CN111939184A

CN111939184A - 七叶树叶总黄酮的制备方法及其预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

Info

Publication number: CN111939184A
Application number: CN202011038948.8A
Authority: CN
Inventors: 刘丽芳; 王心悦; 辛贵忠
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2020-11-17

Abstract

本发明公开了一种七叶树叶总黄酮的制备方法及其预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。属于医药领域；本发明首次建立七叶树叶总黄酮的制备工艺，步骤简单、条件易控、适合工业化生产，同时活性成分含量高，疗效可靠、副作用少，有利于七叶树植物资源的进一步开发和利用；另外，本发明首次发现七叶树中黄酮类物质可以应用于制备治疗溃疡性结肠炎药物，并阐明了槲皮苷为七叶树叶总黄酮的主要药效成分；相较于传统氨基水杨酸类、类固醇激素类等药物毒副作用或不良反应小，有良好的应用前景。

Description

七叶树叶总黄酮的制备方法及其预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种七叶树叶总黄酮的制备方法，特别是涉及七叶树叶总黄酮在预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症疾病，属自身免疫性疾病(autoimmune diseases)范畴，UC的病变以肠道连续性分布的粘膜充血肿胀、糜烂和浅小溃疡为主，主要累及粘膜层和粘膜下层，临床表现为腹痛、腹泻、里急后重、黏液脓血便等。由于UC很难治愈，且易复发、恶化和癌变，给患者带来极大的身体和精神上的痛苦，已被世界卫生组织(WHO)列为现代难治疾病之一；至今，针对UC的治疗药物主要包括传统的氨基水杨酸类、类固醇激素类、免疫抑制剂类以及新型生物制剂类等，传统治疗药物的治疗效果有限，停药后复发率较高，因此，中药和非化学药物受到广大患者的欢迎。

黄酮类化合物是一类广泛分布于自然界的多酚类物质，研究表明黄酮类成分具有抗氧化、保护心血管、抗炎、抗癌、类雌激素作用等多种生理活性；随着社会的发展和人们生活水平的提髙，人们对于身体健康，饮食健康越来越关注，其中分布广泛，纯天然、毒副作用低且具有保健功效的黄酮类化合物日益受到人们的关注，从植物中寻找更多的黄酮类化合物来满足人们的需要成为近年来各国科学研宄者的研宄热点。

七叶树科七叶树属植物多为多年生落叶乔木，是常用的集药用与观赏为一体的全球广布植物，其中七叶树Aesculus chinensis Bge.的种子即为中国药典一部收载的中药材-娑罗子(Aesculi Semen)的重要来源，主要含有三萜皂苷类、黄酮类，香豆素类，有机酸等化学成分。但大部分研究主要集中在以七叶皂苷为主的皂苷类化合物上，而对于其他活性成分如黄酮类、香豆素类、甾醇类却鲜有报道。

七叶树叶片部位总黄酮含量丰富，明显大于其种子部位，因此，本发明以七叶树叶为研究对象，首次建立了七叶树叶总黄酮的制备工艺，并进一步发现七叶树叶总黄酮可明显改善溃疡性结肠炎导致的体重下降、结肠组织溃疡、结肠长度变短、结肠出血等情况；迄今为止尚未有关七叶树黄酮类化合物防治溃疡性结肠炎的治疗措施。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种七叶树叶总黄酮在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。经动物模型实验证明，经口服给药的途径，七叶树叶总黄酮及其主要药效成分槲皮苷可明显改善溃疡性结肠炎导致的体重下降、结肠组织溃疡、结肠长度变短、结肠出血等情况。

本发明的技术方案是：七叶树叶总黄酮的制备方法，其具体提取步骤如下：

步骤(1.1)、将七叶树叶粉碎，用乙醇回流提取，过滤，将滤液减压浓缩至无乙醇味，加水搅匀，静置冷藏过夜，离心取上清液，挥干溶剂浓缩得到七叶树叶提取物；

步骤(1.2)、将七叶树叶提取物用水复溶即得上样液，湿法装柱，上样于提前处理好的大孔吸附树脂柱，洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，即得七叶树叶总黄酮粗品，加水溶解后，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，干燥，即得七叶树叶总黄酮。

