CN111840342B

CN111840342B - 一种总黄酮、三萜类及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法

Info

Publication number: CN111840342B
Application number: CN202010833277.8A
Authority: CN
Inventors: 尹春光; 宋文路; 李明丽; 王晓强; 刘亚文
Original assignee: Jining University
Current assignee: Jining University
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN111840342A

Abstract

本发明涉及一种总黄酮、三萜类及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法。采用正交试验探究萃取时间，压力，温度，夹带剂浓度对总黄酮、三萜类及对超临界残渣黄色素提取率的影响，得到最优工艺条件。超临界萃取总黄酮最优条件为70min，30MPa，85℃，夹带剂浓度90％，总黄酮提取率为12.482％。萃余物中超声波黄色素提取率为5.870％。黄色素最优条件为70min，35MPa，85℃，乙醇浓度90％，黄色素提取率为6.193％，总黄酮提取率12.351％。本发明为生产提供试验数据和理论支持，并达到石榴皮等废弃类物质及超临界萃取残渣的高值化利用。

Description

一种总黄酮、三萜类及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法

技术领域

本发明属于天然色素提取技术领域，具体涉及一种石榴皮总黄酮、三萜类超临界萃取及萃余物高抗氧化活性黄色素的提取方法。

背景技术

石榴皮富含黄酮、多酚、萜类等活性物质，有抗氧化、抗流感病毒、抗菌、抗癌、保护心脑血管、调节内分泌等多种作用，具有较大的药用价值。石榴皮约占石榴重量的1/5，研究表明石榴皮中的主要化学成分是黄酮类物质。植物黄酮的提取来自根、茎、叶、果实、果皮，石榴皮黄酮的提取纯化常见方法有浸提、超声波、微波辅助、酶辅助法等。总三萜的提取在药用植物中研究较多，常使用微波提取、超声波萃取、超临界萃取等方法，石榴皮中未见三萜类提取研究。石榴果皮含有天然黄色素，对石榴皮黄色素提取集中在色素稳定性方面的研究。超临界CO2技术可使活性成分与浸提溶剂充分结合，有利于活性成分的溶出与释放从而提高提取率，可用于黄酮，多酚、萜类物质的提取分离，如CN104861738A公开了一种提取花生壳黄色素的方法，利用微生物发酵花生壳，再利用微波辅助浸提，最后用二氧化碳超临界萃取，提高黄色素纯度以及进一步提高得率。CN103610029A公开了一种毛酸浆果实中黄色素的提取方法，具体在毛酸浆果汁中加入有机溶剂进行超声波辅助萃取、回收浓缩、干燥得黄色素。CN103071117B公开了一种从姜黄中提取姜黄油和姜黄色素的方法，采用超声波技术与亚临界R134a流体技术及超临界CO2流体技术相结合，在三者的协同作用下提取姜黄中提取姜黄油和姜黄色素。与此同时，尽管上述现有技术披露了黄色素的提取工艺，但我们通过多年研究发现，上述提取工艺中获取的终产物黄色素，其抗氧化物活性以及自由基清除能力较低，很多情况不能满足药用标准，同时，仅针对石榴皮中黄色素的提取，现有技术中的工艺均不能达到较高的提取率，无法实现产业化。

综上，在植物萃取残渣中进一步对其活性物质的提取及分析工艺少有研究，超临界CO2技术同步提取石榴皮黄酮、三萜及萃取残渣中高抗氧化物活性的黄色素提取尚未见报道。近几年，使用同一工艺流程同步提取植物中多种活性物质开始收到关注，例如使用溶剂浸提法同步提取总黄酮、总多酚和三萜类物质，可有效提高生产产出及效益。

山东鲁西南地域石榴品种丰富产量大，急需要一种石榴皮的高效综合利用工艺，在提取总黄酮、三萜类物质的同时，进一步萃取残渣中活性物质黄色素，实现石榴皮的高值化利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何高效利用石榴的剩余物石榴皮，根据其物质溶解性、极性的差异，利用超临界充分萃取总黄酮、三萜类物质，进一步超声提取萃余物(超临界萃取残渣)中高抗氧化活性的黄色素，实现石榴皮的高值化利用，本发明首次利用超临界萃取法同步高效率获取石榴皮中总黄酮、三萜类，并获取浓缩在残渣中的黄色素。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种石榴皮总黄酮、三萜类及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，超临界萃取石榴皮，取石榴皮粉末加入超临界萃取仪，乙醇作为夹带剂，设定压力、温度、时间条件超临界萃取，收集提取液，萃余物留下备用；

