CN111919121A

CN111919121A - 新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度判定方法及预后预测方法

Info

Publication number: CN111919121A
Application number: CN201980023356.8A
Authority: CN
Inventors: 伊藤雅之; 赤松智久
Original assignee: National Center of Neurology and Psychiatry
Current assignee: National Center of Neurology and Psychiatry
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-11-10
Also published as: JP7185947B2; JPWO2019189725A1; EP3779452A1; US20210041468A1; WO2019189725A1; EP3779452A4; EP3779452B1

Abstract

本发明开发一种能够简便且高测中率地判定高新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度、及低体温疗法治疗后的预后的预测的方法。能够根据从出生后6小时以内的受试者采集的血液中所含的可溶型LOX‑1蛋白质或其片段的每单位体积的质量是否在确定的临界值以上而容易地判定新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度、及预测低体温疗法治疗后的预后。

Description

新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度判定方法及预后预测方法

技术领域

本发明涉及一种判定受试体即罹患新生儿缺氧缺血性脑病的新生儿的该疾病的严重程度的方法、及预测罹患该疾病的新生儿的经过低体温疗法治疗的预后的方法。

背景技术

新生儿缺氧缺血性脑病(neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy)(本说明书中，经常记作“nHIE”)是因重度新生儿窒息、急性呼吸循环衰竭或胎儿缺氧等而在新生儿中意外发病的脑循环障碍。nHIE通常为预后不良的疾病，发生频率为0.1～0.6％，但致死率为10～60％，脑性瘫痪及癫痫等神经后遗症的发生率非常高，达到25％(非专利文献1～3)。因缺氧及缺血释放至神经细胞间隙的兴奋性神经递质谷氨酸的神经毒性及因细胞因子等炎性物质导致的神经细胞损伤及脑水肿与其病况紧密相关(非专利文献4及5)。因此，nHIE的治疗中，在产生不可逆的细胞损伤前的潜伏期(latent phase)，即通常出生后6小时以内进行处理至关重要。

目前为止，已经证明对nHIE具有神经保护作用的仅有低体温疗法(非专利文献6～11)。但是，为了进行低体温疗法，需要冷却装置、人工呼吸器、脑电监护仪等特殊的设备，程序、管理非常繁杂，因此，只能在特定的先进医疗机构进行。然而，新生儿窒息及nHIE却可能在任何出生设施意外发生，为了进行低体温疗法必须将新生儿送至先进医疗机构。另一方面，nHIE从出生前或出生时开始发展，即使是低体温疗法，如果未如上所述那样在出生后6小时以内开始治疗，也没有效果。即，为了获得由低体温疗法产生的有效的治疗效果，必须在出生后6小时以内诊断新生儿是否罹患nHIE。但是，一直以来，并未开发出在新生儿的出生后早期能够快速实施的nHIE的检测方法。

本发明人等为了解决该课题，制作nHIE的模型大鼠，鉴定出nHIE发病时表达显著增减，而该增减通过低体温疗法处理被消除的12种基因及该基因产物，并将其开发作为脑循环障碍检测用生物标志物(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2015/125752

非专利文献

非专利文献1：Shankaran S,2009,J Neurotrauma.26(3):437-443.doi:10.1089/neu.2008.0678.

非专利文献2：Gunn AJ.,2000,Curr Opin Pediatr.12(2):111-115.

非专利文献3：Vannucci RC&Perlman JM,1997,Pediatrics.100(6):1004-1014.

非专利文献4：Drury PP,et al.,2010,Semin Fetal Neonatal Med.15(5):287-292.doi:10.1016/j.siny.2010.05.005.

非专利文献5：Johnston MV,et al.,2011,Lancet Neurol.10(4):372-82.doi:10.1016/S1474-4422(11)70016-3.

非专利文献6：Gluckman PD,et al.,2005,Lancet.365(9460):663-670.

非专利文献7：Shankaran S,et al.,2005,N Engl J Med.353(15):1574-1584.

非专利文献8：Azzopardi DV,et al.,2009,N Engl J Med.361(14):1349-1358.doi:10.1056/NEJMoa0900854.

非专利文献9：Simbruner G,et al.,2010,Pediatrics.126(4):e771-778.doi:10.1542/peds.2009-2441.

非专利文献10：Zhou WH,et al.,2010,J Pediatr.157(3):367-372,372.e1-3.doi:10.1016/j.jpeds.2010.03.030.

非专利文献11：Jacobs SE,et al.,2011,Arch Pediatr Adolesc Med.165(8):692-700.doi:10.1001/archpediatrics.2011.43.

发明内容

低体温疗法对于新生儿的有创性绝对不低。因而，该疗法应该应用于需要其的罹患nHIE的新生儿。然而，即使是罹患nHIE的新生儿，在严重程度为轻度的情况下，也不应该应用治疗。另外，重度的罹患nHIE的新生儿，即使应用了低体温疗法，改善也是有限的，大多预后不良，应用后也不可预测。因此，在被检验者即新生儿罹患了nHIE的情况下，在是否应用低体温疗法、预测应用该疗法后的预后方面，其严重程度是极其重要的信息。

如果使用所述专利文献1中公开的脑循环障碍检测标志物，则可以判定新生儿是否罹患nHIE。但是，在专利文献1中公开的发明中，并不能预测nHIE的严重程度、及低体温疗法治疗后的预后的状态。

本发明人等将住进新生儿重症监护室(NICU)的72名新生儿按照美国NICHD(National Institute of Child Health and Human Development：国立儿童健康与人类发展研究所)的nHIE诊断标准及Sarnat的nHIE严重程度分类分为正常组、nHIE轻度组、nHIE中度组及nHIE重度组这四组。使用出生后6小时以内从各组的新生儿所采集的血浆，测定该血浆中所含的LOX-1蛋白质中的可溶型肽的量，结果发现，该量与nHIE的严重程度、及低体温疗法治疗后的预后密切相关。也表明了，通过将每单位容量血浆的可溶型LOX-1蛋白质量规定为临界值，能够高特异性地测中新生儿的nHIE的严重程度、及低体温疗法治疗后的预后。本申请发明是基于这些新的见解而开发的，提供以下方案。

(1)一种判定nHIE患者的该疾病的严重程度的方法，包含下述工序：

测定从出生后6小时以内的受试者采集的血液中所含的由sLOX-1蛋白质或其片段构成的nHIE标志物的每单位体积的质量，得到测定值；及基于所述测定值判定所述受试者的nHIE的严重程度。

(2)根据(1)所述的方法，其中，所述测定值为330pg/mL以上时，判定所述受试者的nHIE的严重程度为中度以上。

(3)一种判定nHIE患者的低体温疗法的应用的方法，包含下述工序：测定从出生后6小时以内的受试者采集的血液中所含的由sLOX-1蛋白质或其片段构成的nHIE标志物的每单位体积的质量，得到测定值；及基于所述测定值判定是否需要对所述受试者应用低体温疗法。

