CN111918679B - 包含核酸、骨移植材料和阳离子高分子的骨移植用组合物及用于制备其的骨移植用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含核酸、骨移植材料以及阳离子高分子的骨移植用组合物以及用于制备该组合物的骨移植用试剂盒。确认了本发明的骨移植用组合物能够促进应对生理学应力的缓冲力形成与移植部位的新生骨形成，并确认了骨移植手术的便利性的增加，从而有望可以有用地用于治疗骨疾病。

Description

包含核酸、骨移植材料和阳离子高分子的骨移植用组合物及 用于制备其的骨移植用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种包含核酸、骨移植材料以及阳离子高分子的骨移植用组合物以及用于制备该组合物的骨移植用试剂盒。

背景技术

最近，骨骼系统相关疾病正在高频度增加。另外，由于体育运动的发展以及对提高生活品质的需求增大等，患有骨组织相关疾病的患者日益增加。

为了修复因人类先天或后天骨骼疾病导致的骨骼变形以及因外部刺激或损伤导致的骨骼缺损部位，向患者移植能够替代骨骼的移植材料。此时使用的骨移植材料根据来源而可以分为自体骨、同种骨、异种骨、合成骨。这种骨移植材料中，骨诱导性和骨形成能力卓越的自体骨被评价为最理想的骨移植材料，但需要用于取得自体骨的附加性手术，因而存在的缺点是由此引发并发症和恢复期增加，当需要大量骨骼时无法获得充足的量，而且采骨需要更多附加手术时间等。

为了克服这种问题，正在持续开发和研究用于替代自体骨的多样种类的骨移植材料，最近正在广泛进行合成骨移植材料相关研究，为了促进骨形成，同时适用现有的合成骨与骨传导性物质、骨诱导性物质的研究也在活跃进行。

另外，也正在进行对支撑损伤或缺损的骨部位并从周边组织诱导在缺损部位形成新的新生骨的骨支撑体(scaffold)的研究。这种以诱导骨形成为目的的骨支撑体的理想目标在于，生物活性优秀，无感染和炎症反应，骨骼缺损部位的支撑以及填充容易，通过具有体内分解性的三维结构，不仅具有作为骨传导性物质的通路的功能，而且应具有能够应对施加于移植部位的生理学应力的缓冲力(Guarino V.等人，2007)。但是，在体内活性卓越、吸收性良好的情况下，存在缓冲力低下的冲突点，因此，开发一种完善、改善这种冲突点的支撑体很重要。

因此，本发明人在利用核酸以及阳离子高分子混合物进行骨再生研究过程中，确认了借助于核酸以及阳离子高分子间的结合而保持骨移植材料并形成凝聚体。另外，确认了所形成的凝聚体能够防止骨移植材料瓦解分散，并可以制备成恒定形状的凝聚体，以增大骨移植手术的便利性，且能够通过恒定地保持凝聚体形状的持续性、能够吸收冲击的缓冲力而提供能够诱导骨形成的适合环境，从而完成了本发明。

作为以往现有技术，韩国授权专利第1488716号记载了包含PDRN(核酸)与壳聚糖(阳离子高分子)的牙槽骨再生用试剂盒，但未记载本发明的借助于核酸以及阳离子高分子间的结合而实现骨移植材料的凝聚以及据此增加骨移植时手术便利性的效果。另外，韩国授权专利第1161784号记载了包含核酸或壳聚糖的骨粉的凝聚剂，但未记载本发明的借助于核酸以及阳离子高分子间的结合而实现骨移植材料凝聚的效果。欧洲公开专利第2745849号记载了包含PDRN以及壳聚糖的组合物及其的再生医学所需的细胞增殖促进效果，韩国授权专利第1710615号记载了包含核酸以及壳聚糖的填充液以及其真皮层存活率增加效果，但两项发明均未记载本发明的用于形成骨移植材料凝聚体的核酸以及壳聚糖的作用及其效果。

作为非专利文献，Kim,S.K.等人记载了PDRN的骨再生促进效果，但未记载本发明的通过核酸以及阳离子高分子间的结合来增加骨移植材料凝聚以及骨移植手术便利性的效果。作为又一非专利文献，Martin R.V.等人记载了在组织再生领域中壳聚糖的支撑体以及骨再生功能，但未记载以及提及本发明的通过核酸以及壳聚糖间的结合而实现的骨移植材料凝聚效果。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种包含核酸、骨移植材料以及阳离子高分子的骨移植用组合物以及用于制备该组合物的骨移植用试剂盒。

