CN111840577A - 一种提高ucmsc肺部输送效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于间充质干细胞的输送技术领域，具体涉及一种提高UCMSC细胞肺部输送效率的方法。具体技术方案为：采用气管滴注和静脉注射联合输送的方法向肺部输送UCMSC细胞。该提高UCMSC细胞肺部输送效率的方法用于非疾病的诊断和治疗目的，可显著提高实验效率，降低实验成本。

Description

一种提高UCMSC肺部输送效率的方法
技术领域
本发明属于间充质干细胞的输送技术领域，具体涉及一种提高UCMSC肺部输送效率的方法。
背景技术
急性肺损伤(ALI)是指由多种病因损伤肺脏的上皮细胞和内皮细胞后使功能形态异常，通过炎症介质导致肺表面活性物质降低、水肿、肺膨胀不全,并且血管通透性增高的临床综合征。临床主要表现为急性，进行性加重的呼吸困难，难治性低氧血症和肺水肿。ALI的病死率高且发病机制复杂，其中炎症反应在ALI的形成和发展过程中具有重要作用。研究表明，大量炎症因子参与了ALI的形成，促炎因子和抑炎因子的失衡是ALI形成的重要因素，因而ALI是一种公认的炎症疾病。迄今为止，尚未找到ALI的特效药物，因而ALI的治疗已经成为我们所亟待解决的重大医疗卫生问题。
间充质干细胞(MSC)干细胞家族的重要成员，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，可自我复制，是一种多能干细胞。研究表明MSC对炎性相关疾病具有显著的改善和治疗作用，能够修复受损组织、缓解炎症和免疫调节等。大量研究发现：脐带来源的间充质干细胞(UCMSC)易增殖且免疫原性低，可以通过重塑患者的免疫系统使机体免疫稳态重建，提高抵抗病毒侵袭的能力，缓解肺部过度的炎症反应以及促进肺部组织损伤修复。因而UCMSC在ALI相关的肺损伤修复的临床应用中有着广阔的应用前景。
当前，在研究间充质干细胞对急性肺损伤的模型生物的影响时，一般通过静脉注射或气管插管的方法将间充质干细胞输送到急性肺损伤小鼠的肺部，但上述2种输送方法都存在输送效率低的问题，容易造成间充质干细胞的浪费，研究成本高且探究高剂量间充质干细胞对急性肺损伤模型的影响等问题的难度大。
发明内容
本发明提供一种提高UCMSC肺部输送效率的方法，以解决上述技术问题。
本发明的提高UCMSC肺部输送效率的方法采用如下技术方案：一种提高UCMSC肺部输送效率的方法，采用气管滴注和静脉注射联合输送的方法向肺部输送UCMSC，所述提高UCMSC肺部输送效率的方法用于非疾病的诊断和治疗目的。
优选的，所述提高UCMSC肺部输送效率的方法适用于向急性肺损伤动物模型的肺部输送UCMSC。
优选的，所述急性肺损伤动物模型为急性肺损伤小鼠模型。
优选的，所述急性肺损伤动物模型是采用脂多糖诱导得到的。
优选的，所述气管滴注和静脉注射分别输送的UCMSC的用量比为1:1。
优选的，所述静脉注射为尾部静脉注射。
本发明的有益效果是：本发明的提高UCMSC肺部输送效率的方法可显著提高脐带间充质干细胞的肺部输送效率。
在研究脐带间充质干细胞对肺部的影响的相关实验中可显著减少UCMSC细胞的浪费，有助于探究高剂量UCMSC对肺部，尤其是急性肺损伤的影响，节省实验成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中利用CFSE荧光染料示踪UCMSC在肺组织中的输送效率的结果图；
图2为实施例4中ELISA检测肺泡中炎症因子的分泌情况结果图；
图3为实施例5中肺组织的HE染色结果图
图4为小鼠急性肺损伤模型构建过程中相关操作的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1实验材料的准备
1.1脐带间充质干细胞体外分离培养