(4)根据(3)所述的方法，其中，所述测定值为330pg/mL以上时，判定需要对所述受试者应用低体温疗法。

(5)一种预测nHIE患者的低体温疗法治疗后的预后的方法，包含下述工序：测定从出生后6小时以内的受试者采集的血液中所含的由sLOX-1蛋白质或其片段构成的nHIE标志物的每单位体积的质量，得到测定值；及基于所述测定值预测低体温疗法治疗后的所述受试者的预后。

(6)根据(5)所述的方法，其中，所述测定值低于1650pg/mL时，预测低体温疗法治疗后的所述受试者的预后良好。

(7)一种判定nHIE严重程度的器具，包含：血液收纳单元，收纳从受试者采集的血液；试剂单元，包含LOX-1检测试剂；反应单元，使sLOX-1或其片段与所述sLOX-1检测试剂进行反应；及提示单元，基于所述反应单元的检测结果提示所述受试者的nHIE的严重程度。

(8)根据(7)所述的器具，其中，所述检测结果即血液中所含的sLOX-1或其片段的量为330pg/mL以上时，所述提示单元提示为中度以上，或所述量低于330pg/mL时，所述提示单元提示为轻度。

(9)一种判定是否需要对nHIE患者应用低体温疗法的器具，包含：血液收纳单元，收纳从受试者采集的血液；试剂单元，包含sLOX-1检测试剂；反应单元，使sLOX-1或其片段与所述sLOX-1检测试剂进行反应，及提示单元，基于所述反应单元的检测结果提示所述受试者是否需要低体温疗法。

(10)根据(9)所述的器具，其中，所述检测结果即血液中所含的sLOX-1或其片段的量为330pg/mL以上时，所述提示单元提示需要低体温疗法，或所述量低于330pg/mL时，所述提示单元提示不需要低体温疗法。

(11)一种预测nHIE患者的低体温疗法治疗后的预后的器具，包含：血液收纳单元，收纳从受试者采集的血液；试剂单元，包含sLOX-1检测试剂；反应单元，使sLOX-1或其片段与所述sLOX-1检测试剂进行反应；及提示单元，基于所述反应单元的检测结果提示所述受试者的低体温疗法治疗后的预后。

(12)根据(11)所述的器具，其中，所述量低于1650pg/mL时，所述提示单元提示预后良好，。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请号2018-070037的公开内容。

根据本发明的nHIE严重程度判定方法，能够判定受试者即罹患nHIE的新生儿的nHIE的严重程度。

根据本发明的低体温疗法应用判定方法，能够判定是否应该对受试者即罹患nHIE的新生儿应用低体温疗法。

根据本发明的低体温疗法治疗预后预测方法，能够预测低体温疗法对受试者即罹患nHIE的新生儿的有效性。

附图说明

图1是示出出生后6小时以内采集的罹患nHIE的新生儿的血浆中的sLOX-1蛋白质量与nHIE严重程度的相关性的图。图中，○表示sLOX-1蛋白质量极高的样品。图中，

表示P<0.01vs轻度nHIE。

图2是示出出生后6小时以内采集的罹患nHIE的新生儿的血浆中的sLOX-1蛋白质量与对该新生儿施加了低体温疗法后的预后之间的相关性的图。图中，○表示sLOX-1蛋白质量极高的样品。图中，

表示P<0.01vs预后良好。

具体实施方式

1.新生儿缺氧缺血性脑病严重程度判定方法(nHIE严重程度判定方法)

1-1.概要

本说明书中的第一方案为判定新生儿缺氧缺血性脑病(nHIE)的严重程度的方法。本方法能够通过测定规定时间内从受试者采集的血液中所含的nHIE标志物的量来判定该受试者的nHIE的严重程度。

1-2.定义

下面，对本说明书中使用的下面的术语进行定义。

如上所述，“新生儿缺氧缺血性脑病(nHIE)”为新生儿的脑循环障碍的一种，是因重度新生儿窒息、急性呼吸循环衰竭或胎儿缺氧等而意外发病的疾病。

本说明书中，“严重程度”是指基于评价尺度的疾病的症状的程度。本说明书中，只要没有特别说明，则“严重程度”表示nHIE的严重程度。nHIE的严重程度不作限定，例如，如果基于美国NICHD的nHIE诊断标准(Shankaran S,et al.,2005,N Engl J Med.,353(15):1574-1584)或Sarnat的nHIE严重程度分类(Sarnat H.B.&Sarnat M.S.,1976,ArchNeurol.,33(10):696-705)，则能够分为四组(正常组、轻度组[stage 1]、中度组[stage2]、及重度组[stage 4])。

本说明书中，“判定严重程度”是指鉴定受试者的疾病的严重程度。本说明书中的疾病为nHIE，因此“判定严重程度”即是指鉴定受试者的nHIE的严重程度。

本说明书中，“nHIE标志物”为用于检测nHIE的生物标志物。本说明书中的nHIE标志物具体是指由LOX-1蛋白质、特别是可溶型LOX-1蛋白质、或其片段构成的肽标志物。

“LOX-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1：凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1)”蛋白质为使N端侧位于细胞质内，并使C端侧露出于细胞质外的单次跨膜型的膜蛋白。通过二硫键形成同型二聚体，并作为氧化低密度脂蛋白的清道夫受体起作用。我们知道，LOX-1蛋白质通过血小板、内皮细胞、血管平滑肌、神经元及巨噬细胞中的缺血再灌注损伤、活性氧、及炎性细胞因子诱导其的表达。

编码LOX-1蛋白质的LOX-1基因的表达会伴随着nHIE的发病而显著增加，因此其能够作为用于检测nHIE的生物标志物(专利文献1)。nHIE患者中，随着LOX-1基因表达的增加，作为其翻译产物的LOX-1蛋白质也会显著增加。因此，LOX-1蛋白质及其片段也能够作为在检测nHIE方面有用的生物标志物。

只要没有特别说明，则本说明书中的LOX-1蛋白质表示人LOX-1蛋白质。LOX-1蛋白质包含野生型及变异型。此处所说的“变异型”包含剪接变体、基于SNIPs等的突变体等。野生型LOX-1蛋白质具体为由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽。另外，变异型LOX-1蛋白质不作限定，例如，可列举：在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或者追加一个或者多个氨基酸而成的多肽、或相对于序列号1所示的氨基酸序列具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的氨基酸同源性的多肽。

本说明书中，“多个”是指例如2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。另外，“氨基酸同源性”是指，在进行比较的两个氨基酸序列中，以两者的氨基酸残基的一致数量达到最大限的方式，根据需要向一方或双方适当插入间隙并比对(对准)之后，氨基酸残基总数中的一致氨基酸残基数量的比例(％)。用于算出氨基酸同源性的两个氨基酸序列的比对能够使用Blast、FASTA、ClustalW等已知的程序来进行。

本说明书中，“(氨基酸的)取代”是指构成天然的蛋白质的20种氨基酸之间电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的保守氨基酸组内的取代。例如，可列举：具有低极性侧链的无电荷极性氨基酸组(Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Cys、Tyr)、支链氨基酸组(Leu、Val、Ile)、中性氨基酸组(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met、Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸组(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr、Cys)、酸性氨基酸组(Asp、Glu)、碱性氨基酸组(Arg、Lys、His)、芳香族氨基酸组(Phe、Tyr、Trp)内的取代。如果为这些组内的氨基酸取代，已知不易使多肽的性质产生变化，故优选。