用于解决问题的手段

本发明涉及一种骨移植用组合物，其包含a)核酸，b)骨移植材料，以及c)阳离子高分子；所述a)核酸与c)阳离子高分子间的结合保持b)骨移植材料以构成凝聚体。

所述骨移植用组合物可以通过如下步骤制备：第一步骤，在a)核酸中混合b)骨移植材料以制备核酸-骨移植材料混合物；以及第二步骤，在所述核酸-骨移植材料混合物中添加c)阳离子高分子，以保持骨移植材料来制备凝聚体。

所述骨移植用组合物可以通过如下步骤制备：第一步骤，在c)阳离子高分子中混合b)骨移植材料以制备阳离子高分子-骨移植材料混合物；以及第二步骤，在所述阳离子高分子-骨移植材料混合物中添加a)核酸，以保持骨移植材料来制备凝聚体。

所述结合可以为离子键。

所述骨移植用组合物可以为核酸以及阳离子高分子按1～20：1重量比混合的。

所述核酸以骨移植用组合物总重量为基准，可以包含0.001～2重量％。

所述核酸可以为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或它们的混合物。

所述核酸的分子量可以为1～100,000kDa。

所述阳离子高分子以骨移植用组合物总重量为基准，可以包含0.001～2重量％。

所述阳离子高分子可以为选自由壳聚糖(chitosan)、聚乙烯胺(polyethyleneamine)、聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)以及聚丙烯胺(polyallylamine)构成的组的一种以上，优选地，为壳聚糖。

所述骨移植材料可以为自体骨的脱钙骨基质、同种骨的脱钙骨基质、异种骨的脱钙骨基质、合成骨移植材料、自体骨粉碎物或它们的混合物。

所述骨移植用组合物可以追加包含骨形成活性剂。

所述骨形成活性剂可以为生长因子(growth factor)、止血剂或它们的混合物。

所述生长因子可以为选自由骨形成蛋白质(bone morphogenetic protein，BMP)、骨涎蛋白质(bone sialoprotein)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、富血小板血浆(plateletrich plasma，PRP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein)、多聚脱氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide)、肝素结合表皮生长因子(heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)、钙粘蛋白EGF LAG七经G-型受体3(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3)以及成骨细胞特异性钙粘蛋白(osteoblast specific cadherin，OB-cadherin)构成的组的一种以上。

所述止血剂可以为选自由凝血酶(thrombin)、促凝血酶原激酶(thromboplastin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、酪蛋白激酶Ⅱ(casein-kinaseⅡ)、组织因子(tissue factor)、肾上腺素(epinephrine)、明胶(gelatin)、维生素K(vitamine K)、氯化钙(calcium chloride)、六水合氯化铝(aluminium chloride-hexahydrate)以及硫酸铝(aluminium sulfate)构成的组的一种以上。

另外，本发明涉及一种用于制备所述骨移植用组合物的骨移植用试剂盒，其包含a-1)核酸溶液、b)骨移植材料以及c-1)阳离子高分子溶液。

所述骨移植用试剂盒可以追加包含骨形成活性剂。

下面详细说明本发明。

本发明涉及一种骨移植用组合物，包含：a)核酸、b)骨移植材料、以及c)阳离子高分子；所述a)核酸与c)阳离子高分子间的结合保持(holding)b)骨移植材料而构成凝聚体。

所述骨移植用组合物借助于所述a)核酸以及c)阳离子高分子间出现的结合来保持b)骨移植材料而形成凝聚体，为了制备所述骨移植用组合物，a)核酸、b)骨移植材料以及c)阳离子高分子的混合顺序很重要。

所述骨移植用组合物可以通过如下步骤制备：第一步骤，在a)核酸中混合b)骨移植材料以制备核酸-骨移植材料混合物；以及第二步骤，在所述核酸-骨移植材料混合物中添加c)阳离子高分子来保持骨移植材料以制备凝聚体；或者，通过如下步骤制备：第一步骤，在c)阳离子高分子中混合b)骨移植材料以制备阳离子高分子-骨移植材料混合物；以及第二步骤，向所述阳离子高分子-骨移植材料混合物中添加a)核酸来保持骨移植材料以制备凝聚体。

在所述骨移植用组合物的制备步骤中，在混合a)核酸与c)阳离子高分子后添加b)骨移植材料的情况下，首先实现核酸与阳离子高分子间的结合，无需骨移植材料的保持，即可形成只包含核酸以及阳离子高分子的凝聚体，因而会不适合制备本发明的骨移植用组合物。

所述保持(holding)，可以意味着在a)核酸与c)阳离子高分子间实现结合的过程中，抓住b)骨移植材料的颗粒或者使之固定以使骨移植材料凝聚或不分散的状态，另外，可以意味着在因a)核酸与c)阳离子高分子间的结合而形成的复合体内部，包含或编入b)骨移植材料颗粒以形成凝聚体。