具体步骤如下：分别取足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带，将其浸泡在LG-DMEM培养液(美国Gibico公司)中，4℃保存，超净台内取出脐带用PBS充分冲洗，去除脐带中残留血，将脐带剪碎放入到0.1％胶原酶Ⅳ(美国Gibico公司)中，在温度为37℃下进行30分钟消化，然后向其中加入体积分数10％的FBS终止消化，将获得的细胞滤液进行离心，然后加入含有LG-DMEM培养液的T-25的培养瓶中，培养三四天后更换培养液，向胶原酶-组织块消化体系内加入终浓度0.1％的胰酶在37℃的环境中继续搅拌消化分钟，加入体积分数10％的PBS终止消化，采用细胞筛过滤，含细胞的滤液进行离心，细胞接种在LG-DMEM培养基的T-25培养瓶中，培养三四天后更换培养液，去除未贴壁细胞，之后每隔三天换液1次，直到细胞充分融合传代。
1.2构建BALB/c小鼠急性肺损伤模型(脂多糖诱导)
具体步骤如下：
(1)麻醉：腹腔注射4.3％水合氯醛(0.01ml/g)麻醉小鼠，涂兽用护眼膏防止小鼠麻醉过程中眼睛干燥；静置数分钟，捏脚确认其进入麻醉状态后准备气管插管。
基础麻醉应保证小鼠在固定及插管过程中不会跳动，便于操作；同时也不可过量麻醉，否则影响后续实验。
(2)插管准备：插管操作台调整为与地面60°夹角并固定；75％酒精消毒ETT软管，安装并打开BioLITE插管照明系统；封口膜分别包裹弯头镊子的两个尖头，避免操作过程中伤及小鼠舌头；将麻醉后小鼠以仰卧位放置于操作台上，上颌门齿悬挂在台子上端的线上(相关操作参见说明书附图图4)。
60°夹角便于操作者在合适的光源引导下看清小鼠的口咽部，操作前建议用一只小鼠练习并测量从嘴到支气管分叉口的长度(一般25g±体重的小鼠此长度约为1.5cm)。
(3)气管插管：用镊子轻轻张开小鼠嘴巴并将舌头从一侧稍往外拉便于操作，在BioLITE插管照明系统的引导下可以看到小鼠的会咽部，小心通过会厌插入杓状软骨之间直至插入合适长度的ETT软管，快速从ETT软管中移除光纤导管。
插入时间不宜过长，且连续3次插入不成功不建议再次操作以免对小鼠造成损伤，一旦插入成功尽快从ETT软管中移除光纤导管，以保证小鼠正常呼吸。
(4)气管给药：根据4mg/kg小鼠体重，通过ETT软管进行LPS溶液气管滴注。由于LPS为固体，提前用PBS稀释至溶液备用。一般25g±体重的小鼠给药量≤50μl。
为了保证小鼠给药过程中正常呼吸，必须确保溶液添加后快速吸入肺部。熟练状态下，
2min内即可完成插管和给药。
(5)动物苏醒：药物全部吸入后，将小鼠从操作台上拿下置于37℃暖垫上等待其苏醒，苏醒后放回鼠笼，等待小鼠可以正常走动后将鼠笼放回架子上。
为了使小鼠在麻醉状态下保持体温、呼吸并加速苏醒，建议以侧卧位置于37℃暖垫上。一般麻醉后1小时内即可苏醒。
实施例2采用本发明的输送方法向实施例1得到的急性肺损伤小鼠模型输送培养得到的脐带间充质干细胞
包括下述步骤：
2.1小鼠气管滴注UCMSC(人脐带间充质干细胞)：
(1)麻醉：腹腔注射4.3％水合氯醛(0.01ml/g)麻醉小鼠，涂兽用护眼膏防止小鼠麻醉过程中眼睛干燥；静置数分钟，捏脚确认其进入麻醉状态后准备气管插管。
(2)插管准备：插管操作台调整为与地面60°夹角并固定；75％酒精消毒ETT软管，安装并打开BioLITE插管照明系统；封口膜分别包裹弯头镊子的两个尖头，避免操作过程中伤及小鼠舌头；将麻醉后小鼠以仰卧位放置于操作台上，上颌门齿悬挂在台子上端的线上。
(3)气管插管：用镊子轻轻张开小鼠嘴巴并将舌头从一侧稍往外拉便于操作，在BioLITE插管照明系统的引导下可以看到小鼠的会咽部，小心通过会厌插入杓状软骨之间直至插入合适长度的ETT软管，快速从ETT软管中移除光纤导管。
(4)气管给药：通过ETT软管进行50μl UCMSC气管滴注，每只小鼠给药1×106细胞，提前用PBS重悬至50μl备用。
(5)动物苏醒：药物全部吸入后，将小鼠从操作台上拿下置于37℃暖垫上等待其苏醒，苏醒后放回鼠笼，等待小鼠可以正常走动后将鼠笼放回架子上
2.2小鼠尾静脉注射UCMSC(人脐带间充质干细胞)：