本说明书中，“可溶型LOX-1蛋白质”(soluble form of LOX-1protein：本说明书中，经常记作“sLOX-1蛋白质”)是指由LOX-1蛋白质的细胞外区域构成的肽片段。LOX-1蛋白质在存在于细胞外结构域的N端侧的颈部结构域上存在蛋白酶敏感性高的位点。已知LOX-1蛋白质在该位点被切断的情况下，细胞外区域变为游离状态而释放至细胞外，从而出现在血液中(21,22)。在本发明中，测定血液中存在的LOX-1蛋白质及/或其片段的质量，因此，能够作为本发明的对象的nHIE标志物必然为sLOX-1蛋白质及/或其片段。sLOX-1蛋白质如果为野生型，则由相当于序列号1所示的氨基酸序列的91位～273位的183个氨基酸及94位～273位构成的多肽是符合的。

所述“其片段”表示所述sLOX-1蛋白质的片段。具体而言，由序列号2所示的sLOX-1蛋白质所含的连续6～182个、7～182个、8～182个、9～182个或10～182个氨基酸构成的多肽是符合的。

本说明书中，“受试者”是应用于本发明的方法或器具，并作为其对象的人类个体，更具体而言是指新生儿。在本发明的第一方案即nHIE严重程度判定方法、及下述的第二方案以后的发明中，以nHIE患者、即罹患nHIE的新生儿为对象。因而，原则上，在本发明的全部方案中作为对象的受试者为nHIE患者。但是，在本发明的全部方案中使用的nHIE标志物也能够检测是否罹患nHIE，因此，可以在判定nHIE严重程度的同时，也判定该受试者是否为nHIE患者。因此，在本发明的全部方案中，受试者也可以为未明确罹患nHIE的新生儿。

1-3.方法

本发明的nHIE严重程度判定方法包含测定值获取工序及严重程度判定工序作为必须的工序。下面，对各工序进行具体地说明。

1-3-1.测定值获取工序

“测定值获取工序”是测定血液中所含的nHIE标志物的每单位体积的质量，得到其测定值的工序。

本工序中用于测定的血液是出生后规定时间内从受试者采集的血液。“规定时间内”是指6小时以内、5小时以内、4小时以内、3小时以内、2小时以内、1小时以内、30分以内、或刚刚出生后(5分以内)。另外，本工序中用于测定的血液也可以为出生时得到的脐带血中从胎儿朝向母体的脐动脉血(出生时的脐动脉血)。此处所说的“血液”相当于全血、血清或血浆。可以使用任意的血液，但sLOX-1蛋白质的测定容易受凝血、溶血、间隙液的污染等影响。因而，优选的血液为不易受这些影响，且可以准确定量sLOX-1蛋白质的血浆。

作为本工序中的测定对象的nHIE标志物是如上所述那样能够存在于血液中的sLOX-1蛋白质及/或其片段。待测定值为每单位体积的血液中存在的nHIE标志物的质量。本工序中用于测定的血液的体积不作限定，例如，只要具有1μL～10μL、2μL～20μL、5μL～50μL、8μL～80μL、10μL～100μL、20μL～200μL、50μL～500μL、80μL～800μL、100μL～1mL、200μL～2mL、或500μL～5mL的范围内的血液量即可。

测定血液中的nHIE标志物的质量的方法只要为肽的定量方法，则不作特别限定。例如，能够利用免疫学检测法、适体解析法或质谱法等公知的定量方法。下面，对各定量法进行说明。

(1)免疫学检测法

“免疫学检测法”是使用与靶分子特异性结合的抗体或其片段对该靶分子定量的方法。作为免疫学检测法，例如，可以使用酶联免疫法(包含ELISA法、EIA法)、荧光免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、表面等离子体共振法(SPR法)、石英晶体微量天平(QCM)法、免疫比浊法、乳胶凝集免疫测定法、乳胶比浊法、血凝反应、颗粒凝集反应法、金胶体法、毛细管电泳法、蛋白质印迹法或免疫组化法(免疫染色法)中的任意一种。

本工序中，nHIE标志物能够作为该靶分子，因此所使用的抗体只要为能够识别并结合LOX-1的细胞外结构域的抗体即可。例如，可列举：抗LOX-1抗体、抗sLOX-1抗体。抗LOX-1抗体或抗sLOX-1抗体通过将sLOX-1蛋白质的全长或其中的一部分(例如，细胞外结构域的全部或一部分)作为抗原通过常规方法来制作即可。也能够使用市售的抗LOX-1抗体或抗sLOX-1抗体。抗体可以使用单克隆抗体或多克隆抗体中的任意一种。在抗体为多克隆抗体或单克隆抗体的情况下，构成其的免疫球蛋白可以为任意的类(例如，IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及IgY)或任意的子类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。抗体可以来自包括哺乳动物及鸟在内的任意的动物。作为抗体来源的动物，例如，可列举：兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、驴、绵羊、骆驼、骆马、羊驼、马、鸡或人等。

免疫学检测法中，基于多克隆抗体或单克隆抗体，也能够使用人为制作的抗体。作为这样的抗体，例如，可列举：重组抗体、合成抗体、及抗体片段。

“重组抗体”是使用基因重组技术制作的抗体，包含嵌合抗体、人源化抗体及多特异性抗体等。“嵌合抗体”是使用分子生物学方法将某个抗体的可变区(V区)用来自其它不同的动物的抗体的V区取代而成的抗体。例如，将与nHIE标志物特异性结合的小鼠抗sLOX-1单克隆抗体的V区与人抗体的V区替换，使用V区来自小鼠，C区域来自人的抗体是符合的。“人源化抗体”是将除人以外的哺乳动物、例如与nHIE标志物特异性结合的小鼠抗sLOX-1单克隆抗体或小鼠抗sLOX-1单克隆抗体的V区中的互补决定区(CDR；CDR1，CDR2及CDR3)取代为人单克隆抗体的CDR而成的接枝抗体。“多特异性抗体”是指在多价抗体即一个分子内具有多个抗原结合位点的抗体中，每个抗原结合位点与不同的表位结合的抗体。例如，如果为如IgG那样具有两个抗原结合位点的抗体，则可列举每个抗原结合位点与相同或不同的nHIE标志物特异性结合的双特异性抗体(Bispecific抗体)。

