura 4) que pelo menos parcialmente delimita uma câmara de medição (7), um dispositivo de injeção (8) disposto para injetar um fluxo de células biológicas (F) na câmara de medição (7) e um dispositivo de descarga (9) disposto para descarregar, fora do citômetro de fluxo (3), o fluxo das células biológicas (F) injetadas na câmara de medição (7).

[0082] Como mostrado na Figura 4, a célula de medição (6) é anular e é interposta de maneira vedada entre os dispositivos de injeção e descarga (8, 9). A célula de medição (6) é alojada no invólucro de recebimento (5) delimitado pelo suporte (4) e é isolada fluidamente do invólucro de recebimento (5). A célula de medição (6) é vantajosamente feita de um material eletricamente isolante e transparente à luz e, por exemplo, feito de polimetilmetacrilato, vidro ou quartzo para evitar a autofluorescência.

[0083] Os dispositivos de injeção e descarga (8, 9) são fixados respectivamente em duas faces externas opostas do suporte (4) e, por exemplo,

sobre as faces externas laterais opostas do suporte (4). No entanto, os dispositivos de injeção e descarga (8, 9) também podem ser fixados respectivamente sobre as duas faces externas superior e inferior do suporte (4).

[0084] Como mostrado mais particularmente nas Figuras 3 e 6, o dispositivo de injeção (8) compreende um bico de injeção (11) que delimita uma câmara interna (12). O bico de injeção (11) é fornecido com um orifício de injeção (13) que se abre dentro da câmara de medição (7) e disposto para conectar fluidamente o interior câmara (12) à câmara de medição (7).

[0085] O dispositivo de injeção (8) compreende ainda um primeiro conduite de suprimento tubular (14) destinado a fornecer à câmara interna (12) uma amostra biológica a ser analisada contendo, em suspensão, células biológicas a serem analisadas.

[0086] Como é mostrado na Figura 1, o dispositivo de injeção (8) inclui ainda um conduite de transporte (15) conectado fluidamente à câmara interna (12) e destinado a transportar o conteúdo da câmara interna (12) para o exterior do citômetro de fluxo (3). O conduite de transporte (15) é mais particularmente destinado a transportar um fluido de enxágue, introduzido na câmara interna (12), para o exterior do citômetro de fluxo (3) através do primeiro duto de suprimento (14).

[0087] O dispositivo de injeção (8) compreende ainda um segundo conduite de suprimento (16) destinado a abastecer a câmara interna (12) com um fluido de revestimento. O bico de injeção (11) e o segundo conduite de fornecimento (16) são configurados de tal modo que o fluido de revestimento introduzido no interior da câmara (12) através do segundo conduite de fornecimento (16) é capaz de revestir hidrodinamicamente a amostra biológica introduzida no interior da câmara (12), antes de as amostras biológicas passarem através o orifício de injeção (13).

[0088] Como mostrado na Figura 7, o dispositivo de descarga (9)

delimita uma câmara interna (17) que se abre na câmara de medição (7) e compreende ainda um conduite de descarga tubular (18) conectado fluidamente à câmara de medição (7) e destinado a descarregar o fluxo das células biológicas (F) injetadas na câmara de medição (7) em direção à parte externa do citômetro de fluxo (3). O duto de descarga (18) se estende parcialmente para dentro de uma câmara interna (17) e se abre para a câmara de medição (7) oposta ao orifício de injeção (13).

[0089] O dispositivo de descarga (9) compreende ainda um terceiro conduite de suprimento (19) conectado fluidamente à câmara de medição (7) e destinado a suprir a câmara de medição (7) com um fluido de revestimento. A câmara de medição (7) e o terceiro conduite de fornecimento (19) são configurados de modo que o fluido de revestimento introduzido na câmara de medição (7) através do terceiro conduite de fornecimento (19) seja capaz de revestir hidrodinamicamente o fluxo das células biológicas (F) que fluem através da câmara de medição (7).