进一步的，在步骤(1.1)中，所述乙醇的体积浓度是30-95％；提取的温度是60-95℃；提取时间为1-2h；所述乙醇的体积是七叶树叶重量的5-20倍；加水体积为原体积的2-3倍。

进一步的，在步骤(1.2)中，所述洗脱的具体操作方法是：首先依次用水、10％乙醇除去杂质，再用30-70％乙醇进行洗脱；

其中，所述乙酸乙酯为水饱和的乙酸乙酯。

进一步的，通过紫外分光光度法测定所得七叶树叶总黄酮中总黄酮含量为60.91％，高效液相法测定所得七叶树叶总黄酮中槲皮苷含量为49.92％。

进一步的，七叶树叶总黄酮在预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

进一步的，所述七叶树叶总黄酮包括七叶树叶总黄酮或包含七叶树叶总黄酮的组合物。

进一步的，所述组合物由七叶树叶总黄酮添加药学上可接受的辅料制备成制剂。

进一步的，所述制剂为口服制剂。

进一步的，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂或矫味剂中的一种或几种。

进一步的，所述口服制剂为口服液、冲剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、汤剂中的一种。

本发明的有益效果是：1、本发明首次建立七叶树叶总黄酮的制备工艺，步骤简单、条件易控、适合工业化生产，同时活性成分含量高，疗效可靠、副作用少，有利于七叶树植物资源的进一步开发和利用；2、本发明首次发现七叶树中黄酮类物质可以应用于制备治疗溃疡性结肠炎药物，并阐明了槲皮苷为七叶树叶总黄酮的主要药效成分；相较于传统氨基水杨酸类、类固醇激素类等药物毒副作用或不良反应小，有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的操作流程图；

图2为本发明中槲皮苷对照品和样品溶液吸收光谱图；

图3为本发明中槲皮苷对照品标准曲线图；

图4为本发明中350nm下测定槲皮苷对照品及样品色谱图；

图5为本发明中小鼠体重变化结果示意图；

图6为本发明中小鼠结肠长度变化结果示意图；

图7为本发明中小鼠结肠病理组织学结果示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：

如图1所述，七叶树叶总黄酮的制备方法，其具体提取步骤如下：

其中，所述乙酸乙酯为水饱和的乙酸乙酯。

进一步的，所述制剂为口服制剂。

实例1、七叶树叶总黄酮的制备方法：

称取干燥后过筛的七叶树叶粉末75g于提取容器中，加入75％乙醇溶液1.5L，于95℃加热提取1h；提取液抽滤得滤液，滤液回收乙醇浓缩至50ml，加水150ml搅拌均匀，静置冷藏过夜，离心后取上清液，浓缩蒸干，得到七叶树叶提取物8.95g；将七叶树叶提取物溶于300ml水中，70℃下加热搅拌溶解，上样于预处理过的AB-8大孔吸附树脂，依次用水，10％乙醇各洗脱5～6BV，再用50％乙醇洗脱5～6BV，收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得七叶树叶总黄酮粗品，加水复溶后用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂后，干燥，即得七叶树叶总黄酮，称重得1.012g，紫外分光光度法法测得总黄酮含量为60.91％，高效液相色谱法测得槲皮苷含量为49.92％。

