KR20200126405A - 생물학적 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 분석하는 방법 및 그 분석 방법을 실현하기 위한 분석 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 분석하는 방법 및 분석 방법을 구현하기 위한 분석 장치에 관한 것이다. 분석 방법은 생물학적 샘플에 포함되는 각각의 생물학적 세포에 대한 세포측정 파라미터를 측정하는 단계; 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 대응하는 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터의 함수로서 좌표가 규정되는 N 차원을 갖는 공간 내의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N은 3 이상의 정수인, 결정 단계; 샘플 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 세포의 상이한 클러스터의 지점들을 측정된 세포측정 파라미터의 함수로서 함께 자동으로 그룹화하는 단계; 및 샘플 클러스터 파일을 참조 클러스터 파일과 비교하는 단계로서, 참조 클러스터 파일 각각은 각각의 병리적인 또는 비정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파라미터에 기초하여 규정되는, 비교 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 생물학적 세포, 특히 혈액 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 분석하는 방법, 및 이러한 분석 방법의 실현을 위해 구성된 분석 장치에 관한 것이다.
혈액에서 순환하는 세포는, 적혈 세포 또는 적혈구(통상적인 혈액에 대해 약 5백만/mm3)와 혈소판(약 300,000/mm3)인 무핵 세포를 포함하며, 백혈구(약 10,000/mm3)인 유핵 세포를 포함한다. 혈액은 미성숙 적혈 세포 또는 다른 더 희귀한 세포인 적아구 같은 다른 유핵 세포를 포함할 수 있다. 각각의 세포 유형은 개체군이라고도 지칭되는 것을 구성한다.
다른 생물학적 유체는 뇌척수액 또는 소변 같은 혈액 세포를 포함한다. 이어서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플로 한정되지 않고 혈액 세포를 포함하는 모든 생물학적 유체를 포함한다.
유세포측정(flow cytometry)을 사용하거나 사용하지 않는 종래의 혈액학 분석기는 세포 유형에 의해 양적 비정상이 검출될 때 완전 혈액 계수(Complete Blood Count)를 실행하고 질적 정보를 전달하도록 의도된다.
면역혈액학에 특화된 세포측정 장비(cytometry equipment)는, 더 정교한 기술 및 특정 시약의 구현에 의해, 모든 세포 유형에 작용할 수 있는 혈액 병리학을 목표로 한다.
유세포측정은 적어도 하나의 유체역학적 집중을 실행하는 단계 및 어떻게 구현되는지에 따라 각각의 세포에 대한 소정 수의 물리적 측정치를 생성하는 측정 장치를 통해 혈액 세포를 하나씩 통과시키는 단계를 포함한다는 것을 상기한다. 측정이 명확하게 이루어지도록, 세포는 측정 및 그들의 취득을 허용하는 속도로 분리되고 스크롤(scroll)되어야 한다. 또한, 각각의 개체군의 적절한 통계적인 평가를 허용하는 충분한 계수(count)가 있어야 한다. 이를 위해, 혈액 샘플은 순수하게 분석되지 않고 희석된다. 또한, 백혈구보다 수천 배 많은 적혈 세포를 고려하면, 백혈구 개체군을 통계적으로 나타내는 분석을 실행하기 위해서, 샘플은 세포측정기를 수분의 시간 동안 통과해야 한다. 다른 해결책은, 세포측정기에서 샘플이 통과하는 시간을 10배로 감소시키기 위해서, 샘플의 희석 이외에, 백혈구가 충분히 농축된 샘플을 얻음으로써 이들 개체군에 대한 통계적으로 정확한 계수를 얻기 위해서 적혈 세포를 선택적으로 파괴하는 용해(lysis)를 실행하는 단계를 포함한다.
다음의 2가지 유형의 생성된 유세포측정 파라미터가 있다:
-
이하의 물리적 또는 형태학적 성질 중 어느 것: 임피던스(코울터 효과(Coulter effect))에 의한 세포의 부피의 측정, 광학적 흡수, 각각의 세포가 레이저 빔을 통과하는 것에 의해 발생되는 상이한 각도의 회절의 측정, 및 하나 이상의 형광색소를 세포가 존재하는 곳으로 미리 이동시킴으로써 형광성이 된 핵산의 형광의 측정. 이들 데이터는 세포의 부피, 세포의 표면 및 세포의 함량에 의존하는 세포의 광학적 흡수, 세포의 내부 복잡성, 세포의 표면의 성질, 세포의 조성 및 유핵 세포에 대한 세포의 핵 활동성에 의해 각각의 세포를 특징짓는 것을 허용한다;
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이하의 면역학적 성질(면역혈액학) 중 어느 것: 샘플은 형광색소에 접합되며 소정의 세포의 표면에 나타나는 수용체에 대해 특이적인 항체를 포함하는 시약의 존재 하에 배치된다. 하나 또는 여러 개의 레이저 빔(들)에 세포를 통과시키는 것은 세포 표면의 마커에 비례하는 신호를 생성하므로 세포를 특징짓는 것을 허용한다.
생물학적 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 분석하는 방법은, 공지된 방식에서,
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분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 유세포측정기 측정 셀 내로 통과시키는 통과 단계와,
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분석될 생물학적 샘플에 포함되는 각각의 생물학적 세포에 대해, 형태학적 또는 면역학적 세포측정과 같은, N개의 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계와,
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분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해서, 대응하는 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간 내의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N은 2 이상의 정수인, 결정 단계와,
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기능이 완전 혈액 계수로 한정된 장비에 대해서, 샘플 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 측정된 세포측정 파라미터에 따라 지점들을 상이한 세포 클러스터들로 클러스터화하는 단계로서, 클러스터화 단계는 자동 구역설정 방법, 통계적 방법 또는 그 밖의 점밀도 방법을 사용하여 실행되는, 클러스터화 단계와,
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혈액 면역학적 측정을 수행하는 더 정교한 장비에 대해서,
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정상적인 샘플에 비교되는 샘플 클러스터 파일에서 하나 또는 여러 개의 비정상(비정상들)을 조작자가 식별하는 식별 단계를 포함한다.
예를 들어, 수치 임계치를 넘어감으로써 식별되는 비정상(비정상적으로 낮거나 비정상적으로 높은 수의 세포 유형)으로부터, 그리고 의학 세포측정에서의 그의 경험으로부터, 조작자는 생물학적 샘플이 분석된 환자의 병리 및 연관된 치료를 직접 결정하거나, 또는 생물학적 샘플이 분석된 환자의 가능한 병리에 관한 예후를 발행하고 그의 예후를 확인하기 위해서 보충적인 혈액 테스트를 고려할 수 있다.
그러나, 클러스터화 단계, 분석 단계 및 식별 단계는 상당히 주관적이고 세포측정에 있어서의 조작자의 경험에 강하게 의존하며, 따라서 조작자에 의해 환자에 대해서 언급된 진단 또는 예후는 조작자의 자질 및 경험에 의존한다. 그러나, 이들 단계는 힘들고 시간 소모적이다. 이들 장비의 처리 속도는 혈액학 계수기의 처리 속도에 비해 낮다.
또한, 매우 특이적인 방식으로 세포를 특징짓기 위해 항체를 사용하는 면역혈액학에 있어서의 세포측정은 고가의 제품을 사용하므로 세포측정을 일상적인 방법으로 확립하는 것을 어렵게 만든다.