“合成抗体”是指通过使用化学方法或重组DNA法合成的抗体。例如，经由具有适当的长度及序列的接头肽等人工地使特定的抗体的一个以上轻链可变区(VL区)及一个以上重链可变区(VH区)连接而成的单体多肽分子、或其多聚体多肽是符合的。作为这样的多肽的具体例，可列举：单链Fv(scFv：single chain Fragment of variable region)(参照Pierce Catalog and Handbook,1994-1995,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)或四链抗体(tetrabody)等。在免疫球蛋白分子中，VL区及VH区通常位于不同的多肽链(轻链与重链)上。单链Fv是具有通过足够长度的柔性接头将这两个多肽链上的V区连接，并使其包含在一条多肽链中这样的结构的合成抗体片段。在单链Fv内中，两个V区能够彼此自组装而形成一个功能性抗原结合位点。能够通过使用公知技术将编码其的重组DNA组装于噬菌体基因组并使其表达而获得单链Fv。双链抗体是具有以单链Fv的二聚体结构为基础的结构的分子(Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。例如，在上述接头的长度比约12氨基酸残基更短的情况下，单链Fv内的两个可变位点不能自组装，但通过形成双链抗体，即，通过使两个单链Fv相互作用，可以使一个Fv链的VL区与另一个Fv链的VH区组装，从而能够形成两个功能性抗原结合位点(Marvin et al.,2005,Acta Pharmacol.Sin.26:649-658)。而且，通过在单链Fv的C端追加半胱氨酸残基，2条Fv链彼此的二硫键合成为可能，也能够形成稳定的双链抗体(Olafsen et al.,2004,Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27)。这种双链抗体为二价的抗体片段，每个抗原结合位点无需与相同的表位结合，其具有分别识别并特异性结合不同的表位的双特异性。与双链抗体相同，三链抗体及四链抗体也具有以单链Fv结构为基本的其三聚体及四聚体结构。分别为三价及四价的抗体片段，可以为多特异性抗体。

“抗体片段”相当于例如Fab、F(ab’₂)、Fv等。

(2)适体解析法

“适体解析法”是使用通过立体结构与靶物质牢固且特异性结合的适体来定量作为靶分子的nHIE标志物的方法。适体根据其分子的物种能够大致分为核酸适体和肽适体，可以为任意的适体。

“核酸适体”是指由核酸构成的适体。构成核酸适体的核酸可以为DNA、RNA或这些的组合中的任意一种。根据需要，也能够包含PNA、LNA/BNA、膦酸甲酯型DNA、硫代磷酸酯型DNA、2'-O-甲基型RNA等化学修饰核酸。

能够将nHIE标志物、即sLOX-1蛋白质的全长或其的一部分作为靶分子，并使用该领域中公知的方法，例如，SELEX(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment：配体指数富集的系统进化技术)法来制作核酸适体。SELEX法是公知的方法，作为具体的方法，例如，按照Pan等人(Proc.Natl.Acad.Sci.1995,U.S.A.92:11509-11513)进行即可。

肽适体是由氨基酸构成的适体，与抗体相同，它也是识别并特异性结合特定的靶分子的表面结构的1～6kD的肽分子。能够使用噬菌体展示法或细胞表面展示法来制造。作为肽适体的制造法，基于该领域公知的方法来制作即可。例如，能够参照Whaley,S.R.,etal.,2000,Nature,405,665-668。

上述抗体或适体可以根据需要被标记。标记中利用该领域公知的标志物质即可。在抗体及肽适体的情况下，例如，能够通过荧光色素(荧光素、FITC、罗丹明、德州红、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如，PE、APC、GFP)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、放射性同位素(例如，³H、¹⁴C、³⁵S)或生物素或者(链霉)亲和素进行标记。另外，在核酸适体的情况下，例如，可列举：放射性同位素(例如，³²P、³H、¹⁴C)、DIG、生物素、荧光色素(例如，FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA)、或发光物质(例如，吖啶酯)。被标志物质标记后的抗体或适体在检测与靶蛋白质结合后的适体时能够用作有用的工具。

(3)质谱法

作为“质谱法”，可列举：高效液相色谱质谱法(LC-MS)、高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱质谱法(GC-MS)、气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)、毛细管电泳质谱法(CE-MS)及ICP质谱法(ICP-MS)。

上述免疫学检测法、适体解析法及质谱法均为该领域中公知的技术，按照这些方法进行即可。例如，能够依据Green,M.R.and Sambrook,J.,2012,Molecular Cloning:ALaboratory Manual Fourth Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York；Christopher J.,et al.,2005,Chemical Review,105:1103-1169；Iijima Y.et al.,2008,.The Plant Journal,54,949-962；Hirai M.et al.,2004,ProcNatl Acad Sci USA,101(27)10205-10210；Sato S,et al.,2004,,The Plant Journal,40(1)151-163；Shimizu M.et al.,2005,Proteomics,5,3919-3931中记载的方法来进行。另外，许多制造商市售有各种肽定量试剂盒，也可以利用这些试剂盒。

1-3-2.严重程度判定工序

“严重程度判定工序”是基于所述测定值获取工序中得到的测定值来辅助nHIE的严重程度的判定的工序。在本工序中，将测定值中的规定的值设定为临界值，如果为该临界值以上，则判定所述测定值获取工序中使用的血液的提供者即受试者的nHIE的严重程度为中度以上，即中度或重度。

具体而言，所述临界值例如为310pg/mL，优选为320pg/mL，更优选为330pg/mL，进一步优选为335pg/mL。另一方面，在测定值低于所述临界值的情况下，也能够判定所述测定值获取工序中使用的血液的提供者即受试者的nHIE严重程度为轻度。

1-4.效果

根据本发明的nHIE严重程度判定方法，在通过使用出生后规定时间内采集的受试者(nHIE患者)的血液，以较高的特异度及测中率判定该受试者所罹患的nHIE的严重程度方面，能够辅助医生的诊断。另外，通过血液中的nHIE标志物量能够简易且客观地进行判定，因此，能够作为代替过去所利用的美国NICHD的nHIE诊断标准及Sarnat的nHIE严重程度分类的nHIE严重程度的新评价尺度。

2.低体温疗法应用判定方法

2-1.概要

本说明书中的第二方案是判定是否需要对nHIE患者应用低体温疗法的方法。本方法基于出生后规定时间内从受试者采集的血液中所含的nHIE标志物量的测定值进行预测。根据本发明的低体温疗法应用判定方法，能够容易地判定该受试者是否需要应用低体温疗法。

2-2.方法

本发明的低体温疗法应用方法包含测定值获取工序及低体温疗法应用判定工序作为必须的工序。下面，对各工序进行具体说明。

2-2-1.测定值获取工序

“测定值获取工序”是测定血液中所含的nHIE标志物的每单位体积的质量，得到其测定值的工序。本方案中的测定值获取工序与第一方案的nHIE严重程度判定方法中的测定值获取工序相同。因而，在此不予赘述。

2-2-2.低体温疗法应用判定工序

“低体温疗法应用判定工序”是基于所述测定值获取工序中得到的测定值来辅助判定是否对受试者应用低体温疗法的工序。本工序的基本构成与第一方案的nHIE严重程度判定方法中的严重程度判定工序相同。严重程度判定工序将规定的测定值设为临界值，如果为该临界值以上，则判定受试者的nHIE的严重程度为中度以上，而在本工序中，将与严重程度判定工序相同的测定值作为临界值，如果为该值以上，则判定受试者需要应用低体温疗法。即，在第一方案的严重程度判定工序中判定受试者的严重程度为中程度以上的情况下，在本方案的本工序中，则判定该受试者需要应用低体温疗法。