(1)准备：1ml注射器、27G针头连接备用，小鼠固定器及酒精、纱布、50℃热水放置于桌面备用。
(2)固定：将小鼠固定好，用酒精棉球擦拭或50℃热水浸泡(＜2min)使尾部静脉扩张便于操作，选择尾部下1/3-1/2位置进针。
尾部下1/3-1/2处皮肤较薄，血管清晰，进针容易，如果首次进针不成功可逐渐向上移动继续使用该血管。
(3)尾静脉给药：用左手食指、中指、无名指及大拇指将小鼠尾巴固定；右手大拇指、食指和中指紧握注射器0.1ml处，小指搭在左手大拇指处，以10°角度进针，注射200μlUCMSC，每只小鼠给药1×106细胞，提前用PBS重悬至200μl备用。
进针后看到回血表明成功进入尾静脉，另外尾静脉注射无阻力。熟练状态下，2min内即可完成尾静脉进针和给药。
(4)止血：注射结束后，医用棉花按压止血即可。
实施例3利用活细胞示踪技术发现气管插管和静脉注射联用显著提高UCMSC的肺部输送效率
3.1将上述分离出来的UCMSC(按照实施例1中1.1部分的方法分离得到)利用荧光染料CFSE(5μM的终浓度)进行1小时的染色处理。
3.2利用1毫升的PBS漂洗3次，将细胞最后用1毫升的PBS进行重悬以备下面注射小鼠使用。
3.3将CFSE染色过的UCMSC分成四组干预ARDS小鼠模型(按照实施例1中1.2部分的方法构建得到)，其中一组为对照组，不做任何处理；一组利用气管插管的方式将5×105个UCMSC细胞滴注到肺泡细胞中；一组利用小鼠尾静脉注射方式将5×105个UCMSC细胞注射到小鼠尾静脉中；最后一组取2.5×105个UCMSC细胞利用尾静脉注射到BALB/c小鼠中，随后接着取2.5×105个UCMSC细胞利用气管插管的方式将细胞滴注到肺泡细胞中。
3.4 24小时后，提取小鼠的肺组织，然后直接放到体式荧光显微镜下，分别观察肺部的UCMSC细胞数目(实验结果详见说明书附图图1)
结果显示：气管插管和静脉注射的联用组中的UCMSC细胞数目，比起单一的插管组以及静脉注射组都要显著增多(如图1)。这说明两种方法联用后，能够产生协同效应，显著的增强了UCMSC的肺部输送效率。
实施例4利用支气管肺泡灌洗术检测肺泡中分泌的炎症因子
4.1实验设置及结论
(1)首先利用LPS通过气管插管的方式诱导BALB/c小鼠，利用小鼠模拟ARDS(急性呼吸窘迫综合征)的疾病模型(具体操作步骤详见实施例1中的1.2部分)。
(2)将上述分离出来的UCMSC用1毫升的PBS重悬后，分成四组干预ARDS小鼠模型，其中一组为对照组，不做UCMSC干预；一组利用气管插管的方式将5×105个UCMSC细胞滴注到肺泡细胞中；一组利用小鼠尾静脉注射方式将5×105个UCMSC细胞注射到小鼠尾静脉中；最后一组取2.5×105个UCMSC细胞利用尾静脉注射到BALB/c小鼠中，随后接着取2.5×105个UCMSC细胞，利用气管插管的方式将细胞滴注到肺泡细胞中(小鼠气管滴注和静脉注射UCMSC的具体方法详见实施例2)。
(3)七天后，利用小鼠肺泡支气管灌洗术(具体方法见下文4.2部分)提取肺泡中的分泌物，利用美国BD Biosciences公司的ELISA试剂盒，检测分泌物中的炎症因子IL1β,IL6以及抗炎因子IL10的表达变化(实验结果详见说明书附图图2A-C)。
由图2可知：比起单一的使用气管插管或者静脉注射方法，这两种方法联用后UCMSC能够显著的抑制致炎因子IL1β和IL6的表达。同时能显著促进抗炎因子IL10的表达。
4.2上述小鼠肺泡支气管灌洗(BAL)术的具体步骤为：
(1)麻醉：腹腔注射致死剂量戊巴比妥(80mg/kg)麻醉小鼠，捏后爪确保无足部反射。
(2)准备：将小鼠以仰卧位置于解剖盘上，固定四肢；在颈部喷洒75％酒精消毒，用解剖刀在颈部近气管处切开，分离组织和肌肉暴露气管准备插管。
(3)气管插管：将手术线穿过气管下方，小心将20G静脉导管插入气管，拔出针管留软管继续留在气管中系上手术线使气管和软管紧密相连。
插管时可用弯头镊穿过气管下部给提供支撑，手术线系紧避免肺泡灌洗过程中由于压力导致漏液。