[0090] Como mostrado nas Figuras 1 e 7, o dispositivo de descarga (9) inclui ainda um conduite de transporte (21) conectado fluidamente à câmara de medição (7) e destinado a transportar o conteúdo da câmara de medição (7) para fora do citômetro de fluxo (3). O conduite de transporte (21) é mais particularmente destinado transportar um fluido de enxágue, introduzido na câmara de medição (7), fora do citômetro de fluxo (3) através do terceiro conduite de fornecimento (19).

[0091] O citômetro de fluxo (3) compreende ainda meios de medição configurados para medir os parâmetros de citometria das células biológicas a serem analisadas e, em particular, para medir as propriedades ópticas e elétricas das células biológicas a serem analisadas.

[0092] De acordo com a forma de realização representada nas Figuras 1 a 7, os meios de medição incluem um dispositivo de emissão (22),

disposto de modo a emitir um feixe de luz incidente na direção da câmara de medição (7) e capaz de cruzar, isto é, intersectar, o fluxo de células biológicas (F) introduzidas na câmara de medição (7) e vários dispositivos de coleta (23a, 23b, 23c) deslocados angularmente em relação ao fluxo das células biológicas (F) e dispostos para coletar feixes de luz originários das células biológicas que passam através da câmara de medição (7). No entanto, os meios de medição podem por exemplo incluir vários dispositivos de emissão angularmente deslocados em relação ao fluxo de células biológicas, e também um único ou vários dispositivo(s) de coleta.

[0093] Os dispositivos de emissão e de coleta são montados nas faces externas superior e inferior do suporte (4) e se estendem em um plano substancialmente perpendicular ao fluxo de direção do fluxo de células biológicas (F). O dispositivo de coleta (23a) está por exemplo disposto em oposição ao dispositivo de emissão (22) em relação à célula de medição (6), enquanto os dispositivos de coleta (23b e 23c) estão dispostos perpendicularmente ao dispositivo de emissão (22) em relação à célula de medição (6). No entanto, de acordo com uma variante da invenção, o dispositivo de emissão (22) e o dispositivo de coleta (23a) podem ser montados nas faces externas laterais do suporte (4).

[0094] O dispositivo de emissão (22) compreende uma fonte de luz (24) disposta para gerar o feixe de luz incidente. A fonte de luz (24) pode, por exemplo, ser uma fonte de laser disposta para gerar um feixe de laser.

[0095] De acordo com a forma de realização representada nas Figuras 1 a 7 e como se segue mais particularmente da Figura 1, o dispositivo de coleta (23a) compreende uma pluralidade de elementos ópticos de coleta e, mais particularmente, uma fibra óptica de coleção central (25a) e uma ou várias fibra(s) óptica(s) de coleta periférica (25b). Por exemplo, a fibra óptica de coleta central (25a) destina-se a coletar os feixes de luz da câmara de medição (7) ao longo do caminho óptico do feixe de luz incidente, ou seja, a 0°, e as fibras ópticas de coleta periférica (25b) são algumas destinadas a coletar os feixes de luz da câmara de medição (7) a um ângulo na faixa de 4° e outras para coletar os feixes de luz a partir da câmara de medição (7) com um ângulo na faixa de 9°. O dispositivo de coleta (23a) pode, no entanto, incluir uma única fibra óptica de coleta periférica (25b).

[0096] O dispositivo de coleta (23b) pode, por exemplo, compreender um elemento óptico de coleta único, como uma fibra óptica de coleta central, e o dispositivo de coleta (23c) pode, por exemplo, também compreender um elemento óptico de coleta único, como uma fibra óptica de coleta central.

[0097] Os meios de medição incluem ainda uma pluralidade de elementos de detecção (não representados nas figuras), cada um associado a um respectivo dispositivo de coleta (23a-23c). Cada elemento de detecção está disposto para emitir um sinal de medição determinado dependendo dos feixes de luz coletados pelo respectivo dispositivo de coleta. Quando cada célula biológica passa através do feixe de luz incidente, cada sinal de medição emitido por cada elemento de detecção é, por exemplo, proporcional à quantidade de luz absorvida ou reemitida pela referida célula biológica. Cada elemento de detecção pode, por exemplo, ser um fotodetector, como um fotodiodo ou também um fotomultiplicador.