步骤2，萃余物超声波黄色素提取，将萃余物放入锥形瓶中，按照1：(5-8)料液比加入20％-30％乙醇，在恒温水浴锅中45℃-55℃浸提1h-2h，经频率80KHz-120KHz的超声波处理15min-25min，静置弃去下层沉淀，以4000r/min-4500r/min离心上清液10min-15min，得到含有黄色素的乙醇提取液，移液器取提取液，过大孔树脂柱，蒸馏水清洗树脂柱后用乙醇洗柱，洗脱、吸附得到黄色素提取液，减压抽滤浓缩，减压干燥得黄色素粉末。

进一步的，所述步骤(1)收集的提取液用于进一步提取总黄酮、三萜类，具体为：移液器取提取液超临界萃取后样品液至AB-8大孔树脂柱，使用蒸馏水清洗柱，加入50％乙醇过柱，经0.6-0.8倍柱体积/h洗脱速率、吸附2.5-3h后再经2.5-3倍柱体积洗脱液洗脱，收集；收集液经减压抽滤浓缩至原体积1/5，35-40缩下真空冷冻干燥18-20h，得到总黄酮、三萜类粉末。

进一步的，所述步骤(2)的含有黄色素的乙醇提取液，具体采用移液器取提取液，过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水清洗树脂柱后20％乙醇洗柱，洗脱速率0.8倍柱体积/h、吸附时间3h、洗脱体积为3倍柱体积，得到黄色素提取液，减压抽滤浓缩至原体积1/5，在0.08Mpa下，35℃减压干燥8h，得黄色素粉末。

进一步的，所述步骤(1)石榴皮粉末是采用50℃干燥，粉碎机粉碎，100目过筛得到的，超临界萃取夹带剂浓度85-90％、压力30-35MPa、温度75-85℃、时间70-90min，以2mL/min收集提取液。

进一步的，超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当总黄酮获得最高提取率时，最优条件为70min，30MPa，85℃，夹带剂浓度90％。

进一步的，超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当黄色素获得最高提取率时，最优条件为70min，35MPa，85℃，夹带剂浓度90％。

进一步的，超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当三萜类获得最高提取率时，最优条件为90min，35MPa，75℃，夹带剂浓度90％。

进一步的，本发明还提供了一种石榴皮总黄酮、三萜类超临界及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法所得到的总黄酮提取物，所述总黄酮提取物可用本领域常规方法进一步获取。

进一步的，本发明还提供了一种石榴皮总黄酮、三萜类超临界及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法所得到的三萜类提取物，所述三萜类提取物可用本领域常规方法进一步获取。

进一步的，本发明还提供了一种石榴皮总黄酮、三萜类超临界及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法所得到的黄色素提取物。

本发明的有益技术效果：

1.经过多年的研究，我们意外的发现了在石榴皮中可通过超临界同时萃取出较高含量的总黄酮、三萜类，同时，我们还意外的发现了，通过超临界萃取法获得的萃余物中的黄色素抗氧化活性高，同时超临界萃取获得的总黄酮抗氧化活性也很高，可以利用超临界萃取+超声波提取相结合，前期获取抗氧化活性高的总黄酮，然后获取萃余物中抗氧化活性高的黄色素。并且经过单因素分析，正交设计得出超临界萃取时间、浓度、压力、温度，分别对总黄酮、三萜类提取率及萃余物超声处理黄色素提取得率的影响。