(4)灌洗及回收：用1ml注射器通过导管向气管内缓慢注射PBS至小鼠肺部，温柔按摩胸腔后再吸出灌洗液，拔掉注射器将回收的肺泡灌洗液(BALF)转移至15ml离心管中；每次灌洗800μl PBS(4℃预冷)，连续灌洗三次，灌洗液回收率为70％-90％。
每个样品提前准备3支800μl PBS置于冰上，抽取的BALF样品均应放置在冰上，所有样品管均应提前标记，避免样品间交叉污染。
(5)保存样品-上清：回收的BALF在4℃，以1500rmp离心5-10min，上清液转移至新微型管中置于-80℃以备后期进行因子检测(Elisa或者qRT-PCR)。
(6)保存样品-细胞：用500μl PBS重悬细胞沉淀，以1500rmp 4℃离心5min；弃上清，加入1ml红细胞裂解液冰上放置5min，1500rmp 4℃离心5min；弃上清，加入500μl PBS重悬细胞沉淀，去10μl细胞悬液进行台盼蓝染色后计数；建议0.5-1×105/载玻片，根据计数结果稀释细胞悬液；安装细胞离心涂片器，从漏斗加入300μl PBS 600rpm离心10min使细胞均匀分布于载玻片标记区域，取出载玻片室温自然晾干2h；10％中性甲醛固定10min以上，随后进行Wright-Geimsa染色；显微镜下利用油浸物镜在100倍下进行细胞分类计数。
红细胞裂解后如仍有红细胞沉淀，可以再次进行红细胞裂解，但不建议超过两次；细胞离心涂片载玻片需提前标记样品号，避免样品间交叉污染；如果细胞量充足也可通过流式检测进行细胞分类计数。
实施例5利用HE染色观察肺泡上皮细胞的增殖情况
5.1实验设置及结论
(1)首先利用LPS通过气管插管的方式诱导BALB/c小鼠(具体方法见2技术背景介绍)，利用小鼠模拟ARDS的疾病模型(按照实施例1中1.2部分的方法构建得到)。
(2)将上述分离出来的UCMSC(按照实施例1中1.1部分的方法分离得到)用1毫升的PBS重悬后，分成四组干预ARDS小鼠模型，其中一组为对照组，不做UCMSC干预；一组利用气管插管的方式将5×105个UCMSC细胞滴注到肺泡细胞中；一组利用小鼠尾静脉注射方式将5×105个UCMSC细胞注射到小鼠尾静脉中；最后一组取2.5×105个UCMSC细胞利用尾静脉注射到BALB/c小鼠中，随后接着取2.5×105个UCMSC细胞，利用气管插管的方式将细胞滴注到肺泡细胞中。
(3)七天后小时后，提取肺组织，利用石蜡切片对肺组织进行HE染色，检测气管插管和静脉注射联用后对肺泡上皮细胞增殖的影响
结果显示：比起单一的使用气管插管或者静脉注射方法，这两种方法联用后UCMSC能够显著促进肺泡上皮细胞的增殖(详见说明书附图图3)。
5.2上述涉及的小鼠的肺组织提取、石蜡切片的制备和HE染色分别按照下述方法进行
5.2.1小鼠的肺组织提取实验：
(1)麻醉：腹腔注射致死剂量戊巴比妥(80mg/kg)麻醉小鼠，捏后爪确保无足部反射。
(2)准备：将小鼠以仰卧位置于解剖盘上，固定四肢，待心跳停止后开始解剖。
(3)肺组织提取：酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，用手术剪将小鼠腹部和胸部皮肤剪开，打开腹腔和胸腔，仔细观察各内脏器官；用23G针头插入气管并缓慢灌注PBS使肺组织充盈后取材，肺组织PBS漂洗后用手术刀分离左、右肺。
(4)保存样品：左肺置于10％中性福尔马林溶液中室温固定，24h后可进行随后石蜡切片制作和切片；右肺用手术剪切成小块置于RNA later中储存于-80℃以备后续分子实验使用。
5.2.2石蜡切片的制备和HE染色技术：
(1)脱水：10％中性福尔马林溶液(30min)→10％中性福尔马林溶液(30min)→水(10min)→70％乙醇(15min)→90％乙醇(15min)→100％乙醇(15min)→100％乙醇(15min)
所有步骤需要将左肺置于包埋盒(tissue cassette)中进行，由于小鼠左肺较小为了防止其脱落，建议用合适大小滤纸包裹后置于包埋盒中。