实例2、七叶树叶总黄酮中总黄酮的含量测定：

2.1、总黄酮含量测定：

以槲皮苷为对照品，利用黄酮类物质可与铝盐反应生成有色络合物，照紫外-可见分光光度法测定；

2.2、对照品溶液的制备：

取槲皮苷对照品适量，精密称定，加95％乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

2.3、测定波长的确定：

分别精密吸取槲皮苷对照品溶液和样品溶液各1ml，置10ml具塞试管中，各加5％Al(NO₃)₃溶液1ml，加95％乙醇定容至刻度线，摇匀，静置20min，于200～700nm波长范围内扫描测定，得到全波长扫描谱图(图2)，由图2可知，对照品与总黄酮样品溶液均在波长404nm处有最大吸收，故确定404nm为测定波长；

2.4、标准曲线的绘制：

精密吸取槲皮苷对照品溶液0.5、0.8、1.0、1.2、1.8、2.0ml，分别置于10ml刻度试管中，各加5％Al(NO₃)₃溶液1ml，加95％乙醇定容至刻度线，摇匀，静置20min；以404nm波长处测得的吸光度为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，所得回归方程为y＝31.911x-0.015，R2＝0.9992(如图3所述)。

2.5、样品中总黄酮的含量测定：

精密称取3批本发明实例1的七叶树叶总黄酮样品各3份，每份约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加95％乙醇超声溶解，稀释至刻度，摇匀，照标准曲线绘制项下的方法，自“置于10ml具塞试管中”起依法操作，测定吸光度，计算总黄酮含量(表1)。

表1、本发明实例1中七叶树叶总黄酮含量

实例3、七叶树叶总黄酮中槲皮苷的含量测定：

3.1、仪器与试药：

甲醇(色谱级)，磷酸(色谱级)，液相色谱仪(Thermo Ultimate 3000)，槲皮苷(含量99.4％)；

3.2、色谱条件：

以Shimadzu GL Wondasil C18-WR色谱柱(4.6×150mm，5μm)，采用紫外检测器，检测波长为350nm，以0.4％磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B，流速为1.0ml/min，进样量10μL，测定本发明实例1中的七叶树叶总黄酮中槲皮苷的含量；(对照品和供试品色谱图见图4)

3.3、对照品和供试品溶液的制备：

对照品溶液的制备：取槲皮苷对照品适量，精密称定，加入甲醇，配制成浓度为1mg/ml的储备液，为了制备标准曲线，将储备溶液用甲醇逐步稀释以制备一系列不同浓度的工作溶液；

供试品溶液的制备：精密称取实施例1七叶树叶总黄酮提取物约10mg置10ml量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，备用；

3.4、方法学考察：

分别进行线性与范围，检测限与定量限，精密度(包括日内，日间精密度以及重复性)，回收率考察，结果见表2。

表2.方法学考察结果

3.5、样品中槲皮苷的含量测定：

精密称取3份实例1七叶树叶总黄酮约10mg置10ml量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，进样，测定含量，结果见表3。

表3.本发明实例1中七叶树叶总黄酮槲皮苷含量

实例4、七叶树叶总黄酮及槲皮苷对小鼠急性UC模型的影响：

一、实验材料：

1.1、实验仪器：

电子天平，离心机，数字病理切片扫描仪，超低温冰箱，碎冰机；

1.2、实验动物：

C57小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-20g，来自某大学比较医学中心，许可证号为：SCXK(苏)2017-0007；

1.3、实验溶液的配制：

(1)、0.01M PBS溶液：称取0.2g KCl，7.9g NaCl，1.44g Na₂HPO₄和1.8gK₂HPO₄，溶于800ml去离子水中，用HCl调节溶液的pH至7.4，使用去离子水至1L，冷藏备用；

(2)、2.5％DSS(w/v)溶液：称取2.5g DSS粉剂，溶解于100ml纯净水水中，充分溶解至体系透明；

(3)、柳氮磺吡啶溶液(SASP)：取柳氮磺吡啶片剂，除去糖衣，研细，按照0.62g/kg/日的剂量，称取一定量，用纯净水溶解,每日现配；

(4)、总黄酮低剂量组(Total flavonoids，TF-L)：按照8mg/kg/日的剂量，以纯净水溶解总黄酮提取物，纯净水体积以每只小鼠每天消耗5ml为标准计算，每日现配；