所述骨移植材料被保持的状态，即使在外部冲击以及环境变化下也可以维持其状态。

所述结合可以为离子键。

所述离子键作为借助于核酸的阴离子与阳离子高分子的阳离子间的静电引力而产生的键，使得所述骨移植用组合物形成稳定状态的凝聚体。

所述骨移植用组合物可以是核酸以及阳离子高分子按1～20：1重量比混合而成的，优选地，为2～10：1重量比。在超出所述核酸以及阳离子高分子的重量比的情况下，本发明的骨移植用组合物无法凝聚，因而不优选。

所述核酸以骨移植用组合物总重量为基准，可以包含0.001～2重量％。优选地，为0.01～2重量％，更优选地，为0.1～2重量％，最优选地，为1～2重量％。在所述核酸包含不足0.001重量％的情况下，无法实现骨移植材料的凝聚，在核酸超过2重量％的情况下，在组合物制备过程中，核酸会无法正常溶解，因而不优选。

所述核酸用于与本发明的阳离子高分子实现结合来保持骨移植材料以形成凝聚体，可以为以碱、糖、磷酸构成的核苷酸(nucleotide)通过磷酸键进行聚合而形成长链状分子的高分子物质。优选地，可以为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或它们的混合物，更优选地，为脱氧核糖核酸。

所述脱氧核糖核酸可以为从动物或植物提取并制备的脱氧核糖核酸，优选地，可以为从鱼类提取并制备的脱氧核糖核酸，更优选地，可以为从鱼类的精液或精巢提取并制备的寡核苷酸(oligonucleotide)、多聚核苷酸(polynucleotide)、多聚脱氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide)或它们的混合物。

所述鱼类可以为鲑鱼科，优选地，为鳟鱼或鲑鱼，最优选地，为鲑鱼。

所述核酸的分子量可以为1～100,000kDa。优选地，为10～10,000kDa，最优选地，为50～3,500kDa。在所述核酸的分子量不足1kDa的情况下，骨移植材料会不容易凝聚，在超过100,000kDa的情况下，会难以溶解，因而不优选。

所述阳离子高分子以骨移植用组合物总重量为基准，可以包含0.001～2重量％。优选地，为0.01～2重量％，更优选地，为0.1～2重量％，最优选地，为1～2重量％。在所述阳离子高分子包含不足0.001重量％的情况下，骨移植材料无法实现凝聚，在超过2重量％的情况下，在组合物制备过程中难以溶解，因而不优选。

所述阳离子高分子用于与本发明的核酸构成离子键来保持骨移植材料以形成凝聚体，从生物相容性角度而言，可以为选自由壳聚糖(chitosan)、聚乙烯胺(polyethyleneamine)、聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)以及聚丙烯胺(polyallylamine)构成的组的一种以上，优选地，为壳聚糖。但不限于此。

所述壳聚糖的分子量可以为3～1,000kDa，但不限于此。在所述壳聚糖的分子量不足3kDa的情况下，骨移植用组合物的凝聚力下降，作为移植部位的骨支撑体的功能会减弱，在超过1,000kDa的情况下，会难以溶解，因而不优选。

所述骨移植用组合物是核酸以及阳离子高分子按1～20：1重量比混合的，此时，核酸的含量以骨移植用组合物总重量为基准达到0.001～2重量％，优选阳离子高分子以骨移植用组合物总重量为基准达到0.001～2重量％。

所述骨移植材料可以为自体骨的脱钙骨基质、同种骨的脱钙骨基质、异种骨的脱钙骨基质、合成骨移植材料、自体骨粉碎物或它们的混合物。但不限于此。

所述骨移植材料可以为粉末形式、颗粒形式、碎粒形式、块形式以及糊剂形式、凝胶形式等，优选地，为粉末形式、颗粒形式、碎粒形式，最优选地，为粉末形式。

所述骨移植用组合物包含所述a)核酸、b)骨移植材料以及c)阳离子高分子，b)骨移植材料借助于a)核酸与c)阳离子高分子间的结合来保持以形成凝聚体，所述骨移植材料优选全部浸入包含骨移植用组合物的溶液，使得骨移植材料颗粒的大部分借助于核酸以及阳离子高分子结合而被保持并凝聚。因此，所述骨移植材料以溶解有骨移植用组合物的核酸的核酸溶液与溶解有阳离子高分子的阳离子高分子溶液的总体积为基准，可以混合有不足100％。优选地，可以为90％以下。在所述骨移植材料以核酸溶液与阳离子高分子溶液的总体积为基准为100％以上的情况下，溶液内包含的核酸以及阳离子高分子均无法保持骨移植材料颗粒，因而在形成凝聚体方面不优选。

