CN111879939A - 一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，属于病毒检测技术领域，所述试剂盒包括卡盒、IgM检测试纸条和稀释液。当患者初次被病毒感染后，体内免疫系统会被激活，并在感染初期产生IgM，使用本发明提供的试剂盒能够检测出新型冠状病毒，若是既往患者被病毒再次感染，体内会产生IgG，使用本发明提供的试剂盒中的IgM检测试纸条和IgG检测试纸条，能够确认患者感染了新型冠状病毒。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和 MERS-CoV有明显区别。主要传播途径是经呼吸道飞沫传播，亦可通过接触传播。潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天，以发热、乏力、干咳为主要表现。
感染病毒的人会出现程度不同的症状，有的只是发烧或轻微咳嗽，有的会发展为肺炎，有的则更为严重甚至死亡。各个年龄段的人都可能被感染，但儿童感染率相对较低，被感染的主要是成年人，其中老年人和体弱多病的人似乎更容易被感染。
确诊则有赖于病原学检查，包括病毒分离、血清学检查以及病毒抗原及核酸检测。当前在鉴别疑似病例阶段主要采用的方法是检测白细胞总数和淋巴细胞计数，缺少特异性强、快速、有效鉴别手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，采用本发明提供的试剂盒能够快速检测新型冠状病毒。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括卡盒、IgM检测试纸条和稀释液；
所述IgM检测试纸条包括顺次搭接在PVC板上的样品垫、IgM 检测结合垫、层析膜和吸水纸；
所述IgM检测结合垫包被有胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白；
所述层析膜包被有鼠抗人μ链单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体。
优选的，所述IgM检测结合垫上胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白的包被浓度为10ug/mL。
优选的，所述层析膜上鼠抗人μ链单克隆抗体的包被浓度为 1.5mg/ml；
所述层析膜上羊抗鼠IgG多克隆抗体的包被浓度为1.0mg/ml。
优选的，所述层析膜上包括T线和C线；
所述T线上喷涂鼠抗人μ链单克隆抗体，所述鼠抗人μ链单克隆抗体的喷涂浓度为1.5mg/mL；
所述C线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述I羊抗鼠IgG多克隆抗体的喷涂浓度为1mg/mL。
优选的，还包括IgG检测试纸条；
所述IgG检测试纸条包括顺次搭接在PVC板上的样品垫、IgG 检测结合垫、层析膜和吸水纸；
所述IgG检测结合垫包被有胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白；
所述层析膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体。
优选的，所述IgG检测结合垫上胶体金颗粒标记新冠状病毒重组蛋白的包被浓度为10μg/mL。
优选的，所述层析膜上鼠抗人IgG单克隆抗体的包被浓度为 1.5mg/mL；
所述层析膜上羊抗鼠IgG多克隆抗体的包被浓度为1.0mg/mL。
优选的，所述层析膜上包括T线和C线；
所述T线上鼠抗人IgG单克隆抗体，所述鼠抗人IgG单克隆抗体的喷涂浓度为1.5mg/mL；
所述C线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的喷涂浓度为1mg/mL。
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括卡盒、IgM检测试纸条和稀释液。当患者初次被病毒感染后，体内免疫系统会被激活，并在感染初期产生IgM，使用本发明提供的试剂盒能够检测出新型冠状病毒，若是既往患者被病毒再次感染，体内会产生IgG，使用本发明提供的试剂盒中的IgM检测试纸条和IgG检测试纸条，能够确认患者感染了新型冠状病毒。
本发明将待测样本由检测卡加样孔滴入，样本中的待测物在层析作用下与结合垫上金颗粒标记的抗体(羊抗人IgM或IgG)形成复合物，复合物继续层析至硝酸纤维素膜上的检测区(T线)，被检测区的特异性抗原捕获。样本中的待测物越多，在检测区聚集的金颗粒越多，检测区的显色越强，检测区与质控区(C线)的显色比值与样本中的待测物量呈正相关关系，进而准确的定量检测样本中特异性IgM 和IgG的含量。
附图说明
图1为试纸条的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括卡盒、IgM检测试纸条和稀释液；所述IgM检测试纸条包括顺次搭接在PVC板上的样品垫、IgM检测结合垫、层析膜和吸水纸；所述IgM检测结合垫包被有胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白(扬州施惠尔生产的2019-nCoV Spike Protein(RBD)重组蛋白)；所述层析膜包被有鼠抗人μ链单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体 (深圳菲鹏生物生产)。