2.在对比了多种提取方法后，本发明首次提出了，在石榴皮中通过超临界萃取法，能同时获得较高的总黄酮、三萜类超临界及黄色素得率。实验得出70min、90％乙醇、30MPa、85℃为最优组合，此时超临界萃取总黄酮率为12.482％±0.00209，三萜类0.780％±0.00376，萃余物中黄色素经超声波提取为5.870％±0.00346。黄色素最优条件为70min，35MPa，85℃，乙醇浓度90％，黄色素提取率为6.193％，总黄酮提取率12.351％。研究可有效提高工业生产的效率和效能，并能充分利用超临界萃取残渣(萃余物)，达到高值化利用石榴皮的目的，同时缓解企业生产废渣污染问题。

3.提取发现，在实验条件优化过程中，调节萃取压力至30MPa、温度升至85℃时，石榴皮粉末在90％乙醇做夹带剂条件下，经CO₂气体超临界萃取作用，总黄酮与三萜类充分释放；此条件下由于黄色素极性及理化性质的不同，黄色素溶出率低，检测量极微，因此在棕黄色萃取残渣(萃余物)中进一步提取，经超声波提取、过柱纯化，减压干燥后，黄色素提取率达到6.193％。可见，本发明中该方法的黄色素得率非常高，显著的高于本领域常规工艺生产的黄色素得率。

4.提取发现使用超临界萃取与超声波结合提取黄色素提取率高于超临界萃取与微波提取结合提取率。经超声波黄色素提取率6.0433％±0.00902，经微波处理后提取率5.7483％±0.00125，黄色素提取率差异极显著(P<0.01)，说明在本发明设定的浓度、时间、温度、压力条件下进行超临界萃取后进行的超声波提取与微波辅助法比较，超声波提取(100KHz，20min)可以使黄色素更充分释放。

5.本发明首次发现，通过对石榴皮进行超临界萃取后，萃余物中黄色素的抗氧化活性和自由基清除能力很高，通过对比实验，分析了不同超声波处理的参数梯度和不同微波辅助参数梯度提取的黄色素的提取率和抗氧化活性，得出了适用于石榴皮高抗氧化活性的参数组合。同时，对超临界萃取液的抗氧化活性及萃余物中的黄色素进行了抗氧化活性检测，经超声波处理的黄色素抗氧化能力显著高于微波处理组(P<0.01)，超声波提取的黄色素DPPH清除能力及ABTS+清除能力分别为(27335.16±8.5501)μmol FERA/g和(4164.10±4.6576)μmol Trolox/g，即经超临界萃取+超声波提取相结合的工艺提取萃余物中的黄色素，具有较强的抗氧化活性。可见，本发明首次发现了石榴皮的提取工艺对黄色素抗氧化活性的影响。

6.本发明特别针对山东鲁西南地域石榴品种产量多，石榴皮废弃物量多的特点，针对这一特殊的地方资源，经过三年不断的尝试和探索，得出了石榴皮综合利用工艺，在提取总黄酮、三萜类物质的同时，进一步萃取残渣中活性物质黄色素，并且研究出总黄酮和黄色素的抗氧化活性均较高的提取步骤，实现石榴皮的高值化利用。同时，经反复验证，该种特定用于石榴皮上同步提取三种物质的方法，能够准确的指导生产实践。

7.通过对本发明的超临界萃取后萃余物超声波提取的黄色素样品的稳定性测定。得出了本发明制备的黄色素在自然光(市内)、不同温度、不同食品添加剂下相对稳定，在酸性条件下稳定，遇到金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+等稳定，综上，本发明的超临界萃取后萃余物超声波提取的黄色素样品的稳定性高，具有产业化价值。

附图说明

图1石榴皮总黄酮、三萜类超临界萃取及萃余物黄色素提取工艺流程图

图2测定总黄酮、三萜类及黄色素含量时的标准曲线

图3超临界萃取时间、浓度、压力、温度对总黄酮、三萜类提取率及萃余物超声处理黄色素提取得率的影响

图4萃余物经超声波提取和微波辅助提取黄色素的提取率对比图

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体的，石榴为鲁西南地区晚秋市售石榴；标准品芦丁、熊果酸为分析纯购自生工生物工程(上海)有限公司；乙醇，乙醚，NaNO₂(5％)，Al(NO₃)₃(10％)，NaOH(1mol/l)，NaCO₃(10％)，香草醛，高氯酸，冰醋酸等，采自天津市凯通化学试剂有限公司、国药集团化学试剂有限公司、莱阳经济技术开发区精细化工、江苏采薇生物科技有限公司，所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