[0098] Os meios de medição mais vantajosamente compreendem um dispositivo de medição de variação de impedância eléctrica disposto para medir a variação na impedância eléctrica gerada pela passagem de células biológicas a através do orifício de injeção (13). A dispositivo de medição de variação de impedância eléctrica compreende, por exemplo, primeiro e segundo eléctrodos (não representados nas figuras) dispostos respectivamente em ambos os lados da injeção do orifício (13). O primeiro e o segundo eletrodos devem estar em contato elétrico com o fluxo das células biológicas (F), de modo a estabelecer um campo elétrico através do orifício de injeção (13). De acordo com uma variante do dispositivo de medição de variação de impedância elétrica, este último pode compreender um único eletrodo disposto pelo menos parcialmente na câmara interna (17) e o potencial da câmara interna (12) pode ser aterrado, de modo que o dispositivo de medição de variação de impedância elétrica seja configurado para medir uma variação de impedância eléctrica entre a câmara interna (12) e o eletrodo colocado na câmara interna (17).

[0099] Tal dispositivo de medição de variação de impedância eléctrica permite contar o número de células biológicas que passam através do orifício de injeção (13), e também a determinação do tamanho, e mais especificamente do volume das células biológicas. A operação de tal dispositivo de medição de variação de impedância elétrica é conhecida dos técnicos no assunto e, portanto, não é descrita em detalhes. No entanto, deve-se notar que a passagem de cada célula biológica através do orifício de injeção (13) causa um pulso elétrico proporcional ao tamanho ou volume da referida célula biológica.

[00100] Como mostrado na Figura 8, o aparelho de análise (2) compreende ainda uma unidade de processamento (32) configurada para analisar os parâmetros de citometria medidos pelos meios de medição do citômetro de fluxo (3) e, em particular, para analisar os sinais de medição fornecidos por cada elemento de detecção. A unidade de processamento (32) é mais particularmente configurada para diferenciar e identificar as células biológicas de uma amostra biológica a ser analisada e, em particular, para determinar a estrutura e a forma das células biológicas a partir dos parâmetros de citometria medidos pelos meios de medição. A unidade de processamento (32) inclui mais particularmente pelo menos um cartão de processamento eletrônico equipado com um microprocessador.

[00101] Como ilustrado na Figura 8, o dispositivo de análise (2) pode compreender dois citômetros de fluxo (3) e também um módulo de carregamento (33) disposto para deslocar pelo menos um rack em uma primeira direção do deslocamento (D1), um módulo de descarga (34) disposto para deslocar pelo menos um rack em uma segunda direção de deslocamento (D2), um módulo de agitação (não visível na Figura 8) disposto para deslocar pelo menos um rack entre o módulo de carregamento e o módulo de descarregamento, o módulo de agitação e os módulos de carregamento e descarregamento definem um caminho de transporte do rack geralmente em forma de U. Vantajosamente, o aparelho de análise (2) também inclui um módulo de amostragem (36) disposto para coletar amostras de líquido biológico em recipientes recebidos em um rack posicionado no módulo de agitação.

[00102] O aparelho de análise (2) também pode compreender: - um rotor de carga (37) disposto entre os módulos de carga e descarga e com um eixo de rotação substancialmente vertical, o rotor de carga (37) compreendendo uma pluralidade de invólucros (38) capazes de receber recipientes contendo amostras de fluido biológico a serem analisados ou produtos de reação e, em particular capaz de receber cartuchos para realizar, portanto, testes imunohematológicos configuráveis, mas também imunológicos em sangue total, sendo o módulo de coleta (36) disposto para colher amostras ou produtos de reação dos recipientes recebidos no rotor de carregamento (37), - meios de acionamento de rotação associados para o carregamento de rotor (37) e dispostos de modo a acionar a rotação do rotor de carregamento (37) em torno do eixo de rotação do mesmo, - um rotor de preparação (39) com um eixo de rotação substancialmente vertical, o rotor de preparação (39) compreendendo uma pluralidade de cubetas de preparação (41), o módulo de amostragem (36) sendo disposto para fornecer as cubetas de preparação (41) com amostras de fluido biológico ou com produtos de reação que são previamente coletados, e - meios de acionamento rotacional associados ao rotor de preparação (39) e dispostos para acionar em rotação o rotor de preparação (39) em torno do eixo de rotação do mesmo.