마지막으로, 공통적인 특징을 갖는 세포를 클러스터화하는 것을 목적으로 하는 이러한 유형의 분석은 개체군의 유형에 의해 그 비정상을 정성화하기 위해 개체군을 열거하고 정성화하도록 의도된다. 따라서, 이러한 유형의 분석은 환자의 샘플의 전체 사진 같은 전체 데이터에 관심을 두지 않는다.
본 발명은 이러한 단점을 극복하고, 유세포측정기에 의해 수집된 데이터를 사용하여 생물학적 세포를 특징짓고, 이들을 클러스터에 의해 자동으로 클러스터화하고, 클러스터의 개체군을 식별 및 정성화하며 뿐만 아니라 전체 데이터를 생물학적 샘플의 화상 표현으로서 고려하며, 또한 이러한 화상을 참조 화상에 대해서 처리함으로써 새로운 패러다임을 도입하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는, 특히, 획득된 결과의 재현성을 보장하면서, 이러한 처리가 고속 장치와 호환가능하고 조작자에게 어떠한 특별한 스킬 또는 시간을 요구하지 않는, 측정으로부터의 데이터의 처리를 최적화하는 생물학적 세포를 포함하는 생물학적 시료를 분석하는 방법을 제공하는 것을 포함한다.
이를 위해, 본 발명은 혈액 세포를 포함하는 생물학적 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 분석하는 방법에 관한 것이며, 분석 방법은,
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분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 유세포측정기 측정 셀 내로 통과시키는 통과 단계와,
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분석될 생물학적 샘플에 포함된 생물학적 세포의 N개의 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계,
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분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 대응하는 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간 내의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N은 3 이상의 정수인, 결정 단계와,
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샘플 클러스터 파일을 규정하기 위해, 결정된 지점들을 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 상이한 세포 클러스터들로 자동으로 클러스터화하는 단계로서, 샘플 클러스터 파일은 유리하게는 분석될 생물학적 샘플을 디지털적으로 설명하는 컴퓨터 파일이며 바람직하게는 표준에 따라 기입되는, 자동 클러스터화 단계,
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샘플 클러스터 파일의 상이한 세포 클러스터들에 의해 규정되는 세포 개체군을 식별하는 식별 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터의 지점들을 계수하는 계수 단계와,
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샘플 클러스터 파일을 참조 클러스터 파일과 비교하는 단계로서, 참조 클러스터 파일 각각은 각각의 병리적인 또는 비정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파리미터로부터 규정되는, 비교 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 분석 방법의 이러한 구성은, 분석될 생물학적 샘플을 디지털적으로 설명하는 샘플 클러스터 파일과 하나 이상의 참조 클러스터 파일(들) 사이의 가능한 유사성을 자동으로 식별할 수 있도록 하고, 따라서 비교 단계의 끝에서 (예를 들어, 복귀되는 측정에 추가되는 특정한 암시 또는 경고를 통해) 조작자에게 복귀되는 암시의 타당성을 향상시키고 따라서 가능한 가장 타당한 추천을 조작자에게 제공하여 진단을 촉진하는 것을 돕도록 한다. 특히, 본 발명에 따른 분석 방법은 실험실에서 결정에 소요되는 시간을 절약하고, 후속 조사의 범위를 지정하며, 필요한 경우 혈액학자를 간단하고, 저렴하며, 강건한 수단을 사용하여 현미경 분석 또는 면역측정 이전의 혈액 도말표본일 수 있는 보충적인 분석으로 더 빠르게 유도할 수 있도록 한다. 이것은 이러한 처리를 혈액 도말표본의 화상의 분석 대신에 사용하는 것의 문제가 아니라 디지털 혈액 계수기로부터 가능한 최대의 정보를 도출하고 재료나 시간에 있어서 추가적인 비용 없이 이것을 가능하게 하는 것이다.
본 발명에 따른 분석 방법은, 더 구체적으로는, 세포측정식 측정에 기초하여, 고려된 생물학적 샘플을 참조 생물학적 샘플에 대해 비교하는 형태학적 분석을 행하는 것, 더 상세하게는 분석된 생물학적 샘플로부터 수립되는 샘플 클러스터 파일을 임상적 데이터가 공지된 병리적인 또는 비정상적인 생물학적 샘플로부터 수립되는 참조 클러스터 파일에 대해 비교하는 형태학적 분석을 행하는 것을 포함한다.
따라서 본 발명에 따른 분석 방법은 병리가 알려진 샘플로부터 참조 파일을 획득하는 것에 기초한다. 이는 실제로는 임상 시험의 편집에 의해 실행되며, 새로운 비정상 또는 병리에 대응하는 새로운 참조 파일에 따라 진행될 수 있는 학습이다.
각각의 학습 버전은 각각의 기계에 특이적이지 않고, 준비(희석, 용해, 형광 라벨링)를 위해 동일한 조성의 시약으로 동작하는 동일한 유형의 모든 기계에 유효하며 적용된다.
혈액에서 순환하는 세포는 조혈에 의해, 내피 세포의 분리에 의해, 및 박테리아 또는 기생충, 예를 들어 변형체 등의 동족 작용물에 의한 검사에 의해 생성되는 것으로부터 기인한다. 골수에서 생성되는 조혈은, 한편으로는 백혈구, 즉 다핵성 또는 호중구, 호산구 및 호염기성 과립구, 단핵구 및 림프구, 및 다른 한편으로는 적혈구 및 혈소판이다. 각각의 유형의 세포는, 혈액에서 예를 들어, 여전히 세포핵이 제공되거나 또는 더 이상 세포핵을 갖지 않지만 여전히 리보솜 또는 미토콘드리아 활성을 갖는 적혈구인 적아구 같은 미성숙 세포를 유발할 수 있는 상이한 유형의 병리에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 측정된 세포측정 파라미터는 각각의 생물학적 세포의 부피, 광 흡수, 큰 각도의 회절, 및 작은 각도의 회절 같은 물리적 측정치이다.
분석 방법은 단독으로 또는 조합되어 취해지는 다음의 특징 중 하나 이상을 더 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석될 생물학적 세포는 혈액 세포, 더 구체적으로는 세포들을 보존하며 이들을 세포측정기에서 충분히 이격시킬 수 있고 최상의 조건하에서 각각의 세포측정 파라미터를 측정하기 위한 등장성 희석 또는 백혈 세포보다 대략 1천배 더 많은 수의 적혈 세포를 제거하는 선택적 용해 동작 중 어느 하나인 준비의 대상인 혈액 세포일 수 있으며, 이 용해 동작은 더 짧은 시간에 백혈구를 식별 및 계수할 수 있는 효과를 갖지만, 이는 또한 용해의 유형에 따라 관찰된 비용해 세포의 부피 및 광학적 응답의 변화를 초래한다.