所述骨移植用组合物可以追加包含骨形成活性剂。

所述骨形成活性剂可以使所述骨移植用组合物承载于骨形成活性剂溶液，使骨移植用组合物含浸骨形成活性剂。

所述骨形成活性剂可以为生长因子(growth factor)、止血剂或它们的混合物。

所述生长因子用于促进骨再生活性，可以为选自由骨形成蛋白质(bonemorphogenetic protein，BMP)、骨涎蛋白质(bone sialoprotein)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、血小板源生长因子(platelet-derived growthfactor，PDGF)、富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein)、多聚脱氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide)、肝素结合表皮生长因子(heparin-binding EGF-likegrowth factor，HB-EGF)、钙粘蛋白EGF LAG七经G-型受体3(cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor 3)以及成骨细胞特异性钙粘蛋白(osteoblast specificcadherin，OB-cadherin)构成的组的一种以上。但不限于此。

所述止血剂用于促进伤口愈合，可以为选自由凝血酶(thrombin)、促凝血酶原激酶(thromboplastin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、酪蛋白激酶Ⅱ(casein-kinaseⅡ)、组织因子(tissue factor)、肾上腺素(epinephrine)、明胶(gelatin)、维生素K(vitamine K)、氯化钙(calcium chloride)、六水合氯化铝(aluminium chloride-hexahydrate)以及硫酸铝(aluminium sulfate)构成的组的一种以上。但不限于此。

所述骨移植用组合物可以追加包含亲水性高分子，所述亲水性高分子可以为选自由羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose)、海藻酸(alginic acid)、透明质酸(hyaluronic acid)、胶原(collagen)或它们的混合物构成的组的一种以上。

所述亲水性高分子可以辅助本发明的骨移植用组合物的物性，并增加移植部位的再生效果。

所述骨移植用组合物可以执行理想的支撑体作用，诸如在核酸以及阳离子高分子间构成离子键，保持骨移植材料以形成凝聚体，从而维持骨再生空间以及细胞外基质作用。另外，所述骨移植用组合物在移植于患处时，可以增加能够在生物体内应对生理学应力的缓冲力，诸如骨骼压缩、拉伸、扭曲、弯曲等。

所述骨移植用组合物形成凝聚体，从而可以在骨移植施术时增大施术的便利性，所述骨移植用组合物内所包含的核酸以及阳离子高分子为生物相容性的，因而能够在生物体内分解。

所述骨移植用于在因外伤或感染、退行性变化、肿瘤切除、牙科疾病等多种理由而发生骨骼缺损时，填充骨组织内的空间，并促进新生骨的形成，可应用于口腔外科或整形外科性骨损失或损伤相关疾病。具体而言，可以在以下情况下实施：在进行恢复牙齿原有功能的牙科手术或牙齿移植，牙周炎等牙周疾病，疑难性骨疾病，代谢性骨疾病，无定形骨疾病，发生复合骨折或多骨骼的骨折时，使脊椎中的骨骼与关节融合时，由于感染或损伤、老化以及其他生理性原因而损伤或因各种事故而损伤时，应用于受损骨骼的空余空间时，用于使在诸如人造关节的插入物周边使骨骼愈合时，因骨疾病、包括骨肿瘤在内的骨骼疾病而损失的骨骼组织内的空间填充，骨折，骨连结，需要关节固定时，关节软骨、两侧脸颊、耳廓、鼻子、关节等的外伤，先天畸形，异物去除部，老化导致的变性等时，所述骨骼可以为人体的所有骨骼。

另外，本发明涉及一种用于制备所述骨移植用组合物的骨移植用试剂盒，其包含a-1)核酸溶液、b)骨移植材料以及c-1)阳离子高分子溶液。

所述骨移植用试剂盒可以将a-1)核酸溶液、b)骨移植材料以及c-1)阳离子高分子溶液存储于一个注射器或小瓶，或者，可以以能够将骨移植用组合物直接注入或移植到骨骼缺损部的形式存储。

另外，所述骨移植用试剂盒也可以将a-1)核酸溶液、b)骨移植材料以及c-1)阳离子高分子溶液独立地存储于各个小瓶。

另外，所述骨移植用试剂盒可以是独立地存储有混合有a-1)核酸溶液以及b)骨移植材料的小瓶与盛装c-1)阳离子高分子溶液的小瓶的，混合有c-1)阳离子高分子溶液以及b)骨移植材料的小瓶与盛装a-1)核酸溶液的小瓶可以独立地存储。