下述实施例中所用的设备SPE-ED SAFE BASIC超临界萃取装置APPLIEDSEPARATIONS；T6紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司；ME54分析天平电子天平上海恒平科技有限公司；KQ-250DE医用数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅邦西仪器科技有限公司；FW135中药粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；YINGTAI INSTRUMEN离心机上海菁华科技仪器有限公司；SCIENTZ-1LS真空浓缩离心仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。

实施例1

一种石榴皮总黄酮、三萜类及高抗氧化活性黄色素的同步提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，超临界萃取石榴皮，取石榴皮粉末加入超临界萃取仪，0.5mL乙醇作为夹带剂，设定压力、温度、时间条件，以2mL/min收集提取液，萃余物留下备用；

步骤2，萃余物超声波黄色素提取，将萃余物放入锥形瓶中，按照1：5料液比加入20％乙醇，在恒温水浴锅中50℃浸提1h，经频率100KHz的超声波处理20min，静置弃去下层沉淀，以4000r/min离心上清液10min，得到含有黄色素的乙醇提取液，采用移液器取提取液2m L，过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水清洗树脂柱后20％乙醇洗柱，洗脱速率0.8倍柱体积/h、吸附时间3h、洗脱体积为3倍柱体积，得到黄色素提取液，减压抽滤浓缩至原体积1/5，在0.08Mpa下，35℃减压干燥8h，得黄色素粉末。

所述步骤(1)收集的提取液用于进一步提取总黄酮、三萜类。具体为：移液器取提取液2m L超临界萃取后样品液至AB-8大孔树脂柱，使用蒸馏水清洗柱，加入50％乙醇过柱，经0.6-0.8倍柱体积/h洗脱速率、吸附2.5-3h后再经2.5-3倍柱体积洗脱液洗脱，收集；收集液经减压抽滤浓缩至原体积1/5，35-40℃下真空冷冻干燥18-20h，得到总黄酮、三萜类粉末。

临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当总黄酮获得最高提取率时，最优条件为70min，30MPa，85℃，夹带剂浓度90％。

实施例2

超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当黄色素获得最高提取率时，最优条件为70min，35MPa，85℃，夹带剂浓度90％。

实施例3

超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当三萜类获得最高提取率时，最优条件为90min，35MPa，75℃，夹带剂浓度90％。

实验一单因素实验

实验方法：考察萃取条件对总黄酮、三萜类提取影响，由于黄色素的提取是利用萃余物(超临界萃取后的残渣)经固定的超声波处理条件提取的，因此黄色素提取率多少是由于超临界萃取条件变化决定了萃余物的提取，因此一并将黄色素提取率与总黄酮、三萜类提取率一起考察，考察超临界萃取条件时间、浓度、压力、温度对超临界萃取总黄酮、三萜类萃取率及萃余物黄色素超声波提取率影响。提取条件为：萃取时间设置为50、70、90、120、150min进行试验，35MPa，75℃，加入0.5mL 75％乙醇溶液作夹带剂，考察时间对取率的影响；固定时间90min，将乙醇浓度设置为75，80，85，90，95％，35MPa，75℃，进行试验，考察浓度对提取率影响；固定时间90min，乙醇浓度90％，将压力设置为20，25，30，35，40MPa，75℃，考察压力对提取率的影响；固定时间90min，乙醇浓度90％，压力30MPa，将温度设置为65，70，75，80，85℃，考察温度对提取率影响。提取率计算：各物质提取率＝n/m×100％。式中，n为总黄酮、三萜类、黄色素质量(mg)，m为石榴粉末质量(mg)。

实验结果：图3可见，随着萃取时间变化，总黄酮、三萜类提取率呈先上升后降低曲线变化，总黄酮、三萜类90min时提取率达到最大，分别是5.794％±0.00115，0.434％±0.00173。检测发现超临界萃取黄色素萃取极微量，因此将萃余物进行超声波辅助处理提取到较为丰富的黄色素。在经超临界萃取90min后，超声波处理萃余物，黄色素提取率达到5.885％±0.00240。

