CN111838441B - 一种用于减少仔猪腹泻的生物制剂 - Google Patents
一种用于减少仔猪腹泻的生物制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的在于提供一种用于减少仔猪腹泻的生物制剂,属于畜牧生物制剂技术领域。本发明所提供的生物制剂是由虎耳草多糖,延胡索多糖和浮萍多糖所组成的复合多糖。本发明所提供的复合制剂对于大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有较好的抑制效果;其次,本发明所提供的生物制剂能够有效的促进猪小肠上皮细胞的增殖和猪小肠上皮细胞连接蛋白的表达;除此之外,本发明所提供的生物制剂可以有效的减少断奶仔猪的腹泻。
Description
技术领域
本发明属于畜牧生物制剂技术领域,尤其涉及一种用于减少仔猪腹泻的生物制剂。
背景技术
在现代集约化养猪环境中,为了最大程度地发挥母猪的繁殖性能和减少疾病向仔猪垂直传播的可能性,普遍采用仔猪早期断奶技术。然而,由于仔猪需要从母乳中获得大量抗体及易消化的乳糖和乳蛋白,且仔猪的消化系统发育尚不成熟,内分泌系统调控机制还未完全建立,免疫机能低下。因此,仔猪断奶过程中因饲养条件的改变,会产生一系列的生理变化,例如消化功能紊乱,腹泻,生长缓慢等等。断奶应激会导致仔猪肠道形态结构发生改变,表现为肠道重量降低,肠绒毛变短,隐窝增生,肠道紧密连接功能受损。由于仔猪的肠道紧密连接受损,因此仔猪腹泻明显变多。
目前,养猪场通常在饲料中添加抗生素来控制仔猪腹泻。但是,长期的使用抗生素会导致细菌耐药性增强,动物免疫力下降,并且会影响动物肠道内正常的菌群功能。除此之外,抗生素的滥用也会对人类的健康产生潜在的威胁。因此,寻找新的生物制剂来替代抗生素治疗仔猪腹泻是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效降低仔猪腹泻的生物制剂,从而减少抗生素的使用。
为实现上述目的,本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了一种用于减少仔猪腹泻的生物制剂,所述生物制剂为虎耳草多糖,延胡索多糖和浮萍多糖组成的复合多糖。
优选地,所述复合多糖的制备方法如下:
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍块茎按照2-3:1-3:3-5质量比混匀并粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖。
此外,本发明提供了复合多糖在制备用于减少仔猪腹泻生物制剂中的应用,其特征在于,所述复合多糖包括虎耳草多糖,延胡索多糖和浮萍多糖。
优选地,所述复合多糖的制备方法如下:
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:3:3质量比混匀并粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖。
此外,本发明提供了复合多糖在制备抑制大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的生物制剂中的应用,所述复合多糖的制备方法如下:
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:3:3质量比混匀并粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖。
此外,本发明提供了复合多糖在制备促进猪小肠上皮细胞增殖促进剂中的应用,所述复合多糖的制备方法如下:
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:3:3质量比混匀并粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖。
除此之外,本发明提供了复合多糖在制备促进猪小肠上皮细胞连接蛋白表达促进剂中的应用,所述连接蛋白为Occludin和ZO-1 ;所述复合多糖的制备方法如下:
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:3:3质量比混匀并粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖。
本发明的有益效果在于:
本发明由虎耳草,延胡索块茎和浮萍制备出一种复合多糖,本发明所制备的复合多糖能够有效的抑制大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌;其次,本发明所制备的复合多糖能够有效的促进小肠上皮细胞的增殖并且促进小肠上皮细胞连接蛋白的表达来促进猪小肠的发育和小肠的屏蔽功能,除此之外,使用添加有本发明复合多糖的饲料饲喂断奶仔猪后,能够有效的降低仔猪的腹泻率且效果优于抗生素。因此,本发明所制备的复合多糖可以用于制备减少仔猪腹泻的生物制剂或是用于制备减少仔猪腹泻的饲料。
附图说明
图1 复合多糖对于猪小肠上皮细胞细胞增殖的影响
图2 复合多糖对于猪小肠上皮细胞连接蛋白Occludin和ZO-1蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
实施例1
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照3:1:3混匀粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖A。
实施例2
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:3:3混匀粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖B。
实施例3
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:1:5混匀粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖C。
实施例4