[00103] A presença de cartuchos no rotor de carregamento (37) permite a adição de reagentes adicionais de preparação, e, por conseguinte, adicionar, às medições de parâmetros de citometria de natureza física ou morfológica, medições de parâmetros de citometria de uma natureza imuno- hematológica.

[00104] Além disso, o aparelho de análise (2) pode ser fornecida, no rotor de preparação (39), com um dispositivo magnético que permite capturar partículas magnéticas em soluções. Estas partículas magnéticas são cobertas com anticorpos permitindo capturar seletivamente certo tipo de células, por exemplo todos os leucócitos. Assim, após a ressuspensão em um diluente isotônico, a amostra biológica preparada contém apenas leucócitos sem ter que usar a lise para destruir os glóbulos vermelhos que são mil vezes numerosos. Portanto, os leucócitos estão intactos e é possível então adaptar as taxas de diluição para poder realizar as medições dos N parâmetros de citometria em um número significativo de células, com a possibilidade de identificar poucas ou raras células. Além disso, os leucócitos também podem ser marcados seletivamente para uma identificação imunológica convencional (por exemplo, linfócitos T).

[00105] Um método para analisar uma amostra biológica contendo células biológicas usando um citômetro de fluxo (2) de acordo com a presente invenção será agora descrito.

[00106] Esse processo de análise compreende as seguintes etapas:

- preparação da amostra biológica a ser analisada, a etapa de preparação compreendendo, por exemplo, uma etapa de diluição da amostra biológica a ser analisada, por exemplo, utilizando um diluente isotônico e/ ou uma etapa de lise seletiva de pelo menos algumas das células biológicas contidas na amostra biológica a ser analisada, como eritrócitos, e/ ou uma etapa de marcação de pelo menos algumas das células biológicas contidas na amostra biológica a ser analisada com um fluorocromo,

- passagem das células biológicas contidas na amostra biológica a ser analisada pela câmara de medição (7) do citômetro de fluxo (3),

- medição de N parâmetros de citometria para cada célula biológica contida na amostra biológica a ser analisada, tais como parâmetros de citometria representativos da morfologia e/ ou estrutura das células biológicas da amostra biológica a ser analisada, utilizando o citômetro de fluxo (3),

- determinação, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de um ponto em um espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para a referida célula biológica da amostra biológica a ser analisada, cada eixo de coordenadas do espaço N-dimensional correspondente a um respectivo parâmetro de citometria medido ou a um valor calculado a partir do referido parâmetro de citometria medido,

- agrupamento automático dos pontos relacionados com a amostra biológica a ser analisada em diferentes agrupamentos de células,

dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostra, o arquivo de agrupamento de amostra estando por exemplo, no formato FCS (Padrão de Citometria de Fluxo), - a identificação automática das populações de células definidas pelos diferentes agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - contagem automática dos pontos de cada grupo de células do arquivo de agrupamento de amostras, - comparação do arquivo de agrupamento de amostras com os arquivos de agrupamento de referência, cada um dos arquivos de agrupamento de referência sendo definido a partir de parâmetros de citometria de uma amostra biológica patológica ou anormal, - emissão de uma mensagem de alarme quando o arquivo de agrupamento de amostras é pelo menos parcialmente idêntico ou semelhante a um arquivo de agrupamento de referência e, em particular, quando os agrupamentos de células pré-determinados do arquivo de agrupamento de amostras são idênticos ou semelhantes aos agrupamentos de células pré- determinados do arquivo de agrupamento de referência, a mensagem de alarme emitida contendo vantajosamente indicações relacionadas a uma patologia ou anormalidade associada ao arquivo de agrupamento de referência ao qual o arquivo de agrupamento de amostras é pelo menos parcialmente idêntico ou semelhante, as etapas de determinação, agrupamento, comparação e missão sendo executadas pela unidade de processamento (32).

[00107] Um tal etapa de agrupamento automático pode ser realizada de diferentes maneiras conhecidas dos técnicos no assunto e, portanto, não é descrito em detalhes na presente descrição.