사실, 본 발명의 바람직한 실시예는 2개의 세포측정기를 병용하며, 그 중 첫번째 것에서는 생물학적 샘플이 단지 희석되고, 두번째 것에서는 용해된 생물학적 샘플을 처리하는데, 더 구체적으로는 유핵 세포를 관찰한다. 이는 용해된 생물학적 샘플과 용해되지 않은 생물학적 샘플 모두에 대해 N>3 차원을 갖는 공간에서의 데이터의 수집을 허용한다. 이는 적혈구 및 혈소판인 무핵 세포가 동일한 유형의 알고리즘에 의해 유핵 세포로서 처리되는 것을 의미한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 클러스터화 단계는, 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대응하는 N개의 세포측정 파라미터에 의해 결정된 지점들을 특정 알고리즘에 따라 자동으로 처리함으로써 실행된다. 상이한 지점들은, 예를 들어 N 차원 공간에서의 이들 지점들의 통계학적 기준 또는 밀도 기준에 따라 상이한 클러스터들의 지점으로 클러스터화될 수 있어, 분석될 생물학적 샘플을 N 차원 공간에 위치된 클러스터로 그룹화된 각각의 세포를 나타내는 지점들에 의해 디지털적으로 설명하는 파일을 규정할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 분석 방법은 N개의 측정 채널 각각에 대해 디지털 오실로그램과 유사한 제1 로우 데이터 파일(first raw data file)을 규정하기 위해서 측정 단계의 기간 동안 생성된 아날로그 신호의 세트를 샘플링 및 디지털화하는 단계, 및 제1 레벨의 컴퓨터 처리에 의해 분석될 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 N개의 디지털화된 신호를 동기화 및 그룹화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 클러스터화 단계는 결정된 지점들을 통계적 방법을 사용하여 상이한 세포 클러스터들로 클러스터화하는 단계 또는 N 차원 공간 내의 세포를 나타내는 지점들의 공간적 밀도 분석에 의해 클러스터들의 분리를 허용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, N 차원 공간의 각각의 좌표축은 각각의 세포측정 파라미터에 대응한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, N은 4 이상의 정수이며 예를 들어 5와 동일할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 샘플 클러스터 파일은 FCS(Flow Cytometry Standard) 형식에 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은 샘플 클러스터 파일이 참조 클러스터 파일과 적어도 부분적으로 동일하거나 유사한 경우, 예를 들어 샘플 클러스터 파일의 미리결정된 세포 클러스터가 참조 클러스터 파일의 미리결정된 세포 클러스터와 동일하거나 유사한 경우 경고 메시지를 발행하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 발행된 경고 메시지는, 샘플 클러스터 파일이 적어도 부분적으로 동일하거나 유사한 참조 클러스터 파일에 연관된 병리 또는 비정상성에 관한 암시를 포함한다. 이러한 구성은, 분석된 생물학적 샘플에 연관된 병리의 가능성을 조작자에게 통신하는 것을 허용하지만, 어떤 경우에도 분석된 생물학적 샘플이 취해진 환자에 영향을 줄 수 있는 병리의 진단을 조성하지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은 샘플 클러스터 파일에서 적어도 하나의 가능한 비정상을 검출하기 위해서 샘플 클러스터 파일을 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 비교 단계는 분석 단계 동안 적어도 하나의 비정상이 검출되는 경우에만 실행된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계 동안 적어도 하나의 비정상이 검출되는 경우, 발행 단계 동안 발행된 경고 메시지는 또한 적어도 하나의 검출된 비정상에 관한 정보를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는, 샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에 대해서, 상기 세포 클러스터의 적어도 하나의 형태학적 파라미터를 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터의 적어도 하나의 형태학적 파라미터는 상기 세포 클러스터의 포지셔닝(positioning), 상기 세포 클러스터의 지점들의 분포, 상기 세포 클러스터의 지점들의 수, 및/또는 상기 세포 클러스터의 존재 또는 비존재를 포함할 수 있다. 따라서, 상이한 세포 클러스터들 사이의 비정상적인 상대 포시셔닝 또는 그 밖에 비정상적인 세포 개체군에 관한 비정상적인 계수의 세포 클러스터의 검출은 샘플 클러스터 파일에서의 비정상의 검출을 허용한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는, 샘플 클러스터 파일의 적어도 하나의 세포 클러스터의 적어도 하나의 형태학적 파라미터가 각각의 미리결정된 임계값을 초과하는 경우에 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에 대해서, 상기 세포 클러스터에서 클러스터화된 지점의 수를 적어도 하나의 각각의 미리결정된 임계값과 비교하는 단계와,
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세포 클러스터 중 적어도 하나에서 클러스터화된 지점들의 수가 적어도 하나의 각각의 미리결정된 임계값보다 작거나 및/또는 큰 경우에 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에 대해, 상기 세포 클러스터에서 클러스터화된 지점들의 수를 각각의 미리결정된 하위 임계값 또는 각각의 미리결정된 상위 임계값과 비교하는 단계와,
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세포 클러스터 중 적어도 하나에서 클러스터화된 지점들의 수가 각각의 미리결정된 하위 임계값보다 적거나 또는 각각의 미리결정된 상위 임계값보다 많은 경우에, 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에서의 지점들의 분포를 분석하는 단계와,
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세포 클러스터 중 적어도 하나에서의 지점들의 분포가 가우시안(Gaussian)이 아닌 경우 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는,
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샘플 클러스터 파일의 세포 클러스터의 포지셔닝을 분석하는 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 적어도 2개의 세포 클러스터가 적어도 부분적으로 혼동되는 경우 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는,
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샘플 클러스터 파일의 세포 클러스터를 분석하는 단계와,
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적어도 하나의 미리결정된 세포 클러스터의 존재 또는 비존재가 검출되는 경우 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는,
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샘플 클러스터 파일을 분석하는 단계와,
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세포 클러스터의 수가 미리결정된 참조값보다 높거나 낮은 경우 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는 비정상적인 또는 비정형적인, 즉 정상적인 세포 클러스터 외측에 위치되는 세포 클러스터를 검색하는 단계로서, 비정상적인 또는 비정형적인 세포 클러스터는 예를 들어 미성숙 세포 또는 기생충에 대응할 수 있는, 검색 단계를 포함한다. 분석 방법은 이들 비정상적인 또는 비정형적인 세포 클러스터를 참조 파일과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는 분석될 생물학적 샘플의 형태 및/또는 구조를 나타내는 세포측정 파라미터를 측정하는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는, 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해서, 상기 생물학적 세포의 적어도 광학적 특성을 측정하는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는, 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해서, 상기 생물학적 세포의 적어도 하나의 전기적 및/또는 전자기적 특성을 측정하는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 의해 흡수되거나 또는 재방출된 광의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는,
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각각의 생물학적 세포에 의해 작은 각도로 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계, 및/또는
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각각의 생물학적 세포에 의해 90°로 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계, 및/또는
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각각의 생물학적 세포에 의해 입사 광 빔의 광학 경로를 따라 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계를 포함한다.
각각의 생물학적 세포에 의해 산란되는 광은 상기 생물학적 세포의 형태 및 구조에 대한 정보를 제공한다. 특히, 각각의 생물학적 세포에 의해 작은 각도, 예를 들어 15° 미만의 각도, 유리하게는 4° 및/또는 9°와 동일한 각도로 산란되는 광 빔의 강도는 상기 생물학적 세포의 크기에 실질적으로 비례하는 한편, 각각의 생물학적 세포에 의해 90°로 산란되는 광 빔의 강도는 상기 생물학적 세포의 형상, 내부 구조 및 과립상태에 비례한다. 또한, 각각의 생물학적 세포에 의한 입사 광 빔의 광학축에서의 광 빔의 강도는 상기 생물학적 세포의 크기 및 생존력에 비례한다. 입사 광 빔의 광학 경로를 따른 이러한 확산의 측정은 각각의 생물학적 세포의 광 흡수의 강도의 측정에 대응한다.
따라서, 이들 2개 또는 3개의 전술한 파라미터(상이한 각도에서의 임피던스 측정, 광학 흡수 측정, 확산 측정)의 동시 사용은, 생물학적 샘플, 예를 들어 혈소판, 적혈구, 림프구, 단핵구 및 다핵형 백혈구의 상이한 개체군에 있어서의 구별을 허용한다.