(5)、总黄酮高剂量组(TF-H)：按照40mg/kg/日的剂量，以纯净水溶解总黄酮提取物，纯净水体积以每只小鼠每天消耗5ml为标准计算，每日现配；

(6)、槲皮苷低剂量干预组(Quercitrin，QC-L)：按照4mg/kg/日的剂量，以纯净水溶解总黄酮提取物，纯净水体积以每只小鼠每天消耗5ml为标准计算，每日现配；

(7)、槲皮苷高剂量干预组(QC-H)：按照20mg/kg/日的剂量，以纯净水溶解总黄酮提取物，纯净水体积以每只小鼠每天消耗5ml为标准计算，每日现配；

(8)、4％多聚甲醛(w/v)溶液：称取4g多聚甲醛，溶解于100ml去离子水中，过夜搅拌，充分溶解至体系透明；

二、试验方法与结果：

2.1、DSS诱导的UC小鼠模型的建立

将小鼠适应性喂养7天后，按照体重随机分为正常对照组(Control)，模型组(Model)，阳性药组(SASP)，总黄酮低剂量组(TF-L)，总黄酮高剂量组(TF-H)，槲皮苷低剂量组(QC-L)，槲皮苷高剂量组(QC-H)。正常对照组1～10天正常饲养；模型组1～7天自由饮用DSS，8～10天自由饮水；药物组1～7天自由饮用DSS及药物，8～10天自由饮水；

2.2、UC小鼠模型观察：

在动物实验的整个过程中，每天观察小鼠的精神状态、饮食、粪便性状及便隐血情况并进行记录；

2.3、样品采集：

将小鼠脱颈椎处死，打开腹腔，将盲肠至肛门整个肠段剥离出来，从盲肠末端到直肠(肛门上端1cm)处为结肠部分，清除结肠内容物并用冰PBS漂洗干净，将结肠平铺开，观察肠黏膜的出血和溃疡情况，并测量结肠长度；截取结肠下端1cm部分，用滤纸吸取水分后，采用4％多聚甲醛溶液固定，并进行石蜡包埋、切片和HE染色等，于显微镜下观察结肠的病理组织学状况；

2.4、统计学处理：

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，运用t检验对两组独立样本的均值进行比较，##表示与空白组相比有显著性，p<0.001，**表示与模型组相比有显著性，p<0.01；*表示与模型组相比有显著性，p<0.05；

三、试验结果：

3.1、七叶树叶总黄酮及槲皮苷对UC小鼠一般情况的影响：

空白对照组小鼠在实验过程中精神状况好，活动敏捷，饮食饮水量正常，大便正常；模型组小鼠随着造模时间的延长，逐渐出现活动变缓，饮食饮水量减少，便血现象，而阳性药干预组和药物干预组的小鼠便血现象明显明显比模型组弱；

3.2、七叶树叶总黄酮及槲皮苷对UC小鼠体重影响：

以相对于第一天体重的变化率(％)来评价小鼠体重的变化，如图5所示，模型组小鼠体重下降了25.03％，为第一天体重的74.97％，与正常对照组相比，体重变化有显著性差异，表明UC小鼠模型建立成功；给药组虽然同样出现体重下降，但体重下降幅度较模型组小，表明七叶树叶总黄酮和槲皮苷能够显著降低结肠炎小鼠体重下降比例；

3.3、七叶树叶总黄酮及槲皮苷对UC小鼠结肠长度影响：

从图6(a)可以看出空白对照组的小鼠结肠外观正常，而且纵抛开结肠可见成形且色泽正常的颗粒状粪便；与空白对照组相比，模型组小鼠结肠内部粪便不成形、血便，结肠长度明显变短，说明UC小鼠造模成功；与模型组小鼠相比，阳性药组和给药组小鼠的结肠状态与粪便性状明显优于模型组小鼠，结肠长度显著增高；(如图6(b)所述)；