另外，所述骨移植用试剂盒可以是独立存储有装有a-2)粉末形式的核酸、b)骨移植材料、c-2)粉末形式的阳离子高分子、d)核酸溶解用缓冲液以及e)阳离子高分子溶解用缓冲液的小瓶。

所述骨移植用试剂盒的核酸与阳离子高分子为溶解于缓冲液的液剂形式或诸如粉末的结晶形式，是能够独立存储的形式，但不限于此。

所述d)核酸溶解用缓冲液可以为净化水、氯化钠(sodium chloride)、磷酸氢二钠(sodium hydrogen phosphate)、二水合磷酸二氢钠(sodium dihydrogen Phosphatedihydrate)、十二水磷酸氢二钠(sodium phosphate dibasic dodecahydrate)、氯化镁(magnesium chloride)、氯化钾(potassium chloride)、磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffer saline，PBS)、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-2-乙磺酸(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid，HEPES)、3-磷酸甘油(glycerol-3-phosphate)或它们的混合物，优选地，可以为氯化钠(sodium chloride)、磷酸氢二钠(sodium hydrogenphosphate)、二水合磷酸二氢钠(sodium dihydrogen phosphate dihydrate)或它们的混合物，但并不限于此。

所述e)阳离子高分子溶解用缓冲液可以为酸性缓冲液，优选地，可以为净化水、乙酸(acetic acid)、盐酸(hydrochloric acid)、抗坏血酸(ascorbic acid)、硝酸(nitricacid)、乳酸(lactic acid)或它们的混合物，更优选地，可以为乳酸、乙酸或它们的混合物，但不限于此。

所述骨移植材料既可以一同包括于所述骨移植用试剂盒，也可以单独购买商业化销售的骨移植材料使用。

所述核酸溶液的浓度可以因本领域技术人员的判断而异，优选地，可以为0.5重量％以上，但不限于此。但是，就核酸溶液而言，制备2重量％的核酸溶液时，会存在核酸不易溶解的制备困难。

所述阳离子高分子溶液的浓度可以根据本领域技术人员的判断而异，优选地，为0.5重量％以上，可以使用至阳离子高分子的最大溶解浓度。

所述骨移植用试剂盒可以追加包含骨形成活性剂，骨形成活性剂可以以溶液或粉末形式另行存储于小瓶。

包含所述粉末形式的骨形成活性剂的骨移植用试剂盒，可以追加包含骨形成活性剂溶解用缓冲液。

所述骨形成活性剂溶解用缓冲液可以为能够维持骨形成活性剂活性的缓冲液。优选地，可以为含有磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、生理盐水、细胞培养基、葡萄糖水溶液、支链氨基酸水溶液以及用作林格氏液的哈特曼溶液(HartmannSolution)以及Hartmann Dex等营养成分的液剂，只要是直接进入体内也不引起渗透压变化的液剂，则均可使用。

发明效果

本发明涉及包含核酸、骨移植材料以及阳离子高分子的骨移植用组合物以及用于制备该组合物的骨移植用试剂盒。更具体而言，本发明的骨移植用组合物借助于组合物内的核酸与阳离子高分子间的结合来保持骨移植材料以形成凝聚体，确认了这种凝聚体的缓冲力增加，以执行支撑体作用，并促进移植部位的新生骨形成。另外，本发明的骨移植材料组合物由于凝聚性增加，能够在骨移植时根据手术部位的形状而应用，从而增加了手术的便利性。

因此，本发明的骨移植用组合物作为维持骨再生空间以及用于细胞生长的有效支撑体进行作用，通过诱导骨形成，从而有望能够有用地用于治疗多种骨疾病。

附图说明

图1显示了确认骨移植材料是否因核酸以及阳离子高分子而凝聚的结果。(A)显示了单独的骨移植材料是否凝聚，(B)显示了由核酸以及壳聚糖混合的组合物1是否凝聚，(C)显示了掺入核酸以及壳聚糖后，混合骨移植材料的组合物2是否凝聚，(D)显示了掺入核酸以及骨移植材料后，混合壳聚糖的组合物3是否凝聚。

图2显示了根据核酸以及阳离子高分子的混合比率，骨移植材料是否凝聚。

图3显示了根据核酸以及阳离子高分子的浓度以及混合比率，骨移植材料是否凝聚。

图4显示了确认基于核酸以及阳离子高分子的骨移植材料的凝聚力以及骨移植用组合物的缓冲力的结果。(A)显示了不包含核酸以及阳离子高分子的溶液内骨移植材料本身的凝聚力以及缓冲力，(B)显示了混合核酸以及壳聚糖的组合物1的凝聚力以及缓冲力，(C)显示了掺入核酸与骨移植材料后，混合壳聚糖的组合物3的凝聚力以及缓冲力。