아래에서 알려지는 각도값은 입사 광 빔의 광학 경로에 대한 것으로 이해된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는 예를 들어 90°에서 각각의 생물학적 세포에 의해 방출되는 적어도 하나의 형광 빔의 강도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는 측정 챔버를 통한 생물학적 세포의 통과에 의해 발생되는 전기적인 임피던스의 변화를 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는,
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입사 광 빔이 생물학적 세포의 경로와 횡단하도록 측정 챔버를 통과하는 생물학적 세포를 향해 입사 광 빔을 방출하는 단계와,
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측정 챔버를 통과하는 각각의 생물학적 세포로부터 적어도 하나의 광 빔을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 통과 단계는 측정 챔버를 통과하는 생물학적 세포를 유체역학적으로 피복하는 적어도 하나의 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 검출 단계는 측정 챔버를 통과하는 각각의 생물학적 세포에 의해 산란되는 적어도 하나의 광 빔 및 측정 챔버를 통과하는 각각의 생물학적 세포에 의해 방출되는 적어도 하나의 형광 빔을 동시에 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 검출 단계는 측정 챔버를 통과하는 각각의 생물학적 세포에 의해 적어도 2개의 상이한 방향으로 산란되는 광 빔 및 적어도 2개의 상이한 파장을 갖는 측정 챔버를 통과하는 각각의 생물학적 세포에 의해 방출되는 적어도 2개의 형광 빔을 동시에 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은 상기 생물학적 세포의 구조 및/또는 형상을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은 각각의 세포 클러스터에서의 생물학적 세포의 농도 및/또는 생물학적 세포의 분포를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은,
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참조 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 유세포측정기의 측정 셀 내로 통과시키는 단계와,
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참조 생물학적 샘플에 포함되는 각각의 생물학적 세포에 대해 N개의 세포측정 파라미터를 측정하는 단계와,
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참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 참조 생물학적 샘플의 상기 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N은 3 이상의 정수인, 결정 단계와,
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참조 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 상기 참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 상기 세포측정 파라미터에 따라 상기 참조 생물학적 샘플에 관련된 결정된 지점들을 상이한 세포 클러스터들로 자동으로 클러스터화하는 자동 클러스터화 단계와,
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복수의 참조 클러스터 파일을 규정하기 위해서 복수의 참조 생물학적 샘플에 대해서 상기 통과 단계, 측정 단계, 결정 단계 및 클러스터와 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은, 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 통과시키는 단계 전에, 분석될 생물학적 샘플을 준비하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 준비 단계는, 예컨대 등장성 희석을 사용하여 분석될 생물학적 샘플을 희석시키는 단계를 포함한다. 또한, 준비 단계는, 희석 단계 이외에, 분석될 생물학적 샘플에 포함되는 생물학적 세포, 예를 들어 적혈구의 적어도 일부를 선택적으로 용해하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 준비 단계는 분석될 생물학적 샘플에 포함되는 생물학적 샘플의 적어도 일부, 더 구체적으로는 분석될 생물학적 샘플에 포함되는 생물학적 세포의 적어도 일부의 핵산을 형광 염료 같은 형광색소에 의해 라벨링하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은 샘플 클러스터 파일을 참조 클러스터 파일로서 통합하는 단계를 포함한다. 이러한 통합 단계는 특히 혈액학자가 분석될 생물학적 샘플에 관련된 병리를 식별하고 이러한 병리와 관련된 암시를 샘플 클러스터 파일과 연관시킨 후에 실행된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법, 특히 분석 단계는, 샘플 클러스터 파일을 정상적인 클러스터 파일과 비교하는 단계로서, 정상적인 클러스터 파일 각각은 각각의 정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파라미터로부터 규정되는, 비교 단계를 포함한다. 본 명세서에서, ≪정상적인≫ 생물학적 샘플이라는 용어는 병리적이지 않으며 비정상적이지 않은 생물학적 샘플을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 준비 단계는, 분석될 생물학적 샘플에, 생물학적 세포의 막 상에 위치되는 수용체에 대해 특화된 항체를 포함하는 하나 이상의 시약(들)을 추가하는 단계를 포함한다. 이러한 항체는 각각의 세포에 대한 하나 이상의 특정 신호(들)를 생성하는 것을 허용하는 형광 추적자 또는 입자에 접합된다. 따라서, 본 발명에 따른 분석 방법은, 진단을 더 양호하게 구체화하거나 확인하기 위해서, 세포측정 파라미터로 디지털적으로 변환된 기본적인 물리적 크기에, 요구에 따라 면역-혈액학적 측정치를 추가하는 단계를 허용한다.
본 발명은 또한,
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분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 통과시키도록 의도된 측정 셀 및 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포의 세포측정 파라미터를 측정하도록 구성되는 측정 수단을 포함하는 유세포측정기, 및
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처리 유닛으로서,
- 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 대응하는 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간 내의 하나의 지점을 결정하고 - N은 3 이상의 정수임 -,
- 샘플 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 지점들을 상이한 세포 클러스터로 클러스터화하고,
- 샘플 클러스터 파일을 참조 클러스터 파일과 비교하도록 - 참조 클러스터 파일 각각은 각각의 병리적인 또는 비정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파라미터로부터 규정됨 - 구성되는, 처리 유닛을 포함하는 분석 장치에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 장치는 혈액학 장치와 같은 생체외 진단을 위한 분석 장치이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유세포측정기의 측정 셀은 수평에 대해 경사지는데, 예를 들어 약 45°의 각도로 경사진다.
어떠한 경우에는, 본 발명은 이러한 유세포측정기의 실시예를 비제한적인 예로서 나타내는 첨부된 개략적인 도면을 참고한 다음의 설명을 사용하여 명확하게 이해될 것이다.
도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 유세포측정기에 속하는 유세포측정기의 사시도이다.
도 3은 도 1의 유세포측정기의 단면도이다.
도 4는 도 3의 상세의 확대도이다.
도 5는 도 1의 유세포측정기의 단면도이다.
도 6은 도 2의 VI-VI 선을 따른 단면도이다.
도 6 및 도 7은 도 3의 상세의 확대 스케일 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 유세포측정기를 포함하는 분석 장치의 평면도이다.
도 3은 도 1의 유세포측정기의 단면도이다.
도 4는 도 3의 상세의 확대도이다.
도 5는 도 1의 유세포측정기의 단면도이다.
도 6은 도 2의 VI-VI 선을 따른 단면도이다.
도 6 및 도 7은 도 3의 상세의 확대 스케일 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 유세포측정기를 포함하는 분석 장치의 평면도이다.
도 1 내지 도 7은 본 발명에 따른 분석 장치(2)에 속하는 세포측정 측정 헤드라고도 지칭되는 유세포측정기(3)를 나타낸다.
유세포측정기(3)는 예를 들어 금속 지지체일 수 있는 일체형 지지체(4)를 포함한다. 지지체(4)는 평행 육면체 형상이며 내부 수용 하우징(5)을 한정한다. 지지체(4)는 특히 지지체(4)의 6개의 외부면에 각각 형성된 6개의 통과 개구를 포함한다.
유세포측정기(3)는 측정 챔버(7)를 적어도 부분적으로 한정하는 측정 셀(6)(도 4에 도 상세하게 도시됨), 생물학적 세포(F)의 유동을 측정 챔버(7) 내로 주입하도록 배치되는 주입 장치(8), 및 측정 챔버(7) 내로 주입된 생물학적 세포(F)의 유동을 유세포측정기(3) 외부로 배출하도록 배치되는 배출 장치(9)를 더 포함한다.