(2)透明：1:1乙醇+二甲苯(15min)→二甲苯(20min)→二甲苯(20min)
(3)浸蜡：石蜡(20min)→石蜡(20min)→石蜡(20min)→石蜡(20min)
(4)包埋：将带有处理过的组织和包埋盒置于包埋机预热盒中，打开石蜡包埋机预热30min；选择合适大小的包埋模具，移除包埋盒盖子，用镊子将组织预切片位置朝下放置于模具中灌蜡，用镊子按压组织数秒使组织固定，盖上包埋底置于冷盘中待蜡块冷却。
不同样本间注意清洁镊子，避免样品交叉污染；包埋过程中动作迅速，避免石蜡已开始凝固样品仍未固定好影响后期修片和切片。
(5)修块和切片：将蜡块夹紧至切片机上，10μm修块，以暴露完整组织为宜；3μ切片。
切片过程中一定要保证刀片锋利，否则不利于展片并且影响染色后结果分析；切片过程中速度均匀，且应保持切片台干净，否则影响切片质量。
(6)展片与捞片：用毛笔和镊子轻轻夹取切片放置于40℃水浴锅中展片，待切片完全展开后用载玻片捞片，并用镊子摆正切片位置。
捞片过程中一定轻柔，防止两张切片粘黏在一起；保持载玻片清洁，利于切片与载玻片无缝隙粘附。
(7)烘烤与晾干：将带有切片的载玻片置于60℃烤盘中30min，然后置于室温过夜以备后续染色使用。
60℃烘烤利于切片的粘附，保证在后期染色中不脱片。
(8)HE染色：二甲苯(2min×2)→无水乙醇(2min×2)→95％乙醇(2min)→80％乙醇(2min)→70％乙醇(2min)→50％乙醇(2min)→流水(2min)→苏木精(10min)→流水(2min)→0.3％盐酸酒精(1s)→流水(2min)→0.3％氨水(20s)→流水(2min)→95％乙醇(10s)→伊红(15min)→95％乙醇(10s×3)→无水乙醇(2min×3)→二甲苯(2min×3)→室温干燥→DPX封片
为了保证染色效果，每次染色前苏木精和伊红染液需过滤除杂质；如48h内不染色，无水乙醇应转移至封口瓶中，伊红染液转移至缝口瓶并4℃保存。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种提高UCMSC肺部输送效率的方法，其特征在于，采用气管滴注和静脉注射联合输送的方法向肺部输送UCMSC，所述提高UCMSC肺部输送效率的方法用于非疾病的诊断和治疗目的。
2.根据权利要求1所述的提高UCMSC肺部输送效率的方法，其特征在于，所述提高UCMSC肺部输送效率的方法适用于向急性肺损伤模型动物的肺部输送UCMSC。
3.根据权利要求2所述的提高UCMSC肺部输送效率的方法，其特征在于，所述动物为小鼠。
4.根据权利要求2或3所述的提高UCMSC肺部输送效率的方法，其特征在于，所述急性肺损伤模型是采用脂多糖诱导得到的。
5.根据权利要求1所述的提高UCMSC肺部输送效率的方法，其特征在于，所述气管滴注和静脉注射分别输送的UCMSC的用量比为1:1。
6.根据权利要求1所述的提高UCMSC肺部输送效率的方法，其特征在于，所述静脉注射为尾部静脉注射。
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ELIA BARI ET AL: "Mesenchymal stem/stromal cell secretome for lung regeneration: The long way through "pharmaceuticalization" for the best formulation", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *
陈进玲 等: "人脐带间充质干细胞移植治疗急性肺损伤", 《中国组织工程研究》 *

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CN111840577B (zh) 2022-09-13

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