经不同浓度乙醇做夹带剂提取率见图3，浓度90％时总黄酮提取率最高8.691％±0.00289，85％时三萜类提取率最高0.387％±0.00115，90％时次之0.379％±0.00088。黄酮类物质通常选用乙醇做夹带剂，合适的水：乙醇比例可获得较高提取率。乙醇浓度低时(<50％)，总黄酮、三萜类提取不充分，浓度过高时，会使分子间氢键破坏，降低物质的溶解度。进一步利用超声波提取萃余物中黄色素，在90％浓度下获得的萃余物经超声波提取后黄色素得率达到6.044％±0.00462。利用Duncan法分析，不同浓度下总黄酮、三萜类提取率差异显著，此时萃余物中黄色素提取率也差异显著(P<0.05)；综合考虑企业生产效益，本发明是以超临界萃取为基本技术，石榴皮中总黄酮获得含量丰富，更适用以总黄酮提取作为生产条件主要依据，同时获取三萜类及萃余物中的黄色素，因此选取90％乙醇为最适浓度。

经不同压力处理，随压力变化曲线(图3)变化趋势明显，30MPa时总黄酮提取率最高达到8.126％±0，00058，三萜类提取率在35MPa最高0.978％±0.00145，30MPa时提取率次之0.971％±0.00231。在25-30MPa压力下，夹带剂与黄酮类溶质分子作用活跃，黄酮溶解度更高，萃取率更高。但是当压力过大时，分子之间的间距变化，氢键被破坏，导致溶解性下降。30MPa时萃余物经超声波处理提取黄色素也达到最高2.991％±0.00346。利用Duncan法分析，不同压力下，总黄酮、三萜类提取率差异显著(P<0.05)，此时萃余物中黄色素提取率差异显著(P<0.05)。选择超临界萃取过程在30MPa压力条件下获取总黄酮、三萜类物质，此时萃余物中黄色素提取率也达到最大。

温度对总黄酮、三萜类及萃余物中黄色素提取率影响根据图3，随温度从低到高变化各物质提取率从低到高然后降低，80℃时黄酮提取率最高11.376％±0.00289；75℃三萜类提取率最高1.020±0.00231；萃取过程中温度升高能加速分子运动和相互作用，溶解度升高。温度过低时，总黄酮、三萜类分子与溶液分子间作用不充分，溶出少。当提取温度升高为80℃时，提取率达到最高。此后温度继续上升，会破坏分子间作用力，溶出率反而下降。75℃时萃余物中黄色素经超声波处理提取率最高6.0433±0.00521，80℃时次之5.864±0.00577。利用Duncan法分析，不同温度下，总黄酮、三萜类提取率差异显著(P<0.05)，此时萃余物中黄色素提取率差异显著(P<0.05)。综合考虑总黄酮提取率及获取萃余物活性物质黄色素，选取80℃条件下同步获取总黄酮、三萜类物质，此时萃余物中黄色素提取率虽未达到最高，其得率仅次于75℃条件。

实验二正交实验

实验方法：以提取条件为变量，以总黄酮、三萜类及黄色素提取率为指标，选择最优组合，L₉(3⁴)正交表(表1)。

表1正交试验设计

表2正交试验结果

表3方差分析

Ⅰ：总黄酮；Ⅱ：三萜类；Ⅲ：黄色素

实验结果：

从表2表3可以看出，总黄酮最优方案为A₁ B₂ C₂ D₃即70min、90％乙醇、30MPa、85℃，各因素影响次序为B(浓度)>C(压力)>D(温度)>A(时间)。三萜类主次顺序：B(浓度)>A(时间)>D(温度)>C(压力)，最优水平A₂B₂C₃D₁，即提取条件为90min、90％、35MPa、75℃，总黄酮提取率10.654％，三萜提取率1.013％，此时萃余物中黄色素超声波提取率5.434％。