在本发明中，所述稀释液优选为含0.5％BSA的0.01M PBS溶液。在本发明中，所述层析膜优选为硝酸纤维素膜。
在本发明中，所述卡盒优选为塑料卡盒，所述塑料卡盒用于固定试纸条。
在本发明中，所述IgM检测结合垫上胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白的包被浓度优选为10μg/mL；所述层析膜上鼠抗人μ链单克隆抗体的包被浓度优选为1.5mg/mL；所述层析膜上羊抗鼠IgG 多克隆抗体的包被浓度优选为1.0mg/mL；所述层析膜上优选包括T 线和C线；所述T线上鼠抗人μ链单克隆抗体，所述鼠抗人μ链单克隆抗体的喷涂浓度优选为1.5mg/mL；所述C线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的喷涂浓度优选为1mg/mL。本发明对所述鼠抗人μ链单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品，优选购自菲鹏生物。
在本发明中，所述胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白的制备方法独立的优选包括：用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金的pH值为 7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg重组蛋白，搅拌 10～30min，然后加入50～100μL的10％的BSA水溶液，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的含1％蔗糖的Tris-HCl缓冲液将沉淀重悬，得到喷涂液，置4℃备用。在本发明中，所述IgM检测结合垫的制备方法优选包括：将所述喷涂液喷涂到玻璃纤维上，45℃干燥2h。
在本发明中，所述层析膜的制备方法包括：在硝酸纤维素膜上的 T线使用含1％蔗糖的PB溶液稀释至1.5mg/mL的鼠抗人μ链单克隆抗体，C线使用含1％蔗糖的PB溶液稀释至1.0mg/mL的羊抗鼠IgG 多克隆抗体，室温放置至硝酸纤维素膜上划痕液消失后，放入烘箱中 37℃下避光干燥过夜。在本发明中，所述C线距离结合垫的距离优选为8mm±0.2mm，所述T线距离结合垫的距离优选为15mm±0.2mm。
在本发明中，所述试剂盒检测的样本优选包括全血、血清或血浆。本发明对所述全血、血浆和血清的获取方法没有特殊限定，采用常规获取全血、血浆和血清的方法即可。在本发明中，所述血浆使用的抗凝剂优选包括EDTA或肝素抗凝管。
本发明对所述IgM检测试纸条的制备方法没有特殊限定，采用常规方法将样品垫、IgM检测结合垫、层析膜和吸水纸顺次搭接在 PVC板上即可。在本发明中，所述IgM检测试纸条的宽度优选为 3.8～4.2mm，长度优选为4.0mm。
在本发明中，所述IgM检测试纸条的使用方法优选包括：将20μl 样本加入到样品垫上，用100μl稀释液稀释，10～20min得出检测结果。在本发明中，所述试剂盒中还优选包括IgG检测试纸条；所述IgG检测试纸条包括顺次搭接在PVC板上的样品垫、IgG检测结合垫、层析膜和吸水纸；所述IgM检测结合垫包被有胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白；所述层析膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体。
在本发明中，所述卡盒优选为塑料卡盒，所述塑料卡盒用于固定试纸条。
在本发明中，所述IgM检测结合垫上胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白的包被浓度优选为10ug/mL；所述层析膜上鼠抗人IgG 单克隆抗体的包被浓度优选为1.5mg/mL；所述层析膜上羊抗鼠IgG 多克隆抗体的包被浓度优选为1.0mg/mL；所述层析膜上优选包括T 线和C线；所述T线上鼠抗人IgG单克隆抗体，所述鼠抗人IgG单克隆抗体的喷涂浓度优选为1.5mg/mL；所述C线上喷涂羊抗鼠IgG 多克隆抗体，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的喷涂浓度优选为1mg/mL。本发明对所述鼠抗人μ链单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售产品，优选购自菲鹏生物。