도 4에 도시된 바와 같이, 측정 셀(6)은 환형이고 주입 장치(8)와 배출 장치(9) 사이에 밀봉 방식으로 개재된다. 측정 셀(6)은 지지체(4)에 의해 한정되는 수용 하우징(5)에 수용되며 수용 하우징(5)으로부터 유체 분리된다. 측정 셀(6)은 전기 절연적이며 광을 투과시키는 재료로 구성되는 것이 유리하며, 예를 들어 자발형광을 회피하기 위해서 폴리메틸 메타크릴레이트, 유리 또는 석영으로 구성된다.
주입 및 배출 장치(8, 9)는 지지체(4)의 2개의 대향 외부면, 예를 들어 지지체(4)의 대향 측방향 외부면에 각각 체결된다. 그러나, 주입 및 배출 장치(8, 9)는 지지체(4)의 2개의 상위 및 하위 외부면에 각각 체결될 수도 있다.
도 3 및 도 6에 더 구체적으로 도시된 바와 같이, 주입 장치(8)는 내부 챔버(12)를 한정하는 주입 노즐(11)을 포함한다. 주입 노즐(11)에는 측정 챔버(7) 내로 개방되는 주입 오리피스(13)가 제공되고 내부 챔버(12)를 측정 챔버(7)에 유체 연결하도록 배치된다.
주입 장치(8)는 현탁액 상태의 분석될 생물학적 세포를 포함하는 분석될 생물학적 샘플을 내부 챔버(12)에 공급하도록 의도되는 제1 관형 공급 도관(14)을 더 포함한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 주입 장치(8)는 내부 챔버(12)에 유체적으로 연결되며 내부 챔버(12)의 내용물을 유세포측정기(3)의 외부로 이송하도록 의도되는 이송 도관(15)을 더 포함한다. 이송 도관(15)은 더 구체적으로는 내부 챔버(12) 내로 도입된 헹굼 유체를 제1 공급 덕트(14)를 통해 유세포측정기(3)의 외부로 이송하도록 의도된다.
주입 장치(8)는 내부 챔버(12)에 피복 유체를 공급하도록 의도된 제2 공급 도관(16)을 더 포함한다. 주입 노즐(11) 및 제2 공급 도관(16)은, 제2 공급 도관(16)을 통해 내부 챔버(12) 내로 도입된 피복 유체가, 생물학적 샘플이 주입 오리피스(13)를 통과하기 전에, 내부 챔버(12) 내로 도입된 생물학적 샘플을 유체역학적으로 피복할 수 있도록, 구성된다.
도 7에 도시된 바와 같이, 배출 장치(9)는, 측정 챔버(7) 내로 개방되는 내부 챔버(17)를 한정하며, 또한 측정 챔버(7)에 유체 연결되고 측정 챔버(7) 내로 주입된 생물학적 세포(F)의 유동을 유세포측정기(3)의 외부를 향해 배출하도록 의도되는 관형 배출 도관(18)을 포함한다. 배출 덕트(18)는 부분적으로 내부 챔버(17) 내로 연장되며 주입 오리피스(13)에 대향하는 측정 챔버(7) 내로 개방된다.
배출 장치(9)는 측정 챔버(7)에 유체 연결되며 측정 챔버(7)에 피복 유체를 공급하도록 의도되는 제3 공급 도관(19)을 더 포함한다. 측정 챔버(7) 및 제3 공급 도관(19)은, 제3 공급 도관(19)을 통해 측정 챔버(7) 내로 도입된 피복 유체가 측정 챔버(7)를 통해 유동하는 생물학적 세포(F)의 유동을 유체역학적으로 피복할 수 있도록 구성된다.
도 1 및 도 7에 도시된 바와 같이, 배출 장치(9)는 측정 챔버(7)에 유체 연결되며 측정 챔버(7)의 내용물을 유세포측정기(3) 외부로 이송하도록 의도되는 이송 도관(21)을 더 포함한다. 이동 도관(21)은 더 구체적으로는 측정 챔버(7) 내로 도입된 헹굼 유체를 제3 공급 도관(19)을 통해 유세포측정기(3) 외부로 이송하도록 의도된다.
유세포측정기(3)는 분석될 생물학적 세포의 세포측정 파라미터를 측정하도록, 특히 분석될 생물학적 세포의 광학적 및 전기적 특성을 측정하도록 구성되는 측정 수단을 더 포함한다.
도 1 내지 도 7에 나타낸 실시예에 따르면, 측정 수단은, 입사 광 빔을 측정 챔버(7)의 방향으로 방출하고, 측정 챔버(7) 내로 도입된 생물학적 세포(F)의 유동에 횡단, 즉 교차시킬 수 있도록 배치되는 방출 장치(22), 및 생물학적 세포(F)의 유동에 대해서 각도방향으로 오프셋되며 측정 챔버(7)를 통과하는 생물학적 세포로부터 유래되는 광 빔을 수집하도록 배치되는 여러 개의 수집 장치(23a, 23b, 23c)를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 측정 수단은 예를 들어 생물학적 세포의 유동에 대해 각도방향으로 오프셋되는 여러 개의 방출 장치 및 또한 단일 또는 여러 개의 수집 장치(들)를 포함할 수 있다.
방출 및 수집 장치는 지지체(4)의 상위 및 하위 외부면에 장착되고 생물학적 세포(F)의 유동 방향에 실질적으로 수직인 평면에서 연장된다. 수집 장치(23a)는 예를 들어 측정 셀(6)에 대해 방출 장치(22)에 대향하여 배치되는 한편, 수집 장치(23b 및 23c)는 측정 셀(6)에 대해 방출 장치(22)에 수직으로 배치된다. 그러나, 본 발명의 변형에 따르면, 방출 장치(22) 및 수집 장치(23a)는 지지체(4)의 측방향 외부면에 장착될 수 있다.
방출 장치(22)는 입사 광 빔을 발생시키도록 배치되는 광원(24)을 포함한다. 광원(24)은 예를 들어 레이저 빔을 생성하도록 배치된 레이저 소스일 수 있다.
도 1 내지 도 7에 나타낸 실시예에 따르면 그리고 더 구체적으로는 도 1로부터 다음과 같이, 수집 장치(23a)는 복수의 수집 광학 요소, 더 구체적으로는 중앙 수집 광학 파이버(25a) 및 하나 또는 여러 개의 주변 수집 광학 파이버(들)(25b)를 포함한다. 예를 들어, 중앙 수집 광학 파이버(25a)는 입사 광 빔의 광학 경로를 따라, 즉 0°에서 측정 챔버(7)로부터 광 빔을 수집하도록 의도되며, 주변 수집 광학 파이버(25b)는 일부에 대해서는 4°의 범위의 각도에서 측정 챔버(7)로부터 광 빔을 수집하고 다른 것에 대해서는 9°의 범위의 각도에서 측정 챔버(7)로부터 광 빔을 수집하도록 의도된다. 그러나, 수집 장치(23a)는 단일 주변 수집 광학 파이버(25b)를 포함할 수 있다.
수집 장치(23b)는 예를 들어 중앙 수집 광학 파이버 같은 단일 수집 광학 요소를 포함할 수 있으며, 또한 수집 장치(23c)는 예를 들어 중앙 수집 광학 파이버 같은 단일 수집 광학 요소를 포함할 수 있다.