[00108] De acordo com uma forma de realização da invenção, o método de análise compreende uma etapa de amostragem e digitalização de um conjunto de sinais analógicos gerados durante a duração da etapa de medição, de modo a definir um primeiro arquivo de dados brutos digitalizados para cada um dos N canais de medição, e uma etapa de sincronização e agrupamento do N sinais digitalizados para cada célula biológica da amostra a ser analisada por um primeiro nível de processamento por computador. A referida etapa de amostragem e digitalização é realizada pela unidade de processamento (32), que transmite os arquivos pelo link Ethernet para uma unidade de computador do tipo PC (não representada na Figura 8) que os analisa.

[00109] De acordo com uma forma de realização do método de análise, este último compreende ainda uma etapa de análise do arquivo de agrupamento de amostras, de modo a detectar pelo menos uma anomalia possível no arquivo de agrupamento de amostras, a etapa de análise sendo realizada pela unidade de processamento (32). De forma vantajosa, a etapa de comparação é realizada apenas quando pelo menos uma anomalia é detectada durante a etapa de análise e a mensagem de alarme emitida durante a etapa de transmissão também contém informações relacionadas à pelo menos uma anomalia detectada. Estas disposições permitem, por um lado uma, evitar a realização da etapa de comparação, se a amostra biológica a ser analisada for normal e não patológica, e, por conseguinte, reduzindo o tempo de execução de cálculos e fornecendo mais rapidamente os resultados da análise para o operador e, por outro lado, comunicar ao operador uma mensagem de alarme o mais detalhada possível quando a amostra biológica a ser analisada for patológica ou anormal.

[00110] A etapa de análise compreende vantajosamente as seguintes etapas: - análise, para cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostra, de pelo menos um parâmetro morfológico do referido grupo de células, tal como o posicionamento do referido agrupamento de células, da distribuição dos pontos do referido agrupamento de células, do número de pontos do referido agrupamento de células e/ ou da presença ou ausência do referido agrupamento de células, - detecção de uma anomalia se pelo menos um parâmetro morfológico de pelo menos um agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras exceder um respectivo valor limiar predeterminado.

[00111] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende mais particularmente as seguintes etapas: - comparação, para cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, do número de pontos agrupados no referido agrupamento de células com pelo menos um respectivo valor limiar predeterminado, - análise da distribuição dos pontos em cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostra, - análise do posicionamento dos agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - análise da presença e/ ou ausência de pelo menos certos agrupamentos de células predeterminados, - detecção de uma anomalia se a distribuição dos pontos em pelo menos um dos agrupamentos de células não é Gaussiana, - detecção de uma anomalia se pelo menos dois agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras são pelo menos parcialmente confusos, - detecção de uma anomalia se for detectada a presença ou ausência de pelo menos um agrupamento de células predeterminado, - detecção de uma anomalia se o número de agrupamentos de células for maior ou menor que um valor de referência predeterminado, - detecção de uma anomalia se o número de pontos agrupados em pelo menos um dos agrupamentos de células for inferior e/ ou superior a um respectivo valor limiar predeterminado.

[00112] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de análise compreende uma etapa de comparação do arquivo de agrupamento de amostras com arquivos de agrupamento normais, cada um dos arquivos de agrupamento normais sendo definidos a partir de parâmetros de citometria de uma respectiva amostra biológica normal. Estas disposições permitem, em especial facilitar a detecção de uma anomalia no arquivo de agrupamento de amostras.

[00113] De acordo com uma forma de realização da invenção, a etapa de medição dos parâmetros de citometria inclui as seguintes etapas: - emissão, utilizando o dispositivo de emissão (22), de um feixe de luz incidente em direção às células biológicas que atravessam a câmara de medição (7), de modo que o feixe de luz incidente atravesse o caminho das células biológicas, - detecção, usando dispositivos de coleta (23a-23c), de diferentes feixes de luz de cada célula biológica que passa através da câmara de medição (7).