根据正交设计，同时考察了超临界萃取条件对萃余物中黄色素超声波提取的影响，最优组合为A₁ B₂ C₃ D₃，即提取条件为70min、90％乙醇、35MPa、85℃，各因素的影响次序为D(温度)>B(浓度)>C(压强)>A(时间)。此时，需要对总黄酮及黄色素提取进行验证试验，由最优组合条件可知，总黄酮提取最优条件与萃余物黄色素提取最优条件均为70min、90％乙醇、85℃，只有压力30MPa和35MPa不一致。

实验三验证实验

实验方法：本实验主要验证了70min、90％乙醇、30MPa、85℃，以及70min、90％乙醇、35MPa、85℃这两组最优组合的萃取结果(见表4)，为进一步生产实践做指导依据。

表4验证试验结果

Ⅰ总黄酮超临界提取最优组合验证；Ⅱ萃余物黄色素提取验证

实验结果：根据表4，组Ⅰ(70min、90％乙醇、30MPa、85℃)条件下，超临界萃取总黄酮率为12.482％±0.00209，三萜类0.780％±0.00376，此时萃余物中黄色素经超声波提取为5.870％±0.00346。组Ⅱ(70min、90％乙醇、35MPa、85℃)条件下总黄酮、三萜类及黄色素提取率12.351±0.00218，0.575％±0.00346，6.193％±0.00636与组I提取率差异不显著(P>0.05)。

以企业生产实际为出发点，可以选取2个组合中的一个，考虑到动力学及热力学因素及生产安全，建议选压力较小的30MPa，即组I组合进行超临界萃取，70min，90％乙醇，30MPa，85℃时，总黄酮萃取率为12.482％，同步获取三萜类萃取率为0.780％，萃余物中黄色素超声波提取率为5.870％。研究可有效提高工业生产的效率和效能，并能充分利用超临界萃取残渣(萃余物)，达到高值化利用石榴皮的目的，同时缓解企业生产废渣污染问题。

实验四萃余物经超声波提取和微波辅助提取黄色素的提取率对比实验

实验方法：将萃余物放入锥形瓶中，按照1：5料液比加入20％乙醇，在恒温水浴锅中50℃浸提1h，经超声波频率60，80,100,120KHz，处理10,15,20，30min，静置30min弃去下层沉淀，以4000r/min离心上清液10min，得到含有黄色素的乙醇提取液，将萃余物放入锥形瓶中，按照1：5料液比加入20％乙醇，在恒温水浴锅中50℃浸提1h。

其中的微波辅助处理：微波辐射功率250，300，350，400w条件下处理50,70,90,120s，黄色素释放，静置30min弃沉淀，4000r/min上清液离心10min，得到含有黄色素的乙醇提取液。

超声波和微波处理后的上述2种提取液，移液器取提取液2m L，过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水清洗树脂柱后20％乙醇洗柱，洗脱速率0.8倍柱体积/h、吸附时间3h、洗脱体积为3倍柱体积，得到黄色素提取液，减压抽滤浓缩至原体积1/5，在0.08Mpa下，35℃减压干燥8h，得黄色素粉末。

实验结果：图4可见，超临界萃取+超声波提取黄色素，与超临界萃取+微波辅助提取黄色素相比较，萃余物中的黄色素后经超声波提取法提取率均高于微波辅助法，其中不同温度、压力条件下差异极显著(P<0.01)；不同夹带剂浓度条件下，除了95％乙醇条件均差异极显著；不同时间条件下，除50min作用时间差异显著(P<0.05)外，其余处理时间均差异极显著(P<0.01)。单因素筛选的90％乙醇，90min，30Mpa，75℃，条件下经超声波黄色素提取率6.0433±0.00902，微波5.7483±0.00125，2种方法提取率差异极显著(P<0.01)，说明在本发明设定的浓度、时间、温度、压力条件下进行超临界萃取+超声波提取黄色素，与超临界萃取+微波辅助提取黄色素相比较，超临界萃取+超声波提取黄色素的效果更优，即超临界萃取+超声辅助处理两者搭配具有协同增效的作用，通过超声波提取(100KHz，20min)可以使黄色素更充分释放。

表5.超声波处理黄色素提取率(％)

表6.微波处理黄色素提取率(％)

超声波提取萃余物中黄色素100KHZ 20min时提取率最高6.0433％，各组均差异显著(P<0.05)，波提取萃余物中黄色素350w,70s时提取率最高5.7483％。70s，350w条件下与其它各组差异显著(P<0.05)。