측정 수단은 각각의 수집 장치(23a 내지 23c)에 각각 연관된 복수의 검출 요소(도면에는 도시되지 않음)를 더 포함한다. 각각의 검출 요소는 각각의 수집 장치에 의해 수집된 광 빔에 따라 결정된 측정 신호를 출력하도록 배치된다. 각각의 생물학적 세포가 입사 광 빔을 통과할 때, 각각의 검출 요소에 의해 출력된 각각의 측정 신호는 예를 들어 상기 생물학적 세포에 의해 흡수되거나 또는 재방출되는 광의 양에 비례한다. 각각의 검출 요소는 예를 들어 포토다이오드 또는 또한 광전자증배관과 같은 광검출기일 수 있다.
측정 수단은 또한 유리하게는 생물학적 세포를 주입 오리피스(13)에 통과시킴으로써 생성되는 전기 임피던스의 변화를 측정하도록 배치되는 전기 임피던스 변화 측정 장치를 포함한다. 전기 임피던스 변화 측정 장치는 예를 들어 주입 오리피스(13)의 어느 한 쪽에 각각 배치되는 제1 및 제2 전극(도면에는 도시되지 않음)을 포함한다. 제1 및 제2 전극은 주입 오리피스(13)를 통해 전기장을 수립하기 위해서 생물학적 세포(F)의 유동과 전기 접촉 상태에 있도록 의도된다. 전기 임피던스 변화 측정 장치의 변화에 따라, 후자는 적어도 부분적으로 내부 챔버(17)에 배치되는 단일 전극을 포함할 수 있으며, 내부 챔버(12)의 전위는 접지되고, 따라서 전기 임피던스 변화 측정 장치는 내부 챔버(12)와 내부 챔버(17) 내에 배치되는 전극 사이의 전기적 임피던스 변화를 측정하도록 구성된다.
이러한 전기 임피던스 변화 측정 장치는 주입 오리피스(13)를 통과하는 생물학적 세포의 수를 계수하는 것, 및 또한 크기, 더 구체적으로는 생물학적 세포의 부피를 결정하는 것을 허용한다. 이러한 전기 임피던스 변화 측정 장치의 동작은 통상의 기술자에게 알려져 있으며 따라서 상세하게 설명하지 않는다. 그러나, 주입 오리피스(13)를 통한 각각의 생물학적 세포의 통과는 상기 생물학적 세포의 크기 또는 부피에 비례하는 전기 펄스를 유발한다는 것에 유의해야 한다.
도 8에 도시된 바와 같이, 분석 장치(2)는 유세포측정기(3)의 측정 수단에 의해 측정되는 세포측정 파라미터를 분석하도록, 특히 각각의 검출 요소에 의해 제공되는 측정 신호를 분석하도록 구성되는 처리 유닛(32)을 더 포함한다. 처리 유닛(32)은 더 구체적으로는 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 구별 및 식별하도록, 특히 측정 수단에 의해 측정된 세포측정 파라미터로부터 생물학적 세포의 구조 및 형상을 결정하도록 구성된다. 처리 유닛(32)은 더 구체적으로는 마이크로프로세서가 설치된 적어도 하나의 전자 처리 카드를 포함한다.
도 8에 도시된 바와 같이, 분석 장치(2)는 2개의 유세포측정기(3), 및 또한 적어도 하나의 랙을 제1 변위 방향(D1)으로 변위시키도록 배치되는 로딩 모듈(33), 적어도 하나의 랙을 제2 변위 방향(D2)으로 변위시키도록 배치되는 언로딩 모듈(34), 적어도 하나의 랙을 로딩 모듈과 언로딩 모듈 사이에서 변위시키도록 배치되는 교반 모듈(도 8에서는 볼 수 없음)을 포함할 수 있으며, 교반 모듈 및 로딩 및 언로딩 모듈은 대체적 U 형상 랙 운반 경로를 형성한다. 유리하게는, 분석 장치(2)는 또한 교반 모듈에 위치된 랙에 수용되는 용기에서 생물학적 액체의 샘플을 취하도록 배치되는 샘플링 모듈(36)을 포함한다.
분석 장치(2)는 또한,
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로딩 모듈과 언로딩 모듈 사이에 배치되며 실질적으로 수직 회전축을 갖는 로딩 로터(37)로서, 로딩 로터(37)는 분석될 생물학적 유체의 샘플 또는 반응 생성물을 포함하는 용기를 수용할 수 있는, 특히 전혈에 대해 설정가능한 면역혈액학뿐만 아니라 면역학 테스트를 실행하기 위해 카트리지를 수용할 수 있는 복수의 하우징(38)을 포함하고, 수집 모듈(36)은 로딩 로터(37) 내에 수용된 용기로부터 샘플 또는 반응 생성물을 취하도록 배치되는, 로딩 로터(37),
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로딩 로터(37)에 연관되며, 로딩 로터(37)를 그 회전축을 중심으로 회전 구동하도록 배치되는 회전 구동 수단,
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실질적 수직 회전축을 갖는 준비 로터(39)로서, 준비 로터(39)는 복수의 준비 큐벳(preparation cuvette)(41)을 포함하고, 샘플링 모듈(36)은 준비 규벳(41)에 이전에 취해진 생물학적 유체의 샘플 또는 반응 생성물을 공급하도록 배치되는, 준비 로터(39), 및
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준비 로터(39)에 연관되고, 준비 로터(39)를 그 회전축을 중심으로 회전 구동하도록 배치되는 회전 구동 수단을 포함할 수 있다.
로딩 로터(37) 상의 카트리지의 존재는 추가적인 준비 시약을 추가하는 것, 따라서 물리적 또는 형태학적 성질의 세포측정 파라미터의 측정에 면역-혈액학적 성질의 세포측정 파라미터의 측정을 추가하는 것을 허용한다.
또한, 분석 장치(2)에는 준비 로터(39)에 용액 내의 자분을 포착하는 것을 허용하는 자기 장치가 제공될 수 있다. 이러한 자분은 소정 유형의 세포, 예를 들어 모든 백혈구를 선택적으로 포착하는 것을 허용하는 항체로 덮인다. 따라서, 등장성 희석에서의 재부유 후에, 준비된 생물학적 샘플은 1천배 더 많은 수의 적혈 세포를 파괴하기 위해서 용해를 사용할 필요 없이 백혈구만을 포함한다. 따라서, 백혈구는 온전하고, 이후 거의 없거나 희귀한 세포의 식별 가능성을 갖고 상당한 수의 세포에 대해 N개의 세포측정 파라미터의 측정을 실행할 수 있도록 희석 비율을 적용할 수 있다. 또한, 백혈구는 종래의 면역학 식별(예를 들어, T 림프구)을 위해 선택적으로 라벨링될 수도 있다.
이제 본 발명에 따른 유세포측정기(2)를 사용하여 생물학적 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 분석하는 방법에 대해서 설명할 것이다.