具体实施方式

下面详细说明本发明的优选实施例。但是，本发明不限于在此说明的实施例，也可以具体化为其他形式。是为使在此介绍的内容更透彻且完整，并向本领域技术人员充分地传递本发明的思想而提供的。

<实验例1.确认借助于核酸以及阳离子高分子的骨移植材料凝聚>

核酸使用PHARMARESEARCH PRODUCTS公司的多聚核苷酸(Polynucleotide，韩国，以下称为“核酸”)，将核酸0.2g加入9.8ml的缓冲液(0.8％氯化钠(sodium chloride)、0.25％磷酸氢二钠(sodium hydrogen phosphate)、0.028％二水合磷酸二氢钠(sodiumdihydrogen phosphate dihydrate))，利用热搅拌器，在40～70℃下溶解30～60分钟时间，制备了2重量％的核酸溶液。

作为阳离子高分子使用了壳聚糖，将0.2g的壳聚糖加入到9.8ml的0.12M乳酸(lactic acid)中，利用搅拌器使之溶解，制备了2重量％壳聚糖溶液。

骨移植材料使用牛来源脱钙异种骨。

确认了将上述制备的核酸溶液与壳聚糖溶液、骨移植材料如下表1所示混合而制成的组合物的物性以及骨移植材料是否凝聚，并将其结果显示于图1中。

[表1]

如图1所示，混合核酸溶液以及壳聚糖溶液的组合物1(图1B)看起来像凝胶(gel)，但并非凝胶状态，并且表现出可以容易用镊子处置的物性。在混合核酸溶液以及壳聚糖溶液后掺入骨移植材料的组合物2(图1C)，确认了骨移植材料不因核酸溶液以及壳聚糖溶液混合物而凝聚，而是像未混合任何物质的骨移植材料(图1A)一样分散。相反，在骨移植材料中先掺入核酸溶液后混合壳聚糖溶液的组合物3(图1D)，确认了骨移植材料发生凝聚。

另外，虽然图1中未显示，但就先掺入骨移植材料与壳聚糖溶液后混合核酸溶液的组合物而言，确认了如同所述组合物3，骨移植材料发生凝聚。

虽然在本说明书中未显示，但使用甲壳素、聚乙烯胺、聚-L-赖氨酸以及聚丙烯胺作为阳离子高分子的情况下，确认了也表现出相同的结果。

由此可知，本发明的核酸以及阳离子高分子的结合诱导骨移植材料的凝聚，还可知核酸、阳离子高分子以及骨移植材料的混合顺序也对骨移植材料凝聚产生重要作用。

<实验例2.确认根据核酸以及阳离子高分子的混合比率，骨移植材料是否凝聚>

为了确认在所述实验例1中确认的核酸以及壳聚糖引起的骨移植材料凝聚是否受到核酸以及壳聚糖混合比率影响，通过变更核酸以及壳聚糖的混合比率来确认了骨移植材料是否凝聚。此时，固定了核酸的浓度，并通过变更壳聚糖的浓度来调节混合比率。

以与所述实验例1的核酸溶液以及壳聚糖溶液的制备方法相同的方法，制备了2重量％的核酸溶液与2重量％、1重量％、0.5重量％以及0.1重量％的壳聚糖溶液。组合物制备是在0.5g的骨移植材料中分株1.25ml的2重量％的核酸溶液进行混合，使得组合物内的核酸以及壳聚糖的最终浓度达到下表2记载的浓度，之后加入0.25ml的各浓度的壳聚糖溶液并混合，以确认骨移植材料是否凝聚，将其结果显示于图2。

[表2]

如图2所示，确认了骨移植材料的凝聚是否会根据核酸以及壳聚糖的混合比率而异。即，确认到在骨移植用组合物含有的核酸以及壳聚糖在按5：1(组合物3)、10：1(组合物3-1)以及20：1(组合物3-2)重量比混合的情况下，骨移植材料凝聚，相反，在按100：1(组合物3-3)重量比混合的情况下，骨移植材料不凝聚而是分散。