实验五超临界萃取液的抗氧化活性及萃余物中的黄色素进行了抗氧化活性比较实验

实验方法：实验条件同实验四，抗氧化活性检测：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除自由基能力：取最优条件下获取的超临界萃取液0.5ml，加入DPPH甲醇溶液，定容。以总黄酮提取率为依据，换算为10μg/mL样品溶液备用；根据实验四的试验方法及条件获得黄色素粉末，精确称取1mg，经甲醇溶解，定容，10μg/mL样品溶液备用。将上述样品液与DPPH甲醇液以1:4体积比混合，充分混匀，避光室温静置后分光光度计517nm测定。提取液中活性物质质量换算公式：m＝(V/M)×N×A，其中m：活性物质质量mg，V：萃取液体积(mL)，M：石榴皮粉末质量(mg)，N，萃取物稀释倍数，A活性物质提取率(％)。以阿魏酸(FerulicAcid，FERA)浓度(μmol/L)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程：y＝0.9375x+29.081R²＝0.9954。以DPPH溶液自身吸光值与样品溶液吸光值之差与DPPH溶液自身吸光值比值表示，DPPH清除率/％＝[(A_DPPH-A_样品)/A _DPPH]×100。FERA微摩尔数相当于每克样品中DPPH自由基清除能力(μmol FERA/g)。

2，2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS⁺)总抗氧化能力：参照上述样品处理方法，准备黄色素样品液。取K₂S₂O₈与ABTS以体积比1:1混合，4℃过夜经充分混合得工作液。分别取样品液各0.1mL，加入工作液，室温放置5min，734nm波长下测吸光度。以Trolox浓度(μmol/L)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程：y＝5.199x+4.0056，R²＝0.9986。总抗氧化性以自由基清除能力表示，以ABTS溶液自身吸光值与样品溶液吸光值之差与ABTS溶液自身吸光值比值表示，ABTS⁺·清除率％＝[(A_ABTS-A_样品)/A _ABTS]×100。Trolox微摩尔数为每克样品中ABTS⁺清除能力(μmol Trolox/g)。

实验结果：对超临界萃取液的抗氧化活性及萃余物中提取的的黄色素进行了抗氧化活性检测，经超临界萃取后提取液及萃余物超声波处理及微波处理后黄色素抗氧化活性见表7，经超声波处理(100KHZ 20min)的黄色素抗氧化能力显著高于微波处理组(350w,70s)(P<0.01)，超声波提取的黄色素DPPH清除能力及ABTS+清除能力分别为27335.16和4164.106显著高于微波处理处理组，可见经超临界萃取后的萃余物提取黄色素具有较强的抗氧化活性。

表7抗氧化能力测定

**超声波和微波不同处理组提取的黄色素DPPH清除能力及ABTS⁺清除能力差异极显著(P<0.01)

表8.超声波提取黄色素抗氧化活性(DPPH)

100KHZ 20min时超声波提取萃余物中黄色素，抗氧化能力最强，DPPH清除力(μmolFERA/g)达到27335.16。100KHZ 20min条件下抗氧化活性与其它各种差异显著(P<0.05)。

表9.微波提取黄色素抗氧化活性(DPPH)

这组检测中350w,70S条件下微波提取萃余物中黄色素抗氧化能力最强，此时DPPH清除力(μmol FERA/g)达到24426.65，与其它各组差异不显著(P>0.05)。

由表8，表9数据可见，2种处理方法提取的黄色素，DPPH检测抗氧化能力超声波提取的黄色素抗氧化能力高于微波提取。尤其是100KHZ 20min超声波提取条件下，DPPH清除力(μmol Trolox/g)达到27335.16，显著高于350w,70S微波条件下提取黄色素的抗氧化活性(P<0.05)。

表10.超声波提取黄色素抗氧化活性(ABTS⁺)

100KHZ 20min超声波提取条件下，萃余物中黄色素抗氧化能力最强，ABTS+清除力(μmol Trolox/g)达到4164.10，抗氧化活性与其它各组差异显著(P<0.05)