이러한 분석 프로세스는,
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분석될 생물학적 세포를 준비하는 단계로서, 준비 단계는 예를 들어 분석될 생물학적 샘플을 예컨대 등장성 희석을 사용하여 희석하는 단계, 및/또는 적혈구 같은 분석될 생물학적 샘플에 포함되는 생물학적 세포의 적어도 일부를 선택적으로 용해시키는 단계, 및/또는 분석될 생물학적 샘플에 포함되는 생물학적 세포의 적어도 일부를 형광색소로 라벨링하는 단계를 포함하는, 준비 단계와,
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분석될 생물학적 샘플에 포함되는 생물학적 세포를 유세포측정기(3)의 측정 챔버(7) 내로 통과시키는 단계와,
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분석될 생물학적 샘플에 포함되는 각각의 생물학적 세포에 대해 N개의 세포측정 파라미터, 예를 들어 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포의 형태 및/또는 구조를 나타내는 세포측정 파라미터를 유세포측정기(3)를 사용하여 측정하는 단계와,
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분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 분석될 생물학적 샘플의 상기 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간 내의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N 차원 공간의 각각의 좌표축은 각각의 측정된 세포측정 파라미터 또는 상기 각각의 측정된 세포측정 파라미터로부터 계산된 값에 대응하는, 결정 단계와,
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샘플 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 분석될 생물학적 샘플에 관련된 지점을, 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 상이한 세포 클러스터로 자동으로 클러스터화하는 단계로서, 샘플 클러스터 파일은 예를 들어 FCS(Flow Cytometry Standard) 형식인, 자동 클러스터화 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 상이한 세포 클러스터에 의해 규정된 세포 개체군을 자동으로 식별하는 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터의 지점들을 자동으로 계수하는 단계와,
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샘플 클러스터 파일을 참조 클러스터 파일과 비교하는 단계로서, 참조 클러스터 파일 각각은 각각의 변리적인 또는 비정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파라미터로부터 규정되는, 비교 단계와,
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샘플 클러스터 파일이 참조 클러스터 파일과 적어도 부분적으로 동일하거나 또는 유사한 경우, 특히 샘플 클러스터 파일의 미리결정된 세포 클러스터가 참조 클러스터 파일의 미리결정된 세포 클러스터와 동일하거나 또는 유사한 경우, 경고 메시지를 발행하는 단계로서, 발행된 경고 메시지는 샘플 클러스터 파일이 적어도 부분적으로 동일하거나 또는 유사한 참조 클러스터 파일에 연관된 병리 또는 비정상에 관한 암시를 포함하는 것이 유리한, 경고 메시지를 발행하는, 발행 단계를 포함하며, 결정 단계, 클러스터화 단계, 비교 단계 및 발행 단계는 처리 유닛(32)에 의해 실행된다.
이러한 자동 클러스터화 단계는 통상의 기술자에게 공지된 상이한 방식들로 실행될 수 있으며, 따라서 본 설명에서는 상세하게 설명하지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 방법은 N개의 측정 채널 각각에 대해 제1 디지털화된 로우 데이터 파일을 규정하기 위해서 측정 단계의 기간 동안 생성되는 아날로그 신호의 세트를 샘플링 및 디지털화하는 단계, 및 제1 레벨의 컴퓨터 처리에 의해 분석될 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 N개의 디지털화된 신호를 동기화 및 클러스터화하는 단계를 포함한다. 상기 샘플링 및 디지털화 단계는 파일을 이더넷 링크에 의해 파일을 분석하는 PC 유형 컴퓨터 유닛(도 8에 나타내지 않음)으로 전송하는 처리 유닛(32)에 의해 실행된다.
분석 방법의 실시예에 따르면, 후자는 샘플 클러스터 파일에서 적어도 하나의 가능한 비정상을 검출하기 위해서 샘플 클러스터 파일을 분석하는 단계를 더 포함하며, 분석 단계는 처리 유닛(32)에 의해 실행된다. 유리하게는, 비교 단계는, 분석 단계 동안 적어도 하나의 비정상이 검출되고, 또한 그후 전송 단계 동안 발행된 경고 메시지가 적어도 하나의 검출된 비정상에 관한 정보를 포함하는 경우에만 실행된다. 이러한 구성은, 한편으로는 분석될 생물학적 샘플이 정상적이고 병리적이지 않은 경우에 비교 단계를 실행하는 것을 회피하고, 따라서 계산의 실행 시간을 감소시키고 분석의 결과를 조작자에게 더 빠르게 제공하며, 다른 한편으로는 분석될 생물학적 샘플이 병리적이거나 비정상적인 경우에 조작자에게 경고 메시지를 가능한 상세하게 통신하는 것을 허용한다.
분석 단계는 유리하게는,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에 대해, 상기 세포 클러스터의 적어도 하나의 형태학적 파라미터, 즉 상기 세포 클러스터의 포지셔닝, 상기 세포 클러스터의 지점들의 분포, 상기 세포 클러스터의 지점들의 수, 및/또는 상기 세포 클러스터의 존재 또는 비존재를 분석하는 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 적어도 하나의 세포 클러스터의 적어도 하나의 형태학적 파라미터가 각각의 미리결정된 임계값을 초과하는 경우에 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는 더 구체적으로는,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에 대해서, 상기 세포 클러스터에서 클러스터화된 지점의 수를 적어도 하나의 각각의 미리결정된 임계값과 비교하는 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에서의 지점들의 분포를 분석하는 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 세포 클러스터의 포지셔닝을 분석하는 단계와,
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적어도 소정의 미리결정된 세포 클러스터의 존재 및/또는 비존재를 분석하는 단계와,
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세포 클러스터 중 적어도 하나에서의 지점들의 분포가 가우시안이 아닌 경우에 비정상을 검출하는 단계와,
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샘플 클러스터 파일의 적어도 2개의 세포 클러스터가 적어도 부분적으로 혼동되는 경우에 비정상을 검출하는 단계와,
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적어도 하나의 미리결정된 세포 클러스터의 존재 또는 비존재가 검출되는 경우에 비정상을 검출하는 단계와,
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세포 클러스터의 수가 미리결정된 참조값보다 많거나 적은 경우에 비정상을 검출하는 단계와,
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세포 클러스터 중 적어도 하나에 클러스터화된 지점들의 수가 각각의 미리결정된 임계값보다 적고 및/또는 큰 경우에 비정상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분석 단계는 샘플 클러스터 파일을 정상적인 클러스터 파일과 비교하는 단계를 포함하며, 정상적인 클러스터 파일 각각은 각각의 정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파라미터로부터 규정된다. 이러한 구성은 특히 샘플 클러스터 파일에서 비정상의 검출을 용이하게 하는 것을 허용한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는,
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방출 장치(22)를 사용하여, 입사 광 빔이 생물학적 세포의 경로를 횡단하도록, 측정 챔버(7)를 통과하는 생물학적 세포를 향해 입사 광 빔을 방출하는 단계와,
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수집 장치(23a 내지 23c)를 사용하여, 측정 챔버(7)를 통과하는 각각의 생물학적 세포로부터 상이한 광 빔을 검출하는 단계를 포함한다.
상이한 수집 장치(23a 내지 23c)의 구성 및 배치가 주어지는 경우, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는 특히,
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수집 장치(23a)의 수집 광학 파이버(25b, 25c)를 사용하여 각각의 생물학적 세포에 의해 작은 각도로 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계,
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수집 장치(23a)의 중앙 수집 광학 파이버(25a)를 사용하여 각각의 생물학적 세포에 의해 입사 광 빔의 광학 경로를 따라 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계,
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수집 장치(23b)를 사용하여 각각의 생물학적 세포에 의해 90°로 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계, 및
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수집 장치(23c)를 사용하여 각각의 생물학적 세포에 의해 90°로 방출되는 형광 빔 의 강도를 측정하는 단계를 포함한다.
유리하게는, 세포측정 파라미터를 측정하는 단계는, 전기 임피던스 변화 측정 장치를 사용하여, 측정 챔버(7)를 생물학적 세포가 통과하는 것에 의해 발생되는 전기 임피던스의 변화를 측정하는 단계를 더 포함한다.