由此可知，在骨移植材料是否凝聚方面，核酸以及阳离子高分子的混合比率发挥重要作用。

<实验例3.确认根据核酸以及阳离子高分子的浓度，骨移植材料是否凝聚>

通过所述实验例2，确认到核酸以及壳聚糖的混合比率对骨移植材料的凝聚发挥重要作用。另外，为了确认根据核酸以及壳聚糖的浓度，骨移植材料凝聚，而进行了实验。

以与所述实验例1的核酸溶液以及壳聚糖溶液制备方法相同的方法，制备了2重量％、1重量％以及0.5重量％的壳聚糖溶液和2重量％、1.5重量％、1重量％以及0.5重量％的核酸溶液。组合物制备是在0.5g的骨移植材料中分株1.25ml的各浓度的核酸溶液进行混合，使得组合物内的核酸以及壳聚糖的最终浓度达到下表3记载的浓度，之后加入0.25ml的各浓度的壳聚糖溶液并进行混合，以确认骨移植材料是否凝聚，将其结果显示于图3。

[表3]

如图3所示，如果观察组合物内核酸以及壳聚糖的浓度不同但混合比率类似或相同的组合物3、组合物4-5以及组合物4-9，确认了组合物4-9的骨移植材料不凝聚而是分散，相反，组合物4-5以及组合物3的骨移植材料凝聚。这种结果在组合物4-4以及组合物4-8、组合物3-1以及组合物4-6中也表现得相同。

由此可知，骨移植材料是否凝聚，不仅受到核酸以及阳离子高分子的混合比率影响，而且还受到核酸以及阳离子高分子的最终浓度影响。

通过所述实验例1至实验例3的结果可知，本发明的骨移植用组合物优选核酸以及阳离子高分子的混合比率为1～20：1(重量比)，以组合物总重量为基准，核酸包含0.001～2重量％，以组合物总重量为基准，阳离子高分子包含0.001～2重量％。

<实验例4.确认基于核酸以及阳离子高分子的骨移植材料的凝聚力以及骨移植用 的组合物缓冲力>

针对本发明的骨移植用组合物，为了确认基于核酸以及阳离子高分子的骨移植材料的凝聚力以及骨移植用组合物的缓冲力，利用所述实验例1的组合物1以及组合物3，并施加恒定的力，确认了组合物的形状变化，将其结果显示于图4。

如图4所示，在仅存在骨移植材料的情况下(图4A)，确认了骨移植材料不凝聚，稍稍用力便容易地分散。就不包含骨移植材料而只混合核酸以及壳聚糖的组合物1而言(图4B)，确认了即使用力，组合物也不分离，去除施加的力时，存在恢复原状的复原力以及缓冲力。就混合有核酸、壳聚糖以及骨移植材料的组合物3而言(图4C)，不同于骨移植材料单独存在的情形，骨移植材料凝聚，即使用力，骨移植材料也不分散而是维持其形状，从而确认了有凝聚力，确认了也有缓冲力。

由此可知，本发明的包含核酸、阳离子高分子以及骨移植材料的骨移植用组合物，由于凝聚使骨移植材料的凝聚力，能够防止骨移植材料因外部力而分散，由于可弥补骨移植以及骨再生过程中的物理冲击的缓冲力，使得能够维持形状，可以增加骨移植时的手术便利性。

<实验例5.确认随时间流逝的骨移植用组合物的凝聚力维持情况>

针对本发明的骨移植用组合物，确认了骨移植用组合物的凝聚力是否随时间流逝而减小。此时，骨移植用组合物的凝聚力如果减小，则以因骨移植材料分散导致的组合物总重量变化为基础，确认了是否维持凝聚力。

利用所述实验例1的组合物3，以刚刚制备组合物3后的时间为基准，间隔30分钟测量了骨移植用组合物的总重量，将其结果显示于表4。

[表4]

时间(分)	0	30	60	90	120	150
							重量(g)	0.7	0.69	0.7	0.69	0.68	0.69

正如通过所述表4可知，确认了本发明的骨移植用组合物的总重量随着时间流逝而没有大的变化，由此可知，本发明的骨移植用组合物的凝聚力长时间持续。

因此可知，本发明的骨移植用组合物即使在长时间施术时间，也几乎没有骨移植用组合物的形状变化，不仅具有高稳定性，而且几乎没有骨移植材料的脱落，骨移植材料的凝聚可长久地持续，因而可以便利地进行骨移植施术。

<实验例6.确认骨形成诱导>

为了确认本发明的骨移植用组合物的骨形成诱导效果，在无骨生长的部位移植骨移植用组合物，观察是否形成新生骨。

在作为无骨生长的部位的大鼠腹肌，移植所述实施例1的组合物2以及组合物3和作为对照组仅移植骨移植材料，并缝合腹肌以及皮肤进行饲养。饲养后剥离移植的全体腹肌，经脱钙过程，利用石蜡包埋，制作了组织标本。利用制作的组织标本，进行吉姆萨染色(Giemsa stain)和H&E染色后，测量新生骨组织的量，确认了新生骨形成程度。