表11.微波提取黄色素抗氧化活性(ABTS⁺)

350w,70S微波提取条件下，萃余物中黄色素抗氧化能力最强，ABTS+清除力(μmolTrolox/g)达到4051.83,清除率与其它各组差异显著(P<0.05)

由表10，表11数据可见，2种方法处理提取的黄色素，ABTS+检测抗氧化能力超声波提取的黄色素抗氧化能力高于微波提取,尤其是100KHZ 20min超声波提取条件下，ABTS+清除力(μmol Trolox/g)达到4164.10，显著高于350w,70S微波条件下提取黄色素的抗氧化活性(P<0.05)。

实验六对超临界萃取后萃余物超声波提取的黄色素稳定性检测

实验方法：取超临界萃取后萃余物超声波提取的黄色素样品，配置0.1mg/mL色素液，通过测定372nm下吸光度及黄色素溶液颜色变化考察光照、温度、PH、金属离子、食品添加剂这些因子对本发明的超临界萃取后萃余物超声波提取的黄色素样品的稳定性测定。

实验结果：通过光照、温度、PH、金属离子、食品添加剂对本发明超临界萃取后萃余物超声波提取的黄色素稳定性检测，黄色素在自然光(市内)、不同温度、不同食品添加剂下相对稳定，在酸性条件下稳定，遇到金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+等稳定，金属离子Fe3+，Al3+会影响黄色素色泽，与阿布来提(2009)、张润光(2008)、胡伟华(2001)等研究结果一致。

综上，本发明的超临界萃取后萃余物超声波提取的黄色素样品的稳定性高，具有产业化价值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.石榴皮总黄酮、三萜类超临界萃取及萃余物黄色素提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2，萃余物超声波黄色素提取，将萃余物放入锥形瓶中，按照1：(5-8)料液比加入20%-30%乙醇，在恒温水浴锅中45℃-55℃浸提1h-2 h，经频率80KHz-120KHz的超声波处理15min-25min，静置弃去下层沉淀，以4000 r/ min -4500 r/ min离心上清液10min -15min，得到含有黄色素的乙醇提取液，移液器取提取液，过大孔树脂柱，蒸馏水清洗树脂柱后用乙醇洗柱，洗脱、吸附得到黄色素提取液，减压抽滤浓缩，减压干燥得黄色素粉末；

所述步骤（1）石榴皮粉末是采用50℃干燥，粉碎机粉碎，100目过筛得到的，超临界萃取夹带剂浓度85-90%、压力30-35 MPa、温度75-85℃、时间70-90 min，以2 mL/ min收集提取液；

所述步骤（1）收集的提取液用于进一步提取总黄酮、三萜类，具体为：移液器取提取液超临界萃取后样品液至AB-8大孔树脂柱，使用蒸馏水清洗柱，加入50%乙醇过柱，经0.6-0.8倍柱体积/h洗脱速率、吸附2.5-3 h后再经2.5-3倍柱体积洗脱液洗脱，收集；收集液经减压抽滤浓缩至原体积1/5，35-40缩下真空冷冻干燥18-20h，得到总黄酮、三萜类粉末；

所述步骤（2）的含有黄色素的乙醇提取液，具体采用移液器取提取液，过AB-8大孔树脂柱，蒸馏水清洗树脂柱后20%乙醇洗柱，洗脱速率0.8倍柱体积/h、吸附时间3 h、洗脱体积为3倍柱体积，得到黄色素提取液，减压抽滤浓缩至原体积1/5，在0.08Mpa下，35℃减压干燥8h，得黄色素粉末。

2.如权利要求1的提取方法，其特征在于，超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当总黄酮获得最高提取率时，最优条件为70 min，30 MPa，85 ℃，夹带剂浓度90%。

3.如权利要求1的提取方法，其特征在于，超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当黄色素获得最高提取率时，最优条件为70 min，35 MPa，85 ℃，夹带剂浓度90%。

4.如权利要求1的提取方法，其特征在于，超临界同步萃取总黄酮、三萜类和黄色素，其中当三萜类获得最高提取率时，最优条件为90 min，35 MPa，75 ℃，夹带剂浓度90%。