[00114] Dada a configuração e a disposição dos diferentes dispositivos de coleta (23a-23c), a etapa de medição dos parâmetros de citometria compreende, em particular, as seguintes etapas: - medição da intensidade dos feixes de luz dispersos em pequenos ângulos por cada célula biológica utilizando as fibras ópticas de coleta (25b, 25c) do dispositivo de coleta (23a), - medição da intensidade de um feixe de luz espalhado ao longo do caminho óptico do feixe de luz incidente por cada célula biológica, utilizando a fibra óptica de coleta central (25a) do dispositivo de coleta (23a), - medição da intensidade de um feixe de luz espalhado a 90° por cada célula biológica, utilizando o dispositivo de coleta (23b), e - medição da intensidade de um feixe de fluorescência emitido a 90° por cada célula biológica, utilizando o dispositivo de coleta (23c).

[00115] Com vantagem, uma etapa de medir parâmetros de citometria compreende ainda uma etapa de medir a variação na impedância eléctrica produzida pela passagem das células biológicas através da câmara de medição (7), utilizando o dispositivo de medição de variação de impedância eléctrica.

[00116] Vantajosamente, o método de análise compreende as seguintes etapas iniciais: - medir os parâmetros de citometria para cada célula biológica contida em uma amostra biológica de referência, utilizando o citômetro de fluxo (3), - determinar, para cada célula biológica da amostra biológica de referência, um ponto no espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica de referência, cada eixo de coordenadas do espaço N-dimensional correspondente a um respectivo parâmetro de citometria medido, - agrupamento automático dos pontos que se relacionam à amostra biológica de referência em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica de referência, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostra, cada arquivo de agrupamento de amostra sendo, por exemplo, em o formato de FCS (Padrão de citometria de fluxo), as etapas de determinação e de agrupamento sendo realizadas pela unidade de processamento (32), - repetir as referidas etapas iniciais de medição, determinação e agrupamento para uma pluralidade de amostras biológicas de referência, de modo a definir uma pluralidade de arquivos de agrupamentos de referência.

[00117] Evidentemente, a invenção não se limita à única forma de realização do citômetro de fluxo e às únicas formas de realização do método de análise, descritas acima por meio de exemplos, ela abrange, pelo contrário, todas as suas variantes.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO DE ANÁLISE PARA ANALISAR UMA AMOSTRA BIOLÓGICA CONTENDO CÉLULAS BIOLÓGICAS, incluindo células sanguíneas, caracterizado pelo método de análise compreender as seguintes etapas: - passagem das células biológicas da amostra biológica a ser analisada em uma célula de medição de um citômetro de fluxo, - medição de N parâmetros de citometria para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, - determinação, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de um ponto no espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para a célula biológica correspondente, em que N é um número inteiro maior ou igual a 3, - agrupamento automático dos pontos determinados em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos, de forma a definir um arquivo de agrupamento de amostras, - identificação das populações de células definidas pelos diferentes agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - contagem dos pontos de cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, - comparação do arquivo de agrupamento de amostras com os arquivos de agrupamento de referência, cada um dos arquivos de agrupamento de referência sendo definido a partir dos parâmetros de citometria de uma respectiva amostra biológica patológica ou anormal.

2. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda uma etapa de emitir uma mensagem de alarme quando o arquivo de agrupamento de amostras é pelo menos parcialmente idêntico ou semelhante a um arquivo de agrupamento de referência.

3. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela mensagem de alarme emitida conter indicações relacionadas a uma patologia ou uma anormalidade associada ao arquivo de agrupamento de referência ao qual o arquivo de agrupamento de amostras é pelo menos parcialmente idêntico ou semelhante.

4. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender ainda uma etapa de análise do arquivo de agrupamento de amostras, de modo a detectar pelo menos uma anomalia possível no arquivo de agrupamento de amostras.

5. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela etapa de comparação ser realizada apenas quando pelo menos uma anomalia é detectada durante a etapa de análise.

6. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pela etapa de análise compreender as seguintes etapas: - análise, para cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, de pelo menos um parâmetro morfológico do referido agrupamento de células, - detecção de uma anomalia se pelo menos um parâmetro morfológico de pelo menos um agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras exceder um respectivo valor limiar predeterminado.

7. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pela etapa de análise compreender as seguintes etapas: - comparação, para cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, do número de pontos agrupados no referido agrupamento de células com pelo menos um respectivo valor limiar predeterminado, - detecção de uma anomalia se o número de pontos agrupados em pelo menos um dos agrupamentos de células for menor e/ ou maior que o pelo menos um respectivo valor limiar predeterminado.

8. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pela etapa de análise compreender as seguintes etapas: - análise da distribuição dos pontos em cada agrupamento de células do arquivo de agrupamento de amostras, - detecção de uma anomalia se a distribuição dos pontos em pelo menos um dos agrupamentos de células não for Gaussiana.

9. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pela etapa de análise compreender as seguintes etapas: - análise do posicionamento dos agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - detecção de uma anomalia se pelo menos dois agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras estiverem pelo menos parcialmente confusos.

10. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pela etapa de análise compreender as seguintes etapas: - análise dos agrupamentos de células do arquivo de agrupamento de amostras, - detecção de uma anomalia se for detectada a presença ou ausência de pelo menos um agrupamento de células predeterminado.

11. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela etapa de medição dos parâmetros de citometria compreender pelo menos uma etapa da medição dos parâmetros de citometria representativos da morfologia e/ ou da estrutura das células biológicas da amostra biológica a ser analisada.

12. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela etapa de medição dos parâmetros de citometria compreender pelo menos uma etapa de medição, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de pelo menos uma propriedade óptica da referida célula biológica.

13. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela etapa de medição dos parâmetros de citometria compreender: - uma etapa de medição da intensidade de um feixe de luz espalhado em pequenos ângulos por cada célula biológica, e/ ou - uma etapa de medição da intensidade de um feixe de luz espalhado a 90° por cada célula biológica e/ ou - uma etapa de medição da intensidade de um feixe de luz espalhado ao longo de um caminho óptico do feixe de luz incidente por cada célula biológica.

14. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizado pela etapa de medição dos parâmetros de citometria compreender uma etapa de medição da intensidade de pelo menos um feixe de fluorescência emitido por cada célula biológica, por exemplo, a 90°.

15. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela etapa de medição dos parâmetros de citometria incluir as seguintes etapas: - emissão de um feixe de luz incidente em direção às células biológicas que passam através da câmara de medição, de modo que o feixe de luz incidente atravesse o caminho das células biológicas,

- detecção de pelo menos um feixe de luz de cada célula biológica que passa pela câmara de medição.

16. MÉTODO DE ANÁLISE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender ainda as seguintes etapas: - passagem das células biológicas de uma amostra biológica de referência por uma célula de medição de um citômetro de fluxo, - medição de N parâmetros de citometria para cada célula biológica da amostra biológica de referência, - determinação, para cada célula biológica da amostra biológica de referência, de um ponto em um espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para a referida célula biológica da amostra biológica de referência, em que N é um número inteiro maior que ou igual a 3, - agrupamento automático dos pontos determinados relacionados com a amostra biológica de referência em diferentes agrupamentos de células, dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica de referência, de modo a definir um arquivo de agrupamento de referência, - repetir as referidas etapas de passagem, medição, determinação e agrupamento para uma pluralidade de amostras biológicas de referência, de modo a definir uma pluralidade de arquivos de agrupamento de referência.

17. APARELHO DE ANÁLISE, caracterizado por compreender: - um citômetro de fluxo compreendendo uma célula de medição destinada à passagem de células biológicas de uma amostra biológica a ser analisada e meios de medição configurados para medir parâmetros de citometria das células biológicas da amostra biológica a ser analisada, e - uma unidade de processamento (32) configurada para: - determinar, para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, um ponto em um espaço N-dimensional cujas coordenadas são definidas dependendo dos parâmetros de citometria medidos para a célula biológica correspondente, em que N é um número inteiro maior ou igual a 3,

- agrupar os pontos em diferentes agrupamentos de células,

dependendo dos parâmetros de citometria medidos para cada célula biológica da amostra biológica a ser analisada, de modo a definir um arquivo de agrupamento de amostras,

- comparar o arquivo de agrupamento de amostras com os arquivos de agrupamento de referência, cada um dos arquivos de agrupamento de referência sendo definido a partir dos parâmetros de citometria de uma respectiva amostra biológica patológica ou anormal.