另一方面，也能够在测定值低于所述临界值的情况下，判定所述测定值获取工序中使用的血液的提供者即受试者不需要低体温疗法。这是因为，如果测定值低于该临界值，则根据第一方案的nHIE严重程度判定方法，受试者的nHIE严重程度为轻度。

2-3.效果

根据本发明的低体温疗法应用判定方法，通过使用出生后规定时间内采集的受试者(nHIE患者)的血液，能够以较高的特异度及测中率判定该受试者是否为应该应用低体温疗法的nHIE患者，能够辅助医生的诊断。

3.低体温疗法治疗预后预测方法

3-1.概要

本说明书中的第三方案是在对nHIE患者施加了低体温疗法的情况下预测该患者的预后的方法。本方法基于出生后规定时间内从受试者采集的血液中所含的nHIE标志物量的测定值来预测对受试者实施了低体温疗法治疗时的预后。根据本发明的低体温疗法治疗预后预测方法，能够预测低体温疗法对于该受试者的有效性。

3-2.方法

本发明的低体温疗法应用方法包含测定值获取工序及预后预测工序作为必须的工序。下面，对各工序进行具体地说明。

3-2-1.测定值获取工序

“测定值获取工序”是测定血液中所含的nHIE标志物的每单位体积的质量，得到其的测定值的工序。本方案中的测定值获取工序与第一方案的nHIE严重程度判定方法中的测定值获取工序基本相同。因而，在此，仅说明本方案的测定值获取工序中的特征点。

本发明的对象即受试者是罹患nHIE的新生儿。如第一方案的测定值获取工序中所述，本工序中使用的血液是受试者出生后规定时间内采集的血液。采集该血液时，受试者可以已经接受了低体温疗法，也可以为治疗前。无论受试者处于低体温疗法治疗前或已经开始治疗，本方案的低体温治疗预后预测方法均能够预测治疗后的预后。鉴于本发明是预测低体温疗法对于受试者的有效性的方法，优选治疗前的受试者为对象。这是因为，在预测即使接受了低体温疗法仍预后不良的情况下，能够进行如下判断等：选择除低体温疗法以外的其它有效的nHIE治疗法、或并用低体温疗法与其它有效的nHIE治疗法。

3-2-2.预后预测工序

“预后预测工序”是基于所述测定值获取工序中得到的测定值来预测将要进行或已经进行了低体温疗法治疗的受试者的预后是否良好的工序。

在本工序中，与第一方案的严重程度判定工序及第二方案的低体温疗法应用判定工序相同地，将规定的测定值设为临界值，并基于该临界值进行预后预测。具体而言，如果低于临界值，则预测低体温疗法治疗后的所述受试者的预后良好。

本工序中的临界值与第一及第二方案中设定的临界值不同。具体而言，例如为1400pg/mL，优选为1500pg/mL，更优选为1600pg/mL，进一步优选为1650pg/mL。如下述的实施例所示，如果测定值低于1610pg/mL，则特异度为60％，阳性测中率为约86％，接受了低体温疗法的受试者的预后良好。

另一方面，在测定值为所述临界值以上的情况下，受试者即使接受了低体温疗法，预后不良的可能性也很高。因而，在要实施低体温疗法的情况下，或实施了低体温疗法之后，需要预先探讨出院后的持续观察及紧急情况下的即时应对体制、或实施其它有效的治疗法。

3-3.效果

根据本发明的低体温疗法治疗预后预测方法，通过使用出生后规定时间内采集的受试者(nHIE患者)的血液，在对该受试者施加了低体温疗法的情况下、或已经开始施加治疗的情况下，能够预测之后的与nHIE相关的预后是否良好。

4.新生儿缺氧缺血性脑病严重程度判定器具(nHIE严重程度判定器具)

4-1.概要

本发明的第四方案是新生儿缺氧缺血性脑病严重程度判定器具(nHIE严重程度判定器具；nHIE严重程度判定设备)。本发明的判定器具能够通过使用出生后规定时间内从受试者采集的血液来简便且高测中率地判定该受试者的nHIE严重程度。因而，能够提供在医生诊断nHIE患者的严重程度方面有用的辅助信息。

4-2.构成

作为必须的构成要素，本发明的nHIE严重程度判定器具包含血液收纳单元、试剂单元、反应单元及提示单元，另外，作为可选的构成要素，其包含展开单元。展开单元能够进一步包含标记机构。下面，对各构成要素进行说明。本发明的判定器具不作限定，以从一个受试者中一次采集的血液作为检查对象。

4-2-1.血液收纳单元

“血液收纳单元”设置为收纳从受试者采集的血液。该部所收纳的血液不作限定，优选为受试者出生后规定时间内、例如出生后6小时以内从该受试者采集的血液。作为收纳的血液量，只要为判定nHIE患者的严重程度所需的最低限的量以上，则不作限定。虽然也依赖于试剂单元所含的sLOX-1检测试剂的灵敏度，但通常可以为50μL以上、100μL以上、200μL以上、500μL以上、800μL以上、或1.0mL以上，并且1.5mL以下、2.0mL以下、3.0mL以下、4.0mL以下、或5.0mL以下。

血液收纳单元可以为能够存留所收纳的血液的孔状的容器形状。在该情况下，血液收纳单元的原材料只要由不会使血液变性或不会因血液而导致变性的原材料构成，则不作限定。可列举：聚丙烯及聚苯乙烯等塑料、玻璃、或表面进行特殊涂布的纸张等原材料。另外，血液收纳单元也可以为容易吸收作为对象试样的血液的片状或棒状的形状。在该情况下，只要为由如无纺布或过滤器那样吸收作为对象试样的血液，不会使血液变性或因血液而导致变性的原材料构成即可。

在使用本发明的nHIE严重程度判定器具判定nHIE的严重程度的情况下，待检查血液可以滴加或含浸于血液收纳单元。

4-2-2.试剂单元

“试剂单元”设置为包含sLOX-1检测试剂。“sLOX-1检测试剂”是能够检测nHIE标志物即sLOX-1蛋白质或其片段(本说明书中，经常记作“sLOX-1蛋白质等”)的试剂，能够特异性识别并结合LOX-1的细胞外结构域及sLOX-1蛋白质等的物质是符合的。具体而言，例如，可列举第一方案的nHIE严重程度判定方法的测定值获取工序中测定血液中的nHIE标志物的质量的方法中所用的各种检测药物。作为具体例，包含抗LOX-1抗体或者抗sLOX-1抗体等或其片段、它们的化学修饰衍生物、或与LOX-1的细胞外结构域结合的LOX-1适体或sLOX-1适体。sLOX-1检测试剂可以固定于试剂单元内的载体表面，也可以在试剂单元内为游离状态。