在本发明中，所述胶体金颗粒标记羊抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记兔IgG多克隆抗体的制备方法独立的优选包括：用0.1M 碳酸钾溶液调节胶体金的pH值为7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入4～25μg重组蛋白，搅拌10～30min，然后加入50～100uL的10％的BSA水溶液，搅拌10～30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的含1％蔗糖的Tris-HCl缓冲液将沉淀重悬，得到喷涂液，置4℃备用。在本发明中，所述IgG检测结合垫的制备方法优选包括：将所述喷涂液喷涂到玻璃纤维上，45℃干燥2h。
在本发明中，所述层析膜的制备方法包括：在硝酸纤维素膜上的 T线使用含1％蔗糖的PB溶液稀释至1.5mg/mL的鼠抗人IgG单克隆抗体，C线使用含1％蔗糖的PB溶液稀释至1.0mg/mL的羊抗鼠IgG 多克隆抗体，，室温放置至硝酸纤维素膜上划痕液消失后，放入烘箱中37℃下避光干燥过夜。在本发明中，所述C线距离结合垫的距离优选为8mm±0.2mm，所述T线距离结合垫的距离优选为 15mm±0.2mm。
本发明对所述IgG检测试纸条的制备方法没有特殊限定，采用常规方法将样品垫、IgG检测结合垫、层析膜和吸水纸顺次搭接在PVC 板上即可。在本发明中，所述IgG检测试纸条的宽度优选为 3.8～4.2mm，长度优选为4mm。
在本发明中，所述IgG检测试纸条的使用方法优选包括：将20μL 样本加入到样品垫上，用100μL稀释液稀释，10～20min得出检测结果。
在本发明中，所述试剂盒的具体性能指标如下：
1)膜条宽度：试纸条宽度应为(4.0±0.2)mm。
2)最低检出量：检测最低检出量参考品，应均显阳性。
3)阳性符合率：3份新型冠状病毒(2019-nCoV)特异性IgM 阳性参考品，检测阳性符合率(+/+)应为3/3。3份新型冠状病毒 (2019-nCoV)特异性IgG阳性参考品，检测阳性符合率(+/+)应为3/3。
4)阴性符合率：3份阴性参考品，检测阴性符合率(-/-)应为 3/3。
5)取同一批号试剂盒，分别检测同一份新型冠状病毒 (2019-nCoV)特异性IgM和IgG阳性参考品，每个样本平行检测 10次，均应显阳性，且显色度应均一。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
检测新型冠状病毒的试剂条的制备
1.IgM试纸条的制备
1.1 IgM结合垫制备
用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金的pH值为7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入10μg新型冠状病毒重组蛋白，搅拌10min，然后加入100uL的10％的BSA水溶液，搅拌30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的含1％蔗糖的Tris-HCl缓冲液将沉淀重悬，得到喷涂液，置4℃备用，将所述喷涂液喷涂到玻璃纤维上，45℃干燥2h。
层析膜的制备：
1.1层析膜黏贴：将25*300mm的硝酸纤维素膜贴纸78*300mm 的PVC底板上；
1.2包被液配制：使用磷酸缓冲液分别配置T线和C线包被液， T线鼠抗人μ链单克隆抗体浓度为1.5mg/mL；C线羊抗鼠多抗浓度为 1mg/mL。
1.3层析膜包被与干燥：C线划在距离吸水纸端8mm±0.2处，T 线划在距离吸水纸端15mm±0.2处。室温放置至NC膜上划痕液消失后，放入烘箱中37℃下避光干燥过夜。
将样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸依次搭接在PVC板上，按照4±0.1m*78mm规格进行裁剪，得到试纸条。
1.2 IgG结合垫制备
用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金的pH值为7.0～9.0，按每毫升胶体金溶液缓慢加入10μg重组蛋白，搅拌10min，然后加入100uL的 10％的BSA水溶液，搅拌30min，离心，弃上清，将沉淀用洗涤液洗涤2～3次，末次用十分之一初始体积的含1％蔗糖的Tris-HCl缓冲液将沉淀重悬，得到喷涂液，置4℃备用，将所述喷涂液喷涂到玻璃纤维上，45℃干燥2h。
层析膜的制备：
1.1层析膜黏贴：将25*300mm的硝酸纤维素膜贴纸78*300mm 的PVC底板上；
1.2包被液配制：使用磷酸缓冲液分别配置T线和C线包被液， T线鼠抗人IgG单克隆抗体浓度为1.5mg/mL；C线羊抗鼠多抗浓度为1mg/mL。
1.3层析膜包被与干燥：C线划在距离吸水纸端8mm±0.2处，T 线划在距离吸水纸端15mm±0.2处。室温放置至NC膜上划痕液消失后，放入烘箱中37℃下避光干燥过夜。
将样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸依次搭接在PVC板上，按照4±0.1m*78mm规格进行裁剪，得到试纸条。
实施例2
试剂盒：包括实施例1制备得到的试纸条和稀释液；其中稀释液为含质量浓度为0.5％BSA的PBS溶液，PBS溶液的浓度为0.01M。
实施例3
对实施例2的试剂盒进行阳性符合率等指标的检测
1.卡条宽度