유리하게는, 분석 방법은, 초기의
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유세포측정기(3)를 사용하여 참조 생물학적 샘플에 포함되는 각각의 생물학적 세포에 대한 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계,
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참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해서, 참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간 내의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N 차원 공간의 각각의 좌표 축은 각각의 측정된 세포측정 파라미터에 대응하는, 결정 단계,
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참조 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라서 참조 생물학적 샘플에 관련된 지점들을 상이한 클러스터로 자동으로 클러스터화하는 단계로서, 각각의 참조 클러스터 파일은 예를 들어 FCS(Flow Cytometry Standard) 형식인, 자동 클러스터화 단계를 포함하고 - 결정 단계 및 클러스터화 단계는 처리 유닛(32)에 의해 실행됨 -,
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복수의 참조 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 복수의 참조 생물학적 샘플에 대해서 상기 초기의 측정 단계, 결정 단계 및 클러스터화 단계를 반복하는 반복 단계를 포함한다.
물론, 본 발명은 예로서 위에서 설명한 유세포측정기의 실시예 및 분석 방법의 실시예만으로 한정되지 않으며, 그것의 상반되는 모든 변형을 포함한다.
Claims (17)
- 혈액 세포를 포함하는 생물학적 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 분석하는 분석 방법으로서, 상기 분석 방법은,
- 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 유세포측정기 측정 셀 내로 통과시키는 통과 단계와,
- 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 N개의 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계와,
- 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 대응하는 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간 내의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N은 3 이상의 정수인, 결정 단계와,
- 샘플 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 결정된 지점들을 측정된 세포측정 파라미터에 따라 상이한 세포 클러스터들로 자동으로 클러스터화하는 자동 클러스터화 단계와,
- 샘플 클러스터 파일의 상이한 세포 클러스터들에 의해 규정되는 세포 개체군을 식별하는 식별 단계와,
- 샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터의 지점들을 계수하는 계수 단계와,
- 샘플 클러스터 파일을 참조 클러스터 파일과 비교하는 단계로서, 참조 클러스터 파일 각각은 각각의 병리적인 또는 비정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파리미터로부터 규정되는, 비교 단계를 포함하는 분석 방법. - 제1항에 있어서, 상기 샘플 클러스터 파일이 참조 클러스터 파일과 적어도 부분적으로 동일하거나 또는 유사한 경우, 경고 메시지를 발생하는 발행 단계를 더 포함하는 분석 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 발행된 경고 메시지는, 샘플 클러스터 파일이 적어도 부분적으로 동일하거나 또는 유사한 참조 클러스터 파일에 연관된 병리 또는 비정상성에 관련된 표시를 포함하는 분석 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 클러스터 파일의 적어도 하나의 가능한 비정상을 검출하기 위해서 상기 샘플 클러스터 파일을 분석하는 분석 단계를 더 포함하는 분석 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 비교 단계는 상기 분석 단계 동안 적어도 하나의 비정상이 검출되는 경우에만 실행되는 분석 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 분석 방법은,
- 상기 샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에 대해서, 상기 세포 클러스터의 적어도 하나의 형태학적 파라미터를 분석하는 분석 단계와,
- 상기 샘플 클러스터 파일의 적어도 하나의 세포 클러스터의 적어도 하나의 형태학적 파라미터가 각각의 미리결정된 임계값을 초과하는 경우에 비정상을 검출하는 검출 단계를 포함하는 분석 방법. - 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 단계는,
- 상기 샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에 대해서, 상기 세포 클러스터에서 클러스터화된 지점의 수를 적어도 하나의 각각의 미리결정된 임계값과 비교하는 비교 단계와,
- 상기 세포 클러스터 중 적어도 하나에서 클러스터화된 지점들의 수가 적어도 하나의 각각의 미리결정된 임계값보다 작거나 및/또는 큰 경우에 비정상을 검출하는 검출 단계를 포함하는 분석 방법. - 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 단계는,
- 상기 샘플 클러스터 파일의 각각의 세포 클러스터에서의 지점들의 분포를 분석하는 분석 단계와,
- 상기 세포 클러스터 중 적어도 하나에서의 지점들의 분포가 가우시안이 아닌 경우 비정상을 검출하는 검출 단계를 포함하는 분석 방법. - 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 단계는,
- 상기 샘플 클러스터 파일의 세포 클러스터의 포지셔닝을 분석하는 분석 단계와,
- 상기 샘플 클러스터 파일의 적어도 2개의 세포 클러스터가 적어도 부분적으로 혼동되는 경우 비정상을 검출하는 검출 단계를 포함하는 분석 방법. - 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 단계는,
- 상기 샘플 클러스터 파일의 세포 클러스터를 분석하는 분석 단계와,
- 적어도 하나의 미리결정된 세포 클러스터의 존재 또는 비존재가 검출되는 경우 비정상을 검출하는 검출 단계를 포함하는 분석 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계는 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포의 형태 및/또는 구조를 나타내는 세포측정 파라미터를 측정하는 적어도 하나의 단계를 포함하는 분석 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계는, 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해서, 상기 생물학적 세포의 적어도 하나의 광학 특성을 측정하는 적어도 하나의 단계를 포함하는 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계는,
- 각각의 생물학적 세포에 의해 작은 각도로 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계, 및/또는
- 각각의 생물학적 세포에 의해 90°로 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계, 및/또는
- 각각의 생물학적 세포에 의해 입사 광 빔의 광학 경로를 따라 산란되는 광 빔의 강도를 측정하는 단계를 포함하는 분석 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서, 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계는 각각의 생물학적 세포에 의해 예를 들어 90°로 방출되는 적어도 하나의 형광 빔의 강도를 측정하는 단계를 포함하는 분석 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계는,
- 상기 입사 광 빔이 생물학적 세포의 경로를 횡단하도록 측정 챔버를 통과하는 생물학적 세포를 향해 입사 광 빔을 방출하는 방출 단계와,
- 상기 측정 챔버를 통과하는 각각의 생물학적 세포로부터 적어도 하나의 광 빔을 검출하는 검출 단계를 포함하는 분석 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
- 참조 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 유세포측정기의 측정 셀 내로 통과시키는 통과 단계와,
- 참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포의 N개의 세포측정 파라미터를 측정하는 측정 단계와,
- 상기 참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 참조 생물학적 샘플의 상기 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간의 하나의 지점을 결정하는 단계로서, N은 3 이상의 정수인, 결정 단계와,
- 참조 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 상기 참조 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 상기 세포측정 파라미터에 따라 상기 참조 생물학적 샘플에 관련된 결정된 지점들을 상이한 세포 클러스터들로 자동으로 클러스터화하는 자동 클러스터화 단계와,
- 복수의 참조 클러스터 파일을 규정하기 위해서 복수의 참조 생물학적 샘플에 대해서 상기 통과 단계, 측정 단계, 결정 단계 및 클러스터와 단계를 반복하는 반복 단계를 포함하는 분석 방법. - 분석 장치로서,
- 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포를 통과시키도록 의도된 측정 셀 및 분석될 생물학적 샘플의 생물학적 세포의 세포측정 파라미터를 측정하도록 구성되는 측정 수단을 포함하는 유세포측정기, 및
- 처리 유닛(32)으로서,
- 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해, 대응하는 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 좌표가 규정되는 N 차원 공간 내의 하나의 지점을 결정하고 - N은 3 이상의 정수임 -,
- 샘플 클러스터 파일을 규정하기 위해서, 분석될 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 세포에 대해 측정된 세포측정 파라미터에 따라 지점들을 상이한 세포 클러스터로 클러스터화하고,
- 상기 샘플 클러스터 파일을 참조 클러스터 파일과 비교하도록 구성되며, 참조 클러스터 파일 각각은 각각의 병리적인 또는 비정상적인 생물학적 샘플의 세포측정 파라미터로부터 규정되는, 처리 유닛(32)을 포함하는 분석 장치.
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