作为试剂单元所含的sLOX-1检测试剂的量，只要是能够检测出判定nHIE患者的严重程度所需的最低限的量以上的血液中所含的nHIE标志物的量，则不作限定。

在nHIE严重程度判定器具中，试剂单元可以设于与所述血液收纳单元不同的部位。在该情况下，血液收纳单元中所收纳的血液与试剂单元所含的sLOX-1检测试剂设置为分别通过流道而送至下述的反应单元。另外，也能够将血液收纳单元与试剂单元设置在相同部位，并作为血液收纳单元兼试剂单元(血液收纳单元/试剂单元)。在该情况下，血液收纳单元内包含sLOX-1检测试剂，所收纳的血液立刻与sLOX-1检测试剂反应。因此，血液收纳单元/试剂单元也能够兼作接着将说明的反应单元。

4-2-3.反应单元

“反应单元”设置为作为所述血液中所含的sLOX-1蛋白质等与sLOX-1检测试剂能够进行反应的场所起作用。只要为能够提供两者的反应得以进行的条件的单元即可，其构成不作特别限定。例如，只要将其设置为作为具备如下条件的场所起作用即可：如果sLOX-1检测试剂为抗sLOX-1抗体，则抗sLOX-1抗体能够与所收纳的血液中所含的sLOX-1蛋白质等结合，从而形成抗原抗体复合物。

4-2-4.展开单元

“展开单元”是能够作为使反应单元中生成的反应物流动至下述的提示单元的流道的单元，它是本发明的判定器具中的可选的构成要素。在本发明的判定器具中，反应单元与提示单元设置在不用的位置的情况下，展开单元能够作为联络两个单元的单元起作用。展开单元的结构不作限定，可列举槽状或管状的流道。

(1)标记机构

展开单元可以包含标记机构。“标记机构”是在反应单元中生成的反应物到达提示单元之前进行反应物标记的机构。标记机构设置为通过标志物质标记反应物。标记机构的具体构成不作限定，例如，可以设置为：使所述反应单元中血液中的sLOX-1蛋白质等与sLOX-1检测试剂结合而形成的复合物被与该复合物中的sLOX-1检测试剂或sLOX-1蛋白质等特异性结合的标记二抗等所标记。

作为标志物质，使用该领域中常用的物质即可，不作限定。例如，可列举通过下述物质标记：荧光色素(包含FITC、罗丹明、德州红、Cy3、Cy5等)、荧光蛋白质(例如，包含PE、APC、GFP、EGFP等)、酶(例如，包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等)、或生物素、亲和素、或者链霉亲和素等。

需要指出，标记机构可以包含于所述反应单元或下述的提示单元。

4-2-5.提示单元

“提示单元”设置为能够基于所述反应单元的检测结果、即反应单元中生成的反应物的量来提示所述受试者的nHIE严重程度。具体而言，只要设置为如下即可：血液中所含的sLOX-1蛋白质等的量为330pg/mL以上时，能够以例如阳性反应来提示nHIE严重程度为中度以上。也可以设置为：相反地，血液中所含的sLOX-1蛋白质等的量低于330pg/mL时，能够以例如阴性反应提示nHIE严重程度为轻度。

提示的方式不限。只要设置为如下即可：例如，在nHIE严重程度判定器具包含所述标记机构的情况下，如果复合物通过标志物质而显色，则能够在nHIE严重程度判定器具上的任意的部位提示该显色，另外，如果标志物质为荧光物质或发光物质，则能够在nHIE严重程度判定器具上的任意的部位提示该荧光或发光。

作为本方案的nHIE严重程度判定器具的具体例，可列举本技术领域公知的免疫层析试纸等。市售的妊娠诊断药物等具有与之相同的形态及原理。免疫层析试纸的有创性极低，丝毫不会对受试者带来苦痛及使用试剂造成的危险性。另外，在能够低成本地大量生成方面，优选试纸。

5.判定是否需要应用低体温疗法的器具

5-1.概要

本发明的第五方案是判定是否需要应用低体温疗法的器具(判定是否需要应用低体温疗法的器件)。本发明的判定器具能够通过使用出生后规定时间内从受试者采集的血液来简便且高测中率地判定nHIE患者即受试者是否需要应用低体温疗法。因而，能够提供在医生诊断是否应该对受试者应用低体温疗法方面有用的辅助信息。

5-2.构成

作为必须的构成要素，本发明的判定是否需要应用低体温疗法的器具包含血液收纳单元、试剂单元、反应单元及提示单元，另外，作为可选的构成要素，其包含展开单元。展开单元能够进一步包含标记机构。这些构成与所述第四方案的nHIE严重程度判定器具的各单元的构成基本相同。因此，下面，将省略关于两个器具中具有相同的构成的单元(血液收纳单元、试剂单元、反应单元、及展开单元)及机构(标记机构)的说明，仅对部分构成与nHIE严重程度判定器具不同的提示单元进行说明。

5-2-1.提示单元

本方案的判定是否需要应用低体温疗法的器具的提示单元的基本构成也与上述的nHIE严重程度判定器具的提示单元相同。但是，所提示的信息与nHIE严重程度判定器具不同。即，nHIE严重程度判定器具的提示单元设置为能够提示受试者的nHIE严重程度，而本方案的判定是否需要应用低体温疗法的器具的提示单元设置为能够提示受试者是否需要低体温疗法。

具体而言，只要设置为如下即可：血液中所含的sLOX-1蛋白质等的量为330pg/mL以上时，能够以例如阳性反应来提示提供血液的受试者需要应用低体温疗法。

还可以设置为：相反地，血液中所含的sLOX-1蛋白质等的量低于330pg/mL时，能够以例如阴性反应来提示提供血液的受试者不需要应用低体温疗法。

提示的方式不限。只要设置为如下即可：例如，在判定是否需要应用低体温疗法的器具包含所述标记机构的情况下，如果复合物通过标志物质而显色，则能够在判定是否需要应用低体温疗法的器具上的任意的部位提示该显色，另外，如果标志物质为荧光物质或发光物质，则能够在判定是否需要应用低体温疗法的器具上的任意的部位提示该荧光或发光。

6.低体温疗法治疗预后预测器具

6-1.概要

本说明书中的第六方案是低体温疗法治疗预后预测器具。本方案的低体温疗法治疗预后预测器具能够通过使用出生后规定时间内从受试者采集的血液而在对nHIE患者即受试者施加了低体温疗法的情况下简便且高测中率地预测该受试者的预后。因而，基于本方案的低体温疗法治疗预后预测器具的预测结果，能够向医生提供与低体温疗法的治疗的必要性、以及在施加了低体温疗法的情况下与出院后的继续观察及突发事件时的即时应对制的必要性相关的信息。

6-2.构成

作为必须的构成要素，本发明的低体温疗法治疗预后预测器具包含血液收纳单元、试剂单元、反应单元及提示单元，另外，作为可选的构成要素，其包含展开单元。展开单元能够进一步包含标记机构。这些构成与所述第四方案的nHIE严重程度判定器具的各单元的构成基本相同。因此，将省略关于两种器具中具有相同的构成的单元(血液收纳单元、试剂单元、反应单元及展开单元)及机构(标记机构)的说明，下面，仅对部分构成与nHIE严重程度判定器具不同的提示单元进行说明。