结果，仅进行骨移植材料处理的对照组几乎未出现新生骨，而就处理组合物2处理的情况而言，与对照组类似，几乎未出现新生骨。相反，就处理组合物3处理的情况而言，不同于对照组以及组合物2，确认了新生骨的量显著增加。

由此可知，本发明的骨移植用组合物具有促进骨形成诱导效果。

<实施例1.制备骨移植用试剂盒>

实施例1-1.制备核酸溶液

将0.2g的核酸加入9.8ml的缓冲液(0.8％氯化钠(Sodium chloride)、0.25％磷酸氢二钠(Sodium hydrogen phosphate)、0.028％二水合磷酸二氢钠(sodium dihydrogenphosphate dihydrate))，利用热搅拌器，在40～70℃下溶解30至60分钟时间，制备了2重量％的核酸溶液。

实施例1-2.制备阳离子高分子溶液

作为阳离子高分子使用了壳聚糖。

将0.2g的壳聚糖加入9.8ml的0.12M乳酸(lactic acid)溶液，利用搅拌器进行溶解，制备了2重量％的壳聚糖溶液。

实施例1-3.制备骨移植用试剂盒

将存储在所述实施例1-1中制备的核酸溶液的小瓶与存储在实施例1-2中制备的壳聚糖(阳离子高分子)溶液的小瓶组合，制备了本发明的骨移植用试剂盒。此时，对于骨移植材料，可将存储骨移植材料的小瓶插入试剂盒，来制备骨移植用试剂盒。

Claims (14)

1.一种骨移植用组合物，其特征在于，

包含：

a)核酸，

b)骨移植材料，以及

c)阳离子高分子，所述阳离子高分子选自由壳聚糖、聚乙烯胺、聚-L-赖氨酸以及聚丙烯胺构成的组的一种以上；

所述a)核酸与c)阳离子高分子间的结合保持b)骨移植材料以构成凝聚体；

所述骨移植用组合物通过如下步骤制备：

第一步骤，在a)核酸中混合b)骨移植材料以制备核酸-骨移植材料混合物，以及

第二步骤，在所述核酸-骨移植材料混合物中添加c)阳离子高分子，保持骨移植材料以制备凝聚体；

或者，

第一步骤，在c)阳离子高分子中混合b)骨移植材料以制备阳离子高分子-骨移植材料混合物，以及

第二步骤，在所述阳离子高分子-骨移植材料混合物中添加a)核酸，保持骨移植材料以制备凝聚体；

所述骨移植用组合物为核酸以及阳离子高分子按1～20：1重量比混合的。

2.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述结合为离子键。

3.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述核酸以骨移植用组合物总重量为基准，包含0.001～2重量％。

4.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述核酸为脱氧核糖核酸、核糖核酸或它们的混合物。

5.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述核酸分子量为1～100,000kDa。

6.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述阳离子高分子以骨移植用组合物总重量为基准，包含0.001～2重量％。

7.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述阳离子高分子为壳聚糖。

8.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述骨移植材料为自体骨的脱钙骨基质、同种骨的脱钙骨基质、异种骨的脱钙骨基质、合成骨移植材料、自体骨粉碎物或它们的混合物。

9.根据权利要求1所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述骨移植用组合物进一步包含骨形成活性剂。

10.根据权利要求9所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述骨形成活性剂为生长因子、止血剂或它们的混合物。

11.根据权利要求10所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述生长因子为选自由骨形成蛋白质、骨涎蛋白质、转化生长因子、血小板源生长因子、富血小板血浆、成纤维细胞生长因子、牙本质涎蛋白、多脱氧核糖核苷酸、肝素结合表皮生长因子、钙粘蛋白EGF LAG七经G-型受体3以及成骨细胞特异性钙粘蛋白构成的组的一种以上。

12.根据权利要求10所述的骨移植用组合物，其特征在于，

所述止血剂为选自由凝血酶、促凝血酶原激酶、纤维蛋白原、酪蛋白激酶Ⅱ、组织因子、肾上腺素、明胶、维生素K、氯化钙、六水合氯化铝以及硫酸铝构成的组的一种以上。

13.一种作为用于制备权利要求1所述的骨移植用组合物的骨移植用试剂盒，其特征在于，

包含：

a-1)核酸溶液；

b)骨移植材料；以及

c-1)阳离子高分子溶液。

14.根据权利要求13所述的骨移植用试剂盒，其特征在于，

所述骨移植用试剂盒追加包含骨形成活性剂。

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