检测方法：随机抽取同批号试剂盒3人份，分别拆开壳体，取出试纸条，用经过校准后的通用或专用量具测量其宽度，检测结果见表 1。
表1检测结果
由上表可知，试纸条宽度在4.0±0.4mm范围内。
2.阳性符合率
操作方法：将待测样本及所需试剂从储存条件下取出，平衡至室温。从包装袋中取出试剂卡，平放于干燥平面上。血清/血浆样本：分别取20μL血清或血浆样本加到加样孔中，立即滴加3-4滴样本稀释液至加样孔中。全血样本：分别取30μL全血样本加到加样孔中，立即滴加3-4滴样本稀释液至加样孔中。加样后，在15分钟内读取结果。
检测方法：随机抽取同批号试剂盒6人份，按照试剂盒操作方法进行操作，分别检测3份不同新型冠状病毒IgG阳性参考品与3份不同新型冠状病毒IgM阳性参考品，分别计算其阳性符合率(阳性检出样本数/总阳性样本数)。
检测结果见表2。
表2检测结果
由上表可知3份新型冠状病毒IgG阳性参考品，检测阳性符合率 (+/+)为3/3。3份新型冠状病毒IgM阳性参考品，检测阳性符合率 (+/+)为3/3。
3.阴性符合率。
操作方法：将待测样本及所需试剂从储存条件下取出，平衡至室温。从包装袋中取出试剂卡，平放于干燥平面上。血清/血浆样本：分别取20μL血清或血浆样本加到加样孔中，立即滴加3-4滴样本稀释液至加样孔中。全血样本：分别取30μL全血样本加到加样孔中，立即滴加3-4滴样本稀释液至加样孔中。加样后，在15分钟内读取结果。
检测方法：随机抽取同批号试剂盒3人份，按照试剂盒操作方法进行操作，检测3份不同阴性参考品，计算阴性符合率(阴性检出样本数/总样本数)。
检测结果见表3。
表3检测结果
由上表可知3份新型冠状病毒阴性参考品，检测阴性符合率(-/-) 为3/3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括卡盒、IgM检测试纸条和稀释液；
所述IgM检测试纸条包括顺次搭接在PVC板上的样品垫、IgM检测结合垫、层析膜和吸水纸；
所述IgM检测结合垫包被有胶体金颗粒标记羊抗人IgM单克隆抗体和胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白；
所述层析膜包被有鼠抗人μ链单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述IgM检测结合垫上胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白的浓度为10μg/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述层析膜上鼠抗人μ链单克隆抗体的包被浓度为1.5mg/mL；
所述层析膜上羊抗鼠IgG多克隆抗体的包被浓度为1.0mg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述层析膜上包括T线和C线；
所述T线上喷涂鼠抗人μ链单克隆抗体，所述鼠抗人μ链单克隆抗体的喷涂浓度为1.5mg/mL；
所述C线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的喷涂浓度为1mg/mL。
5.权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括IgG检测试纸条；
所述IgG检测试纸条包括顺次搭接在PVC板上的样品垫、IgG检测结合垫、层析膜和吸水纸；
所述IgG检测结合垫包被有胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白；
所述层析膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述IgG检测结合垫上胶体金颗粒标记新型冠状病毒重组蛋白的浓度为10μg/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述鼠抗人IgG单克隆抗体的包被浓度为1.5mg/mL；
所述层析膜上羊抗鼠IgG多克隆抗体的包被浓度为1.0mg/mL。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述层析膜上包括T线和C线；
所述T线上喷涂鼠抗人IgG单克隆抗体，所述鼠抗人IgG单克隆抗体的喷涂浓度为1.5mg/mL；
所述C线上羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的喷涂浓度为1mg/mL。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHENGTU LI, ET AL.: "Development and clinical application of a rapid IgM-IgG combined antibody test for SARS-CoV-2 infection diagnosis", 《JOURNAL OF MEDICAL VIROLOG》 * |
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