6-2-1.提示单元

本方案的低体温疗法治疗预后预测器具的提示单元的基本构成也与上述的nHIE严重程度判定器具的提示单元相同。但是，所提示的信息与nHIE严重程度判定器具不同。即，nHIE严重程度判定器具的提示单元设置为能够提示受试者的nHIE严重程度，而本方案的低体温疗法治疗预后预测器具的提示单元设置为能够提示对受试者施加了低体温疗法后的预后预测。

具体而言，设置为如下即可：血液中所含的sLOX-1蛋白质等的量低于1650pg/mL时，则能够以例如阴性反应来提示如果对提供血液的受试者施加低体温疗法该受试者的预后良好。

也可以设置为：相反地，血液中所含的sLOX-1蛋白质等的量为1650pg/mL以上时，能够例如以阳性反应来提示即使对提供血液的受试者施加了低体温疗法该受试者的预后也不良。在该情况下，能够采用除低体温疗法以外的其它有效的nHIE治疗法、或探讨并用低体温疗法与其它有效的nHIE治疗法。另外，需要理解，即使在对该受试者施加了低体温疗法的情况下，受试者的改善迹象也是有限的，可以进行事先准备，例如，提前准备对于出院后的受试者的跟进、及复发导致的异常发病时的即时应对体制等。

提示的方式不限。只要设置为如下即可：例如，在低体温疗法治疗预后预测器具包含所述标记机构的情况下，如果复合物通过标志物质而显色，则能够在低体温疗法治疗预后预测器具上的任意的部位提示该显色，另外，如果标志物质为荧光物质或发光物质，则能够在低体温疗法治疗预后预测器具上的任意的部位提示该荧光或发光。

本发明也可以包含作为包含第四方案～第六方案所述的器具的任意之一或它们的组合的试剂盒的方案。在该情况下，除所述各方案的器具之外，本方案的试剂盒还可以包含标记的检测所需的底物、载体、清洗缓冲液、试样稀释液、酶底物、反应停止液、标记二抗及使用说明书等。

实施例

<方法>

(1)血液样品的获取

从2014年6月至2017年5月期间住进合作设施(埼玉县立儿童医疗中心、东京都儿童综合医疗中心、青梅市立综合医院及东京大学医学部附属医院)的新生儿重症监护室(NICU)的新生儿获取血液样品。作为采血对象的新生儿的条件为：怀孕期36周以上，出生时的体重为1800g以上，且没有染色体异常、先天性感染、先天性心脏病及畸形等异常，从满足这些条件的72名新生儿采血。关于这些血液样品的使用，从新生儿的双亲获得了知情同意书。另外，本实施例中进行的实验均获得了国家研究开发法人国立精神及神经医疗研究中心、及设施合作伦理委员会批准。

(2)采血及血浆中的sLOX-1蛋白质量的测定

住进NICU时，使用EDTA-2K管从所述72名新生儿的静脉或动脉采血0.5mL。采血后，立即在4℃、3000rpm下将血液离心分离15分钟，然后，获得其上清作为血浆样品。测定之前，血浆样品储存在-80℃。出生后第0、1、2-4及5-9天进行血液采样。

通过使用2种抗sLOX-1单克隆抗体的夹心ELISA法(外包)，按照Inoue N等人(ClinChem.,2010,56(4):550-558)中记载的方法测定血浆样品中的sLOX-1蛋白质量。由从临床信息中得到的严重程度及出院时的症状、检查数据来评价测定结果。

(3)受试者的临床概况及评价

关于nHIE的诊断及其严重程度，使用美国NICHD的nHIE诊断标准(确认到下述中的任意一项：1.脐带血或出生后60分以内的采血中显示较强的酸中毒(血气分析获知pH为7.0以下，或者碱剩余(base excess)为16mmol/L以上)；2.围产期的急性事件(胎盘剥落等)、以及APGAR评分(10分后)5以下、或者出生后10分以上复苏(辅助性换气))，通过Sarnat的改良型nHIE严重程度分类，将作为受试者的解析对象即72名新生儿分为正常组、nHIE轻度组、nHIE中度组及nHIE重度组这四组。具体而言，调查意识水平、自主性活动、姿势、肌肉紧张、原始反射(吸吮反射及Moro反射等)及自主神经系统功能(瞳孔及心率等)这6个类别的神经学状态，将3个类别以上具有异常的新生儿划分为中度nHIE或重度nHIE，具有2个类别以下的异常的新生儿划分为nHIE轻度。关于中度及重度，通过各自的迹象数量进行分类，在迹象的分布相同的情况下，按照意识水平来区别。

其结果，各组的详细分类为：正常组45名、nHIE轻度组6名、nHIE中度组16名、及nHIE重度组5名。将正常组45名中得到出生后6小时以内的样品的38名用作对照。

为了评价出院时的结果，将进食障碍、听力障碍、癫痫发作及麻痹定义为重度。进食障碍定义为需要管饲的情况，听力障碍定义为对于80dB的听性脑干反应无响应或响应较弱的情况。

(4)统计分析

统计分析中使用统计解析软件(SPSS Statistics ver.24.0；IBM)。在轻度nHIE组(低体温疗法不适应组)与中重度nHIE组(低体温疗法适应组)这二组之间，通过Mann-Whitney检验比较sLOX-1蛋白质量，制作接受者操作特性曲线(ROC)，算出曲线下面积(AUC)，设置用于区分轻度nHIE与中重度nHIE的适当的临界值。临界值采用534pg/mL、382pg/mL及334pg/mL，划分为血浆中的sLOX-1蛋白质量示出各临界值以上的阳性受试者、及示出低于临界值的阴性受试者。

使用本疾病的罹患率与由ROC曲线算出的灵敏度及特异度，算出阳性测中率(PPV)及阴性测中率(NPV)。具体而言，算出基于临界值判定为阳性的受试者中的中重度的nHIE患者的比例作为阳性测中率，另外，算出判定为阴性的受试者中的轻度的nHIE患者的比例作为阴性测中率。

接着，比较出院时的各新生儿的预后(结局)。为了测试作为sLOX-1蛋白质的出院时的预后标志物的性能，制作ROC曲线，并与上述相同地示例灵敏度与特异度、阳性测中率、阴性测中率。临界值采用1630pg/mL、1620pg/mL及1500pg/mL，划分为血浆中的sLOX-1蛋白质量示出低于各临界值的阳性受试者、及示出临界值以上的阴性受试者。

关于预后良好预测，算出基于临界值判定为阳性的受试者中的预后良好的nHIE患者的比例作为阳性测中率，另外，算出判定为阴性的预后不良的受试者中的nHIE患者的比例作为阴性测中率。

<结果>

(严重程度与判定结果)

将结果示于表1～3及图1。

[表1]sLOX-1≥534pg/mL

[表2]sLOX-1≥382pg/mL

[表3]sLOX-1≥334pg/mL

在所有的临界值下，阳性测中率均显示出高达85％以上的值。另外，各自的灵敏度也为80％以上，这表示假阴性率为20％以下。由以上的结果表明，通过将临界值设置为330pg/mL，如果测定值为该值以上，则能够判定为中度nHIE以上的严重程度。