3.4、七叶树叶总黄酮及槲皮苷对UC小鼠病理组织学影响：

如图7所示，空白对照组小鼠结肠黏膜上皮细胞完整并且可见许多杯状细胞，固有层腺体形态正常且排列整齐，粘膜下层无水肿，未见炎性细胞浸润，无变形坏死；UC模型组小鼠结肠组织严重病变，表现为结肠粘膜下层水肿，黏膜上皮缺损，杯状细胞严重破坏，并且出现大量炎性细胞的浸润；与模型组相比，阳性药和给药组小鼠结肠状况恢复良好，结肠粘膜下层水肿减轻，黏膜上皮细胞恢复完整并且可见部分杯状细胞，接近空白对照组；

四、实验结论：

综合小鼠形态学表现，以及各项病理指标结果，可以证明急性溃疡性结肠炎模型的成功建立，经小鼠模型实验证明，七叶树叶总黄酮及槲皮苷可明显改善急性溃疡性结肠炎小鼠的体重下降、结肠组织溃疡、结肠长度变短、结肠出血等情况，阐明槲皮苷为七叶树叶总黄酮的主要药效成分；相较于传统氨基水杨酸类、类固醇激素类等药物毒副作用或不良反应小，有良好的应用前景。

实例5、七叶树总黄酮制剂的制备：

七叶树叶总黄酮提取物20mg溶于10ml 0.5％CMC-Na中，超声20min，涡旋至混悬状态，制成口服液；

七叶树叶总黄酮提取物20mg，与糊精50mg、糖粉20mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，制备冲剂；

七叶树叶总黄酮提取物20mg，与糖粉20mg、水5mg采用常规技术制成糖浆剂，再加入淀粉70mg采用常规技术制备成丸剂；

七叶树叶总黄酮提取物20mg，与淀粉50mg、糊精50mg混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入硬脂酸镁混合，制成片剂；

七叶树叶总黄酮提取物20mg，与淀粉50mg、滑石粉5mg混合采用常规技术制成散剂；

七叶树叶总黄酮提取物20mg，与淀粉70mg、糊精10mg、糖粉10mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，湿法制粒制备成颗粒剂。

Claims

1.七叶树叶总黄酮的制备方法，其特征在于，其具体提取步骤如下：

2.根据权利要求1所述的七叶树叶总黄酮的制备方法，其特征在于，在步骤(1.1)中，所述乙醇的体积浓度是30-95％；提取的温度是60-95℃；提取时间为1-2h；所述乙醇的体积是七叶树叶重量的5-20倍；加水体积为原体积的2-3倍。

3.根据权利要求1所述的七叶树叶总黄酮的制备方法，其特征在于，在步骤(1.2)中，所述洗脱的具体操作方法是：首先依次用水、10％乙醇除去杂质，再用30-70％乙醇进行洗脱；

其中，所述乙酸乙酯为水饱和的乙酸乙酯。

4.根据权利要求1-3所述的七叶树叶总黄酮的制备方法，其特征在于，通过紫外分光光度法测定所得七叶树叶总黄酮中总黄酮含量为60.91％，高效液相法测定所得七叶树叶总黄酮中槲皮苷含量为49.92％。

5.七叶树叶总黄酮在预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

6.如权利要求5所述的七叶树叶总黄酮在预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述七叶树叶总黄酮包括七叶树叶总黄酮或包含七叶树叶总黄酮的组合物。

7.如权利要求5、6所述的七叶树叶总黄酮在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述组合物由七叶树叶总黄酮添加药学上可接受的辅料制备成制剂。

8.如权利要求7所述的七叶树叶总黄酮在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述制剂为口服制剂。

9.如权利要求7所述的七叶树叶总黄酮在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂或矫味剂中的一种或几种。

10.如权利要求7、8所述的七叶树叶总黄酮在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述口服制剂为口服液、冲剂、丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、汤剂中的一种。