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:2:3混匀粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(2)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(3)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(4)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖D。
实施例5
检测复合多糖对于大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,沙门氏菌的抑制效果
(1)将活化的大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的菌种用无菌生理盐水稀释,配置成106CFU/ml的菌液;
(2)将高温高压灭菌后的牛肉膏蛋白胨倒入无菌的平板中;
(3)将灭菌后的滤纸放入到50mg/ml的复合多糖液中,浸泡20min;
(4)将50μL的滤液均匀的涂布在无菌平板上,之后,将浸泡后的滤纸平铺与平板上,每组设置3个重复;
(5)将平板放入37℃培养箱中,培养16h后,使用游标卡尺计算抑菌圈直径平均值和标准差。
实施例6
检测复合多糖B是否能够促进猪小肠上皮细胞的增殖
(1)将IPEC细胞接种于96孔板中,每孔细胞10000个,每孔培养基100μL,置于细胞培养箱中;
(2)细胞贴壁后,对照组不作处理,实验组加入50mg/ml复合多糖B,每组设置三个复孔;
(3)放入培养箱中,培养48h之后,使用CCK-8检测OD值。
实验结果如图1所示,从图中我们可以看出,培养48h后,对照组的OD值为0.461±0.019,50mg/ml复合多糖B组的OD值为0.611±0.021,二者之间的差异具有统计学意义。上述结果,说明复合多糖B能够促进小肠上皮细胞的增殖。
实施例7
检测复合多糖B是否能够促进猪小肠上皮细胞连接蛋白occludin和ZO-1蛋白的表达
1. 实验处理
(1)将IPEC-J2细胞接种于6孔板中,对照组不做处理,实验组加入含50mg/ml的复合多糖B。
(2)放入细胞培养箱中,培养48h后,提取蛋白,进行Western Blot检测。
2.蛋白提取
(1)弃去培养基,加入1ml PBS清洗细胞,加入100μl细胞裂解液,使用细胞刮刀将细胞刮下,使用移液枪将裂解液转移到EP管;
(2)冰上裂解30min,置于离心机中,4℃,12000rpm/min,离心15min;
(3)离心结束后,小心吸取上清,得到蛋白样品;
(4)使用BCA法测量蛋白浓度,并调整蛋白样品浓度为2μg/μl。
3.蛋白电泳
(1)配制12%分离胶,5%浓缩胶,每孔加入10μl蛋白样品和蛋白Marker;
(2)浓缩胶恒压90V,分离胶恒压120V,当溴酚蓝跑至凝胶的底部时停止电泳;
(3)小心取出凝胶,按照海绵垫,三层滤纸,PAGE胶,PVDF膜,三层滤纸,海绵垫的模式安装转印夹,将转印夹放入电转槽中,室温电转1.5小时;
(4)电转结束后,将PVDF膜取出,放入5%脱脂奶粉中,室温摇床封闭1h。
(5)封闭完成后,使用TBST洗膜3次,每次10分钟;
(6)根据相应蛋白条带大小,裁切PVDF膜,孵育Occludin,ZO-1和β-actin一抗,4℃,孵育过夜;
(7)一抗孵育结束后,使用TBST洗膜3次,每次10分钟,孵育相应的2抗,室温孵育1h;
(8)二抗孵育结束后,使用TBST洗膜3次,进行显影曝光。
实验结果如图2所示,从图中可以看出,加入复合多糖B后可以有效的促进连接蛋白ZO-1和occludin蛋白的表达。上述结果说明复合多糖B能够起到增加猪小肠屏蔽功能的作用。
实施例8
仔猪腹泻率检测
(1)将54只21±2日龄的三元断奶仔猪分为3组,每组6只,每组设置3个重复;对照组饲喂含有0.04%金霉素的基础配方,处理组1饲喂去除抗生素的基础配方,处理组2饲喂去除抗生素添加有0.5%复合多糖B的基础饲料;
(2)粪便评分标准
1分:软粪、能成型;2分:稠状、不成型、粪水为分离;3分:液状、不成形、粪水有分离现象。
(3)试验期内每天9:00和15:00分别观察仔猪粪便,当粪便评分为2或以上时认为仔猪发生腹泻,实验进行14天,计算整体试验期仔猪的腹泻率和腹泻指数;
腹泻率(%)=试验期内每组仔猪腹泻头次/(试验天数×每组仔猪头数)×100%。
实验结果
表1 断奶仔猪腹泻率
项目 | 对照组 | 处理组1 | 处理组2 |
腹泻率 | 9.05±0.12 | 5.88±0.36 | 4.65±0.20 |
从实验结果可以看出,相较于对照组,使用添加复合多糖B的基础饲料饲喂仔猪后,能够显著的降低仔猪的腹泻率(P<0.001,差异具有统计学意义),且效果由于处理组1(P<0.05,差异具有统计学意义)。上述结果说明,使用含有复合多糖B的饲料饲喂断奶仔猪后能够有效的降低断奶仔猪的腹泻率,且效果优于抗生素,因此可将复合多糖B用于饲料制备来减少仔猪腹泻和抗生素的使用。
综上所述,本发明所制备的复合多糖能够有效的抑制大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌;而且,本发明所制备的复合多糖能够促进猪小肠上皮细胞增殖和小肠上皮细胞连接蛋白的表达,从而可以促进仔猪小肠的发育和肠道的屏蔽功能。除此之外,通过抑菌和促进仔猪肠道发育和增强肠道屏蔽的功能,本发明所制备的复合多糖有效的降低了断奶仔猪的腹泻率。
Claims (1)
1.复合多糖在制备同时具有抑菌和促进猪小肠发育的生物制剂中的应用,其特征在于,所述复合多糖包括虎耳草多糖,延胡索多糖和浮萍多糖;
所述复合多糖的制备方法如下:
(1)将虎耳草,延胡索块茎和浮萍按照2:3:3质量比混匀并粉碎,得到复合植物粉;
(2)按照料液比1:15向粉碎后的复合植物粉中加入去离子水,60℃,浸泡3h;
(3)离心,收集上清,减压蒸馏至原体积的10%;
(4)加入85%的乙醇,醇沉24h;
(5)加入Sevage试剂,离心,去除蛋白,重复5次,得到复合多糖;
所述抑菌为抑制大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,沙门氏菌;
所述促进猪小肠发育为促进猪小肠上皮细胞增殖和促进猪小肠上皮细胞连接蛋白表达。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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