(预后良好预测及判定结果)

将结果示于表4～6、及图2。

[表4]sLOX-1<1620pg/mL

[表5]sLOX-1<1610pg/mL

[表6]sLOX-1<1500pg/mL

在所有的临界值中，阳性测中率均示出高达84％以上的值。即，如果出生后规定时间内从受试者采集的血液中所含的nHIE标志物量低于所设置的临界值，在对该受试者施加了低体温疗法的情况下，能够预测84％以上预后良好。另外，在所有临界值中，特异度(预后不良的5名受试者中，通过本发明的方法预测为阴性、即预测为预后不良的比率)均为60％。由以上的结果表明，通过将临界值设置为1650pg/mL，如果测定值低于该值，则能够判定施加了低体温疗法后的预后良好。

本说明书中所引用的全部刊物、专利及专利申请均直接通过引用结合在本说明书中。

序列表

<110> 国立研究开发法人国立精神•神经医疗研究中心(National Center ofNeurology and Psychiatry)

<120> 新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度判定方法及预后预测方法

<130> PH-7851-PCT

<150> JP 2018-070037

<151> 2018-03-30

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Thr Phe Asp Asp Leu Lys Ile Gln Thr Val Lys Asp Gln Pro Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ser Asn Gly Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gln Phe Leu Tyr Ser

20 25 30

Pro Trp Trp Cys Leu Ala Ala Ala Thr Leu Gly Val Leu Cys Leu Gly

35 40 45

Leu Val Val Thr Ile Met Val Leu Gly Met Gln Leu Ser Gln Val Ser

50 55 60

Asp Leu Leu Thr Gln Glu Gln Ala Asn Leu Thr His Gln Lys Lys Lys

65 70 75 80

Leu Glu Gly Gln Ile Ser Ala Arg Gln Gln Ala Glu Glu Ala Ser Gln

85 90 95

Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala Arg Lys

100 105 110

Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gln Met Glu Leu His His Gln Asn Leu

115 120 125

Asn Leu Gln Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala Pro Cys

130 135 140

Pro Gln Asp Trp Ile Trp His Gly Glu Asn Cys Tyr Leu Phe Ser Ser

145 150 155 160

Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu Lys Cys Leu Ser Leu Asp

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Ala Asp Leu Asp Phe Ile Gln

180 185 190

Gln Ala Ile Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe Trp Met Gly Leu Ser Arg

195 200 205

Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Met

210 215 220

Pro His Leu Phe Arg Val Arg Gly Ala Val Ser Gln Thr Tyr Pro Ser

225 230 235 240

Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Ala Val Tyr Ala Glu Asn Cys

245 250 255

Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys Lys Ala Asn Leu Arg Ala

260 265 270

Gln

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Ala Glu Glu Ala Ser Gln Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met Ile

1 5 10 15

Glu Thr Leu Ala Arg Lys Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gln Met Glu

20 25 30

Leu His His Gln Asn Leu Asn Leu Gln Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala

35 40 45

Asn Cys Ser Ala Pro Cys Pro Gln Asp Trp Ile Trp His Gly Glu Asn

50 55 60

Cys Tyr Leu Phe Ser Ser Gly Ser Phe Asn Trp Glu Lys Ser Gln Glu

65 70 75 80

Lys Cys Leu Ser Leu Asp Ala Lys Leu Leu Lys Ile Asn Ser Thr Ala

85 90 95

Asp Leu Asp Phe Ile Gln Gln Ala Ile Ser Tyr Ser Ser Phe Pro Phe

100 105 110

Trp Met Gly Leu Ser Arg Arg Asn Pro Ser Tyr Pro Trp Leu Trp Glu

115 120 125

Asp Gly Ser Pro Leu Met Pro His Leu Phe Arg Val Arg Gly Ala Val

130 135 140

Ser Gln Thr Tyr Pro Ser Gly Thr Cys Ala Tyr Ile Gln Arg Gly Ala

145 150 155 160

Val Tyr Ala Glu Asn Cys Ile Leu Ala Ala Phe Ser Ile Cys Gln Lys

165 170 175

Lys Ala Asn Leu Arg Ala Gln

180

Claims

1.一种判定新生儿缺氧缺血性脑病患者的该疾病的严重程度的方法，包含下述工序：

测定从出生后6小时以内的受试者采集的血液中所含的由可溶型LOX-1蛋白质或其片段构成的新生儿缺氧缺血性脑病标志物的每单位体积的质量，得到测定值的工序；及

基于所述测定值判断所述受试者的新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，

其中，所述测定值为330pg/mL以上时，判定所述受试者的新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度为中度以上。

3.一种判定新生儿缺氧缺血性脑病患者的低体温疗法的应用的方法，包含下述工序：

基于所述测定值判定是否需要对所述受试者应用低体温疗法的工序。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，

所述测定值为330pg/mL以上时，判定需要对所述受试者应用低体温疗法。

5.一种预测新生儿缺氧缺血性脑病患者低体温疗法治疗后的预后的方法，包含下述工序：

基于所述测定值预测低体温疗法治疗后的所述受试者的预后的工序。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，

所述测定值低于1650pg/mL时，预测低体温疗法治疗后的所述受试者的预后良好。

7.一种判定新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度的器具，包含：

血液收纳单元，收纳从受试者采集的血液；

试剂单元，包含可溶型LOX-1检测试剂；

反应单元，使可溶型LOX-1或其片段与所述可溶型LOX-1检测试剂进行反应；及

提示单元，基于所述反应单元的检测结果提示所述受试者的新生儿缺氧缺血性脑病的严重程度。

8.根据权利要求7所述的器具，其中，

所述检测结果即血液中所含的可溶型LOX-1或其片段的量为330pg/mL以上时，所述提示单元提示为中度以上，或

所述量低于330pg/mL时，所述提示单元提示为轻度。

9.一种判定是否需要对新生儿缺氧缺血性脑病患者应用低体温疗法的器具，包含：

血液收纳单元，收纳从受试者采集的血液；

试剂单元，包含可溶型LOX-1检测试剂；

提示单元，基于所述反应单元的检测结果提示所述受试者是否需要低体温疗法。

10.根据权利要求9所述的器具，其中，

所述检测结果即血液中所含的可溶型LOX-1或其片段的量为330pg/mL以上时，所述提示单元提示需要低体温疗法，或

所述量低于330pg/mL时，所述提示单元提示不需要低体温疗法。

11.一种预测新生儿缺氧缺血性脑病患者的低体温疗法治疗后的预后的器具，包含：

血液收纳单元，收纳从受试者采集的血液；

试剂单元，包含可溶型LOX-1检测试剂；

提示单元，基于所述反应单元的检测结果提示所述受试者的低体温疗法治疗后的预后。

12.根据权利要求11所述的器具，其中，

所述量低于1650pg/mL时，所述提示单元提示预后良好。